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요약

다이나민 슈퍼패밀리 단백질의 기능은 GTP 가수분해와 결합된 구조적 변화에 의존합니다. 시스템은 다양한 뉴클레오티드 로딩 상태에서 dynamin-like GTPase atlastin의 구조적 역학을 모니터링하기 위해 smFRET(single-molecule FRET) 기술을 사용하여 설명됩니다.

초록

다이나민 유사 단백질 아틀라스틴(ATL)의 GTPase 도메인에 대한 3나선 중간 영역(3HB)의 강체 회전은 소포체(ER) 내에서 동형막 융합의 중요한 동인입니다. 이 과정의 중단은 신경퇴행성 질환인 유전성 경련성 하반신 마비(HSP)와 관련이 있습니다. 구조 및 생화학 연구는 ATL의 구조적 변화가 GTP 가수분해와 관련이 있음을 시사하지만, GTP 가수분해 주기 동안 이러한 구조적 역학을 실시간으로 시각화하는 것은 여전히 어렵습니다. ATL 기능 이면의 기계적 메커니즘을 더 잘 이해하기 위해 단일 분자 Förster 공명 에너지 전달(smFRET)을 활용했습니다. 스트렙타비딘으로 코팅된 미세유체 챔버에서 인간 ATL1(ATL1cyto)의 N-말단 세포질 영역을 고정시키기 위해 세 가지 특정 전략이 사용되어 분자 내 및 분자간 smFRET 이미징의 적용을 용이하게 했습니다. 이를 통해 다양한 뉴클레오티드 로딩 상태에서 단백질 구조를 정밀하게 모니터링하여 개별 분자 거동에 대한 직접적인 통찰력을 제공할 수 있었습니다. 이 방법은 다른 기계화학 단백질을 연구하는 데에도 적용할 수 있습니다.

서문

진핵 세포에서 다이나민 슈퍼패밀리 단백질은 막 세뇨관, