JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

הפונקציות של חלבוני משפחת העל של דינמין תלויות בשינויים קונפורמטיביים יחד עם הידרוליזה של GTP. מערכת מתוארת באמצעות טכניקת FRET חד-מולקולה (smFRET) כדי לנטר את הדינמיקה הקונפורמטיבית של GTPase atlastin דמוי דינמין במצבי עומס נוקלאוטידים שונים.

Abstract

סיבוב הגוף הקשיח של התחום האמצעי התלת-סלילי (3HB) ביחס לתחום GTPase של חלבון דמוי דינמין אטלסטין (ATL) הוא מניע מכריע לאיחוי ממברנה הומוטיפית בתוך הרטיקולום האנדופלזמי (ER). שיבושים בתהליך זה נקשרו לשיתוק ספסטי תורשתי (HSP), הפרעה ניוונית. מחקרים מבניים וביוכימיים מצביעים על כך שהשינויים הקונפורמטיביים ב-ATL קשורים להידרוליזה של GTP, אך הדמיה בזמן אמת של דינמיקת קונפורמציה זו במהלך מחזור ההידרוליזה של GTP נותרה מאתגרת. כדי להבין טוב יותר את המנגנונים המכניים מאחורי פונקציית ATL, נעשה שימוש בהעברת אנרגיית תהודה של פורסטר (smFRET) של מולקולה אחת. שלוש אסטרטגיות ספציפיות הופעלו כדי לשתק את האזור הציטוזולי N-terminal של ATL1 אנושי (ATL1cyto) בתא מיקרופלואידי מצופה סטרפטווידין, מה שמקל על יישום הדמיית smFRET תוך מולקולרית ובין-מולקולרית. זה איפשר ניטור מדויק של קונפורמציות חלבון במצבי העמסת נוקלאוטידים שונים, וסיפק תובנות ישירות לגבי התנהגויות מולקולריות אינדיבידואליות. ניתן ליישם שיטה זו גם לחקר חלבונים מכניים אחרים.

Introduction

בתאים אוקריוטיים, חלבוני משפחת העל של דינמין מתווכים את העיצוב מחדש של ממברנות ביולוגיות, כולל צינורות ממברנה, ביקוע ואיחוי 1,2,3. מוטציות בחלבונים אלה מובילות למגוון מחלות אנושיות, כגון מחלות ניווניות. חברי משפחת העל של דינמין מכילים בדרך כלל תחום GTPase, תחום אמצעי המורכב מחבילות סליליות, מוטיב לקשירת ממברנה ותחום אפקטור GTPase (GED). GTPase דמוי דינמין כזה הוא אטלסטין (ATL), המזרז היתוך ממברנה הומוטיפי של הרטיקולום האנדופלזמי (ER) ליצירת רשת 4,5,6,7,8,9,10. ישנם שלושה ATLs (ATL1-3) ביונקים. מולקולת ה-ATL מורכבת מאזור ציטוזולי N-terminal (ציטו ATL), כולל תחום GTPase ותחום אמצעי תלת-סלילי (3HB), ואחריו שני אזורים טרנסממברניים, אך חסר את ה-GED האופייני. לחלופין, ATL מכיל זנב C-terminal הממלא תפקיד מכריע באיחוי ממברנה 11,12,13.

דווח כי היתוך ממברנה יעיל מסתמך על סידור מחדש של תחום תלוי הידרוליזה GTP ב-ATLcyto 14,15,16,17,18,19,20. עם זאת, בהשוואה לקומפלקס SNARE, המשתמש באנרגיה מתקפלת משינויים קונפורמטיביים כדי להניע היתוך ממברנה הטרוטיפי21, תהליך היתוך הממברנה ההומוטיפי המתווך על ידי ATL וחלבונים דמויי דינמין אחרים ספציפיים להיתוך22 נותר חמקמק. שלושה מבני גביש שלציטו ATL1 אנושי נקבעו בתנאי העמסת נוקלאוטידים שונים 14,15,16,23. במבנים, שני ה-3HBs בדימר מצביעים לכיוונים שונים, אך עדיין חסר מודל מקיף המסביר כיצד הדינמיקה הקונפורמטיבית שלATL cyto ופעילות ה-GTPase שלו מחוברות.

במודל הקודם, מולקולות ה-ATL המונומריות יוצרות דימרים על פני ממברנות שונות באופן תלוי GTP כדי להניע היתוך ממברנה. כאן, מתוארות שלוש אסטרטגיות ליישום העברת אנרגיית תהודה של Förster של מולקולה אחת (smFRET) כדי לצפות ישירות ולזהות במדויק את ההתנהגות של מולקולותATL1 cyto בודדות. smFRET היא טכניקה רבת עוצמה המשמשת באופן נרחב לחקירת דינמיקה קונפורמציה ואינטראקציות של ביומולקולות בודדות בזמן אמת, כגון הפעלת β-arrestin בתיווך GPCR24, שיפוץ כרומטין על ידי Snf225, וסידורים מחדש של תחום של חלבון דמוי דינמין MxA יחד עם מחזורי הידרוליזה GTP26. מכיוון ש- smFRET יכול לזהות ביעילות רק שינויים במרחק מ ~ 3 ננומטר ל ~ 8 ננומטר, נדרשים ניסויי smFRET בין-מולקולריים ותוך מולקולריים כדי לנתח באופן מקיף את הקונפורמציות של ATL1cyto עבור כל מצב טעינת נוקלאוטיד. יצרנו שלושה מבנים שלATL1 cyto עם כל הציסטאין המקורי שהוחלף באלנינים ו-K400 (ATL1cyto-K) או זוג T51/K400 (ATL1cyto-TK) שעבר מוטציה לציסטאין לתיוג פלואורופור. האסטרטגיות לקיבוע הדימר או המונומר ATL1cyto בתא מיקרופלואידית מצופה סטרפטווידין (איור 1A) עבור ניסויי smFRET בין-מולקולריים או תוך-מולקולריים מוצגות באיור 1B-D. שיטה זו מספקת פרטים נוספים על הדינמיקה הקונפורמציונלית של חלבונים דמויי דינמין בכל שלב של הידרוליזה GTP27.

Protocol

פרטי הריאגנטים והציוד המשמשים במחקר זה מפורטים בטבלת החומרים.

1. הכנת כיסוי שונה לתא אימוביליזציה של חלבון

  1. הכנה
    1. הכן 50 מ"ל תמיסת פיראנה (מורכבת מחומצה גופרתית מרוכזת ומי חמצן ביחס של 3:1) על ידי הוספה איטית של מי חמצן לחומצה גופרתית מרוכזת כדי למנוע טמפרטורות מופרזות. הניחו אותו בזהירות במכסה אדים.
    2. הכן תמיסת נתרן אתוקסיד. ממיסים 2 גרם NaOH ב-15 מ"ל של ddH2O, מוסיפים 35 מ"ל אתנול מוחלט ומערבבים לחלוטין. השאירו בטמפרטורת החדר.
    3. הכן תמיסת מלח גבוהה (0.1 מ 'של NaHCO3 ו- 0.6 מ' של K2SO4). ממיסים לחלוטין ומכינים 500 מיקרוליטר לשפופרת. יש לאחסן בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס.
    4. יש להוסיף SVA-mPEG ו-SVA-mPEG-ביוטין לכ-30 מ"ג לשפופרת ו-3 מ"ג לשפופרת. יש לאחסן בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס.
    5. התאם אישית שקופיות מיקרוסקופ (75 מ"מ × 26 מ"מ × 1 מ"מ) עם 6 זוגות חורים בקוטר 1.2 מ"מ.
  2. ניקוי פני הכיסוי
    1. השתמש בפינצטה כדי להרים שמונה כיסויים ולהניח אותם בצנצנת מכתים. הוסף אצטון (~50 מ"ל) כדי לכסות את החלקות הכיסוי, הנח את צנצנת הצביעה בחומר ניקוי קולי למשך 30 דקות, ולאחר מכן שטוף את הכיסויים שלוש פעמים עם ddH2O.
    2. שטפו את הכיסויים במתנול כמו בשלב 1.2.1.
    3. הוסיפו את תמיסת הפיראנה (שלב 1.1.1) לצנצנת הצביעה וחממו אותה בקומקום אמבט מים בטמפרטורה של 95 מעלות צלזיוס למשך שעתיים. לאחר שצנצנת הצביעה התקררה לטמפרטורת החדר, יש לשטוף את הכיסויים לפחות שש פעמים עם ddH2O.
    4. הוסף את תמיסת הנתרן אתוקסיד לצנצנת הצביעה, הניח אותה בחומר ניקוי קולי למשך 15 דקות ולאחר מכן שטוף שלוש פעמים עם ddH2O.
    5. הוסף ddH2O לצנצנת הצביעה כדי לכסות את הכיסויים, הניח בחומר ניקוי קולי למשך 15 דקות, ולאחר מכן שטוף 3 פעמים עם ddH2O.
  3. שינוי אמינוסילניזציה של משטח הכיסוי.
    1. מהדקים את הכיסוייםהחלקות בצנצנת הצביעה על ספסל נקי, יבשו אותם בחנקן והכניסו אותם לצנצנת מכתים נוספת (מיובשת מראש).
    2. אופים את צנצנת הצביעה בתנור ייבוש בחום של 120 מעלות למשך 30 דקות, ולאחר מכן מצננים לטמפרטורת החדר במייבש.
    3. מוסיפים לכוס 47.5 מ"ל מתנול, 2.5 מ"ל חומצה אצטית ו -0.5 מ"ל 3-Aminopropyltriethoxysilane (APTES) (מיובש מראש), מערבבים באופן שווה, מוסיפים לצנצנת הצביעה ודוגרים למשך 10 דקות.
    4. שוטפים את הכיסויים בצנצנת הצביעה עם ddH2O לפחות שלוש פעמים וסוניקציה למשך 5 דקות.
    5. הוציאו את הכיסויים בזה אחר זה, שטפו עם ddH2O, יבשו עם חנקן והכניסו אותם לצלחת פטרי בגודל 10 ס"מ כדי להתכונן לשינוי PEG.
      הערה: שינוי APTES חייב להתבצע בסביבה יבשה.
  4. שינוי משטח החלקה עם SVA-mPEG-ביוטין ו-SVA-mPEG
    הערה: שינוי ביוטין של משטח הכיסוי מסייע בשמירה על חלבונים ביוטיניליים (או חלבונים הנקשרים לביוטין-אנטי-היס) באמצעות סטרפטווידין.
    1. ממיסים את SVA-mPEG ו-SVA-mPEG-ביוטין הארוזים בתמיסת המלח הגבוהה (1 מ"ג המתאים לתמיסת מלח גבוהה של 10 מיקרוליטר) לחלוטין. הוסף את תמיסת SVA-mPEG-Biotin לתמיסת SVA-mPEG ביחס של 1:100.
      הערה: השתמש במערבולת כדי לנער את התמיסה כדי להבטיח ש-SVA-mPEG או SVA-mPEG-ביוטין מומסים לחלוטין. יש להכין את התמיסה המימית SVA-mPEG או SVA-mPEG-Biotin לפני השימוש.
    2. זרוק את תמיסת התערובת המוכנה על כיסוי וכסה אותה בכיסוי נוסף. תהליך זה אמור למנוע יצירת בועות. דגרו את הכיסויים במלואם עם לחות מתאימה למשך יותר משעתיים או לילה.
    3. הפרד את הכיסויים לאחר השלמת השינוי, שטוף אותם עם ddH2O וייבש בחנקן. סמן את פני השטח של הכיסוי שלא השתנה עם SVA-mPEG ו-SVA-mPEG-biotin.
    4. הנח בזהירות את הכיסוי שהשתנה בצינור מיקרו-צנטריפוגה של 50 מ"ל. יש לאחסן בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס לאחר שאיבת האבק.
      הערה: ניתן לאחסן את תלוש הכיסוי שהשתנה בוואקום למשך חודש.

2. הכנת שקופיות מיקרוסקופ לתא אימוביליזציה של חלבונים

  1. שטפו את שקופיות המיקרוסקופ כמתואר עבור החלקות כיסוי בשלב 1.2.
  2. פוצצו את שקופיות המיקרוסקופ יבשו בחנקן והכניסו אותם לצינורות מיקרוצנטריפוגה של 50 מ"ל.
  3. אחסן את שקופיות המיקרוסקופ כמתואר בשלב 1.4.4.

3. ביטוי וטיהור חלבונים

  1. הכנה
    1. פלסמידים: שיבוט בן משפחת אטלסטין מעניין או המוטציה הפתוגנית המעניינת לווקטור ביטוי חיידקי, למשל, pET-28a, והוסף Avitag27. הציגו ציסטאין במיקומים רלוונטיים על ידי מוטגנזה מכוונת אתר (לדוגמה, T51C ו-K400C27).
    2. הכן את המאגרים הבאים.
      1. מדיום תרבית לוריא-ברטאני (LB): מערבבים 10 גרם טריפטון, 5 גרם תמצית שמרים ו-10 גרם נתרן כלורי ב-1 ליטר של ddH2O. חיטוי ב-121 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות.
      2. מאגר ליזה: מערבבים 25 מ"מ של HEPES (pH 7.4), 150 מ"מ של KCl, 5 מ"מ של MgCl2, 1x קוקטייל מעכב פרוטאז שלם ללא EDTA, 10 מ"מ של אימידזול ו-0.5 מ"מ של TCEP. יש לאחסן בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
      3. מאגר כביסה: מערבבים 25 מ"מ של HEPES (pH 7.4), 150 מ"מ של KCl, 5 מ"מ של MgCl2, 30 מ"מ של אימידזול ו-0.5 מ"מ של טריס (2-קרבוקסיאתיל) פוספין הידרוכלוריד (TCEP). יש לאחסן בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
      4. מאגר: מערבבים 25 מ"מ של HEPES (pH 7.4), 150 מ"מ של KCl, 5 מ"מ של MgCl2, 150 מ"מ של אימידזול ו-0.5 מ"מ של TCEP. יש לאחסן בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
      5. מאגר טיהור: 25 מ"מ של HEPES (pH 7.4), 150 מ"מ של KCl, 5 מ"מ של MgCl2, 0.5 מ"מ של TCEP. יש לאחסן בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
  2. טיהור חלבונים
    1. העבר את הפלסמידים27 לתאי רוזטה (DE3) (ביומד) E. coli בשיטות הלם חום טרנספורמציה חיידקית. השעו את התאים המועברים במדיום תרבית LB עם ריכוז סופי של 50 מיקרוגרם/מיקרוליטר קנמיצין נוסף.
      1. תרבית בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עד לספיגת מדיום התרבות ב-600 ננומטר היא 0.6-0.8. הוסף איזופרופיל-β-D-תיוגלקטוזיד (IPTG) בריכוז סופי של 50 מיקרומטר כדי לגרום לביטוי החלבון ב-16 מעלות צלזיוס למשך 20-24 שעות.
        הערה: ניתן לעקוב אחר קצב הגידול של תרביות תאים חיידקיות או מיקרוביאליות אחרות על ידי מדידת הצפיפות האופטית (ספיגה) של תרבית גידול התאים ב-600 ננומטר.
    2. קציר תאים על ידי צנטריפוגה בטמפרטורה של 4000 × גרם למשך 20 דקות בטמפרטורת החדר. השליכו את הסופרנטנט.
    3. השעו מחדש את גלולת התא עם 30 מ"ל של מאגר ליזה. לשבש את התאים שלוש פעמים באמצעות מגרסת תאים בלחץ גבוה.
    4. הבהירו את הליזטים על ידי צנטריפוגה ב-2,00,000 × גרם למשך שעה ב-4 מעלות צלזיוס באמצעות רוטור אולטרה-צנטריפוגה.
    5. בודד את החלבון באמצעות עמודת Ni-NTA. שטפו את עמודת ה-Ni-NTA עם מאגר כביסה למשך 5 נפחי עמודות. יש להוציא חלבון עם מאגר פליטה לנפח עמודה אחד. אוספים את הפליטה והמתרכזים באמצעות מסננים צנטריפוגליים עד ~ 500 מיקרוליטר.
    6. יתר על כן, טהר את החלבון לפי כרומטוגרפיה של אי הכללת גודל27. אוספים את הפליטה (500 מיקרוליטר לצינור).
    7. אשר את חלבון המטרה לפי משקלו המולקולרי שנקבע על ידי אלקטרופורזה של ג'ל נתרן דודציל סולפט-פוליאקרילאמיד (SDS-PAGE)27. אסוף את חלבון המטרה לשינוי נוסף.

4. ביוטינילציה של חלבונים

  1. הכנה
    1. הכן את פתרונות המלאי הבאים.
      1. ממיסים מגנזיום אצטט טטרהידרט (MgOAc·4H2O) ב-25 מ"מ של מאגר HEPES (pH 7.7) בריכוז של 100 מ"מ (10×). יש לצרוך 100 מיקרוליטר לצינור ולאחסן בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס.
      2. ממיסים מלח אדנוזין 5-טריפוספט דיסודיום (ATP) ב-ddH2O בריכוז של 100 מ"מ (10×). התאם את ה-pH ל-7.4 באמצעות NaOH. יש לצרוך 100 מיקרוליטר לצינור ולאחסן בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס.
      3. ממיסים d-biotin ב-ddH2O בריכוז של 500 מיקרומטר.
      4. ממיסים סטרפטווידין ב-ddH2O בריכוז של 1 מ"ג/מ"ל. יש לצרוך 20 מיקרוליטר לצינור ולאחסן בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס.
    2. מאגר ביוטינילציה של חלבון: הוסף 25 מ"מ של HEPES (pH 7.7), 200 מ"מ של אשלגן חומצה L-גלוטמית ו-0.5 מ"מ של TCEP. יש לאחסן בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
    3. יש לטהר את ליגאז הביוטין של BirA ולאחסן בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס.
  2. ביוטינילציה של חלבונים
    1. שנה את מאגר החלבון למאגר הביוטינילציה של החלבון. לביוטינילציה, יש לערבב 100 מיקרוליטר של 100 מ"מ ATP, 100 מיקרוליטר של 100 מ"מ MgOAc, 100 מיקרוליטר של 500 מיקרומטר d-ביוטין, 10 מיקרוליטר של 100 מיקרומטר ביוטין ליגאז, 50 מיקרומטר חלבון לנפח סופי של 1 מ"ל ולדגור למשך הלילה ב-4 מעלות צלזיוס.
    2. הסר את ה-d-biotin החינמי באמצעות מסנן צנטריפוגלי של 10 K MWCO.
    3. דגרו 20 מיקרוליטר חלבון ביוטיניל עם 20 מיקרוליטר 15 מיקרומטר סטרפטווידין למשך 20 דקות על קרח. זהה את היעילות של ביוטינילציה של חלבון על ידי SDS-PAGE27.

5. תיוג פלואורופור חלבון

  1. הכנה
    1. ממיסים פלואורופורים LD555 (תורם) ו-LD655 (מקבל) בדימתיל סולפוקסיד (DMSO) לריכוז סופי של 5 מ"מ. יש לאחסן בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס.
    2. הכן מאגר תיוג: מערבבים 25 מ"מ של HEPES (pH 7.4), 150 מ"מ של KCl ו-5 מ"מ של MgCl2. יש לאחסן בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
    3. שנה את מאגר החלבון למאגר התיוג.
  2. תיוג פלואורופור
    1. עבור מבחני smFRET תוך-מולקולריים, מערבבים ATL1cyto-TK עם LD555 ו-LD655 ביחס של 1:1.2:1.2 לנפח סופי של 100 מיקרוליטר (הנפח הכולל של פלואורופורים לא יעלה על 1 מיקרוליטר), ודגירה למשך 5 שעות ב-4 מעלות צלזיוס.
    2. עבור ניסויי smFRET בין-מולקולריים, דגרו ATL1cyto-K או ATL1cyto-T עם LD555 ביחס של 1:1.2, ובמקביל דגרו ATL1ציטו-K ביוטינילציה עם LD655 ביחס של 1:1.2, למשך 5 שעות ב-4 מעלות צלזיוס (אותו נפח דגירה כמו ב-5.2.1).
      הערה: דגירה משותפת של חלבון וצבעים מאפשרת גמישות בעמדות התיוג עבור LD555 (תורם) ו-LD655 (מקבל). העובדה ש-LD555 מסומן ל-T51C או K400C אינה משפיעה על תוצאות ניסוי ה-FRET. תרשים סכמטי של התורם המסומן באתר T51C מסופק (איור 1C,D).
    3. הסר עודפי פלואורופורים חופשיים באמצעות עמודי התפלה של 7 K MWCO27.
    4. הוסף TCEP לחלבונים המסומנים בפלואורופור בריכוז סופי של 0.5 מ"מ.
    5. זהה את יעילות התיוג של חלבונים באמצעות ספקטרופוטומטר. מדוד את ספיגת החלבון ב-280 ננומטר, ספיגת LD555 ב-555 ננומטר וספיגת LD555 ב-655 ננומטר, וחשב את הריכוזים המולאריים באמצעות מקדמי ההכחדה שלהם, בהתאמה. יעילות תיוג חלבון = (ריכוז מולרי של צבע פלואורסצנטי / ריכוז מולרי של חלבון) x 100%.

6. הדמיית FRET של מולקולה אחת

  1. הכנה
    1. הכן את מאגר הדגירה: מערבבים 25 מ"מ של HEPES (pH 7.4), 150 מ"מ של KCl ו-5 מ"מ של MgCl2. יש לאחסן בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
    2. הכן 1 מ"ג/מ"ל סטרפטווידין (מומס ב-ddH2O) ונוגדנים אנטי-His ביוטיניליים של 1 מ"ג/מ"ל לקיבוע חלבונים.
    3. הכן 25 מ"מ חומצה בנזואית (pH 7.4; מומס במאגר כמתואר ב-7.1.1) ו-100 מ"מ של פרוטוקטכואט 3,4-דיאוקסיגנאז (PCD) (מומס בתמיסת גליצרין 40%) כדי למזער את ההלבנה במהלך ניסויי smFRET.
    4. הכן 100 מ"מ של מלח נתרן גואנוזין 5'-דיפוספט (תמ"ג), גואנוזין 5'-O-[גמא-תיו]טריפוספט (GTPγS) ו-AlCl3 תמיסות מלאי מומסות ב-ddH2O. הכן 1 מ' של תמיסת מלאי NaF מומסת ב-ddH2O.
    5. הוציאו את הכיסוי ושקופית המיקרוסקופ שהשתמרו בוואקום, והדביקו אותם בזהירות עם סרט דו צדדי מותאם אישית על ספסל נקי. התקן צינורות וטיפים ליצירת תא מיקרופלואידי עם שש תעלות27.
      הערה: אין לחשוף את הכיסוי שהשתנה לאוויר לפרקי זמן ממושכים. הכן את התא המיקרופלואידי27 לפני שתתחיל בניסויי smFRET.
  2. תיקון מיפוי
    הערה: במהלך הניסוי, יש לאסוף אותות פלואורסצנטיים מערוצי התורם והמקבל, בהתאמה. עקב השימוש במיקרוסקופים, ייתכנו סטיות קלות בשדות הניטור של ערוצי התורם והמקבל. על מנת להפחית את הסטייה בשדות הניטור, יש לבצע כיול מיפוי לפני תחילת הניסוי.
    1. מערבבים היטב 10% חלקיקי פוליסטירן (קוטר 3 מיקרומטר), מוסיפים 10 מיקרוליטר חלקיקים לשקופית מיקרוסקופ (לא שונה), ומכסים בכיסוי (לא שונה).
    2. בחר שדה ראייה עם כמה שיותר חלקיקי פוליסטירן. צלם וידאו תחת שדה בהיר באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי של השתקפות פנימית כוללת (TIRF).
      הערה: מטרת טבילת שמן עם צמצם מספרי גבוה (100x) שימשה להדמיה ברזולוציה גבוהה. עבור ניסויי smFET, אותות נלכדו במרווחי פריימים של 30 אלפיות השנייה באמצעות מצלמת EMCCD.
    3. השתמש בסקריפט מותאם אישית כדי ליישר את המיקום המרכזי של אותו חלקיק פוליסטירן בערוץ התורם ובערוץ המקבל ושמור את קובץ המפה כקובץ txt. קוד ה-MATLAB המותאם אישית ששימש במחקר זה זמין בכתובת https://github.com/yangchenguang-1994/HMM-FRET).
  3. קיבוע החלבונים בתא
    1. עבור ניסויי smFRET בין-מולקולריים, ערבבו את ATL1cyto-K או ATL1cyto-T המסומן LD555 ואת ATL1cyto-K-biotin המסומן ב-LD655 ביחס של 1:1 עם ריכוז סופי של 1 מ"מ של GTPγS או GDP/AlF4-, ודגרו למשך שעה אחת על הקרח כדי לעמעם את החלבון.
    2. עבור ניסויי ATL1cyto-T ו-ATL1 cyto-K בין-מולקולריים smFRET, ערבבו ATL1cyto-T עם תווית LD555 ו-ATL1ציטו-K-ביוטין עם תווית LD655 ביחס של 1:1 עם ריכוז סופי של 1 מ"מ של GTPγS או GDP/AlF 4-, ודגרו במשך שעה על קרח כדי להשיג חלבונים מעומעמים.
    3. עבור מבחני smFRET תוך-מולקולריים, דגרו על LD555 ו-LD655ATL1 cyto-TK עם 1 מ"מ של תמ"ג למשך שעה אחת על קרח לפני ביצוע ניסויי smFRET בתנאי תמ"ג.
    4. עבור ניסויי smFRET בין-מולקולריים, דגרו 10 מיקרוגרם/מ"ל סטרפטווידין (מדללים עם מאגר דגירה של 200 מיקרוליטר) למשך 10 דקות כדי לשתק חלבונים. לבדיקות smFRET תוך-מולקולריות, הוסף נוגדן אנטי-His ביוטיניל של 10 מיקרוגרם/מ"ל (מדולל עם מאגר דגירה של 200 מיקרוליטר) ודגר למשך 10 דקות כדי לשתק חלבונים. שטפו את התעלה פעם אחת עם מאגר דגירה לפני הוספת כל תמיסה.
    5. יש לדלל דימר ATL1 ל-~0.3 ננומטר או מונומר ל-~1 ננומטר במאגר דגירה של 200 מיקרוליטר, ולדגור למשך 10 דקות כדי לשתק חלבונים בתעלה. שטפו את התעלה עם מאגר הדגירה פעמיים. הוסף חומצה בנזואית ו-PCD לתעלה בריכוז סופי של 2.5 מ"מ (מדולל עם מאגר של 200 מיקרוליטר).
      הערה: כדי לדמות את השלבים השונים של מולקולותATL1 cyto בתהליך ההידרוליזה של GTP, נוקלאוטיד (GDP, GTPγS ו-GDP/AlF4-) נוסף בריכוז סופי של 1 מ"מ למאגרים בכל שלב לאחר קיבוע החלבון בתעלה. תוספת GTPγS מחקה קשירת GTP, תוספת GDP/AlF4 מחקה הידרוליזה של GTP, תוספת תמ"ג מחקה שחרור Pi, ותוספת apo sate מייצגת שחרור תמ"ג.
  4. הדמיית smFRET
    1. כוונן את מישור המוקד. השתמש בכפתורי המיקוד הגסים והעדינים והתאם את מישור המוקד כדי להביא את הדגימה למיקוד חד. כאן נעשה שימוש במערכת מיקוד אוטומטית להשגת המיקוד האופטימלי.
    2. הגדר את מקור העירור. השתמש בלייזר 532 ננומטר כמקור אור העירור. כוונן את עוצמת הלייזר לרמה מתאימה כדי לעורר את הפלואורופורים. כאן נעשה שימוש בהספק לייזר של 20-40 מגוואט.
    3. חבר את מצלמת EMCCD למיקרוסקופ. הגדר את המצלמה להקליט במרווח פריימים של 30 אלפיות השנייה. ודא שהמצלמה מוגדרת לצילום תמונות במצב 16 סיביות עבור נתונים ברזולוציה גבוהה.
    4. הקלט את הסרט, וודא שהפוקוס יישאר יציב לאורך כל הרכישה. האריך את זמן הקרנת הלייזר של 532 ננומטר זמן רב ככל האפשר עד שרוב המולקולות הפלואורסצנטיות יכבו בעת הקלטת אותות הקרינה.
    5. שמור את הסרטים המוקלטים בתבנית TIFF של 16 סיביות להמשך ניתוח.

7. איסוף וניתוח נתונים

  1. טען את קובץ ה-txt של המפה לתיקון לפני חילוץ מסלולי ה-FRET מהסרטים המוקלטים. בחר את מסלולי ה-FRET ושמור כל נתוני מסלול FRET בפורמט txt להמשך ניתוח.
  2. חלץ את הנתונים מקבצי ה-txt וחשב את ערכי ה-FRET באמצעות סקריפטים תוצרת בית ב-Matlab2022a. קוד MATLAB המותאם אישית זמין בכתובת https://github.com/yangchenguang-1994/HMM-FRET.
    הערה: ערך ה-FRET מחושב באמצעות המשוואה ILD655/(γILD555+ILD655). ILD555 ו-ILD655 מייצגים את עוצמות הקרינה LD555 ו-LD655, בהתאמה. γ הוא פרמטר המתקבל על ידי הנוסחה γ = FA/FD. FA מייצג את הירידה בעוצמת המקבל, ו- FD הוא התוספת של עוצמת התורם.
  3. התאם את נתוני ה-smFRET של GaussAmp ב-Origin 2022 כדי לקבל את היסטוגרמה של ההפצה.
    הערה: עבור נתונים עם מצבי FRET מרובים (הנתונים תחת תנאי GTPγS ב-smFRET בין-מולקולרי או הנתונים של smFRET תוך מולקולרי בתנאי תמ"ג או Apo), ניתן להשתמש בהתאמה מרובת שיאים.

תוצאות

ניסויי smFRET בוצעו במיקרוסקופ TIRF על ידי לכידת עוצמת הקרינה של פלואורופורים כל 30 אלפיות השנייה. תמונות מייצגות של מולקולותציטו ATL1 המסומנות על ידי LD555 (תורם) ו/או LD655 (מקבל) בהיעדר או נוכחות של נוקלאוטידים שונים מוצגות באיור 2A-C. עוצמות ?...

Discussion

טכנולוגיית FRET מבוססת על העברת אנרגיה בין שני צבעים פלואורסצנטיים (תורם ומקבל). במקרה של קרבתם זה לזה (בדרך כלל 1-10 ננומטר), התורם הנרגש מעביר את האנרגיה שלו למקבל, וכתוצאה מכך ירידה בעוצמת הקרינה של התורם ועלייה בעוצמת הקרינה המקבלת.

בניסויי smFET, המולקולות מד...

Disclosures

המחברים מצהירים שאין ניגודי אינטרסים.

Acknowledgements

X.B. נתמך על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (32371287), קרנות המחקר הבסיסיות לאוניברסיטאות המרכזיות (63223043 ו-63233053), ופרויקט הכשרת הכישרונות באוניברסיטת ננקאי (035-BB042112). י.ל. נתמך על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (12022409 ו-T2221001) ותוכנית המחקר המרכזית של מדעי הגבול של CAS (ZDBS-LY-SLH015). L.M. נתמך על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (32271274 ו-31770812).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
10 K Centrifugal FiltersAmiconUFC901096
3-Aminopropyltriethoxysilane (APTES) Sigma-Aldrich440140
45 Ti rotor
532-nm laserOlympus
640-nm laserOlympus
7 K MWCO spin desalting columnsThermo Scientific89882
Adenosine 5-triphosphate disodium salt (ATP)Roche11140965001
Benzoic acidSigma-Aldrich242381
Biotin-PEG-SVA-5000Laysan Bio170-124
Biotinylated anti His antibodyBioss Antibodiesbs-0287R-bio
d-biotinSigma-AldrichB4501
EDTA-free protease inhibitor cocktailRoche11873580001
EMCCD cameraAndorIX897
Guanosine 5′-diphosphate sodium salt (GDP)Sigma-Aldrich G7127
Guanosine 5'-O-[gamma-thio]triphosphate (GTPγS)Roche10220647001
High numerical aperture oil immersion objectiveNikonNikon, 100x, N.A. 1.49, oil immersion
ImageJNIHhttps://imagej.net/ij/
Isopropyl-Β-D-ThiogalactosideSigma-AldrichI5502
LD555-MALLumidyne4
LD655-MALLumidyne10
L-glutamic acid potassiumSigma-AldrichG1501
Magnesium acetate tetrahydrateSigma-AldrichM0631
MatlabThe MathWorks, Natick, MAhttps://www.mathworks.com/
Microscope cover glassFisherbrand18834 (24 mm × 60 mm)
Microscope slidesCustomized, (75 mm × 26 mm × 1 mm) with 6 pairs of 1.2 mm diameter through holes
mPEG-SVA-5000Laysan Bio170-106
Ni Sepharose 6 Fast FlowCytiva17531802
OriginOrigin softwarehttps://www.originlab.com/
Polystyrene particlesQDSphereAG1265
Protocatechuate 3,4-dioxygenaseSigma-AldrichP8279
StreptavidinSangon BiotechA610492
Superdex 200 Increase (10/300 GL)Cytiva28990944
TIRF microscopeNikonTi2
Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride (TCEP)Thermo75259

References

  1. Jimah, J. R., Hinshaw, J. E. Structural insights into the mechanism of dynamin superfamily proteins. Trends Cell Biol. 29 (3), 257-273 (2019).
  2. Kalia, R., Frost, A. Open and cut: Allosteric motion and membrane fission by dynamin superfamily proteins. Mol Biol Cell. 30 (17), 2097-2104 (2019).
  3. Ramachandran, R., Schmid, S. L. The dynamin superfamily. Curr Biol. 28 (8), R411-R416 (2018).
  4. Bryce, S., et al. Human atlastin-3 is a constitutive ER membrane fusion catalyst. J Cell Biol. 222 (7), e202211021 (2023).
  5. Crosby, D., et al. Reconstitution of human atlastin fusion activity reveals autoinhibition by the C terminus. J Cell Biol. 221 (2), e202107070 (2022).
  6. Hu, J., et al. A class of dynamin-like GTPases involved in the generation of the tubular er network. Cell. 138 (3), 549-561 (2009).
  7. Jang, E., et al. Human atlastins are sufficient to drive the fusion of liposomes with a physiological lipid composition. J Cell Biol. 222 (4), e202109090 (2023).
  8. Liu, X., et al. Atlastin-1 regulates morphology and function of endoplasmic reticulum in dendrites. Nat Commun. 10 (1), 568 (2019).
  9. Orso, G., et al. Homotypic fusion of ER membranes requires the dynamin-like gtpase atlastin. Nature. 460 (7258), 978-983 (2009).
  10. Rismanchi, N., Soderblom, C., Stadler, J., Zhu, P. P., Blackstone, C. Atlastin GTPases are required for Golgi apparatus and er morphogenesis. Hum Mol Genet. 17 (11), 1591-1604 (2008).
  11. Faust, J. E., et al. The atlastin C-terminal tail is an amphipathic helix that perturbs the bilayer structure during endoplasmic reticulum homotypic fusion. J Biol Chem. 290 (8), 4772-4783 (2015).
  12. Liu, T. Y., et al. Lipid interaction of the c terminus and association of the transmembrane segments facilitate atlastin-mediated homotypic endoplasmic reticulum fusion. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (32), E2146-E2154 (2012).
  13. Moss, T. J., Andreazza, C., Verma, A., Daga, A., Mcnew, J. A. Membrane fusion by the GTPase atlastin requires a conserved c-terminal cytoplasmic tail and dimerization through the middle domain. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (27), 11133-11138 (2011).
  14. Bian, X., et al. Structures of the atlastin GTpase provide insight into homotypic fusion of endoplasmic reticulum membranes. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (10), 3976-3981 (2011).
  15. Byrnes, L. J., et al. Structural basis for conformational switching and GTP loading of the large g protein atlastin. EMBO J. 32 (3), 369-384 (2013).
  16. Byrnes, L. J., Sondermann, H. Structural basis for the nucleotide-dependent dimerization of the large g protein atlastin-1/spg3a. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (6), 2216-2221 (2011).
  17. Morin-Leisk, J., et al. An intramolecular salt bridge drives the soluble domain of gtp-bound atlastin into the postfusion conformation. J Cell Biol. 195 (4), 605-615 (2011).
  18. Pendin, D., et al. GTP-dependent packing of a three-helix bundle is required for atlastin-mediated fusion. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (39), 16283-16288 (2011).
  19. Winsor, J., Hackney, D. D., Lee, T. H. The crossover conformational shift of the GTPase atlastin provides the energy driving ER fusion. J Cell Biol. 216 (5), 1321-1335 (2017).
  20. Yan, L., et al. Structures of the yeast dynamin-like GTPase sey1p provide insight into homotypic er fusion. J Cell Biol. 210 (6), 961-972 (2015).
  21. Rizo, J. Molecular mechanisms underlying neurotransmitter release. Annu Rev Biophys. 51, 377-408 (2022).
  22. Gao, S., Hu, J. Mitochondrial fusion: The machineries in and out. Trends Cell Biol. 31 (1), 62-74 (2021).
  23. Kelly, C. M., Byrnes, L. J., Neela, N., Sondermann, H., O'donnell, J. P. The hypervariable region of atlastin-1 is a site for intrinsic and extrinsic regulation. J Cell Biol. 220 (11), e202104128 (2021).
  24. Asher, W. B., et al. GPCR-mediated beta-arrestin activation deconvoluted with single-molecule precision. Cell. 185 (10), 1661-1675.e16 (2022).
  25. Li, M., et al. Mechanism of DNA translocation underlying chromatin remodelling by snf2. Nature. 567 (7748), 409-413 (2019).
  26. Chen, Y., et al. Conformational dynamics of dynamin-like MXA revealed by single-molecule fret. Nat Commun. 8, 15744 (2017).
  27. Shi, L., et al. Dissecting the mechanism of atlastin-mediated homotypic membrane fusion at the single-molecule level. Nat Commun. 15 (1), 2488 (2024).
  28. Guelly, C., et al. Targeted high-throughput sequencing identifies mutations in atlastin-1 as a cause of hereditary sensory neuropathy type i. Am J Hum Genet. 88 (1), 99-105 (2011).
  29. Montagna, A., Vajente, N., Pendin, D., Daga, A. In vivo analysis of CRISPR/Cas9 induced atlastin pathological mutations in drosophila. Front Neurosci. 14, 547746 (2020).
  30. Ulengin, I., Park, J. J., Lee, T. H. ER network formation and membrane fusion by atlastin1/spg3a disease variants. Mol Biol Cell. 26 (9), 1616-1628 (2015).
  31. Zhao, X., et al. Mutations in a newly identified GTPase gene cause autosomal dominant hereditary spastic paraplegia. Nat Genet. 29 (3), 326-331 (2001).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

215GTPaseGTPSmRETN

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved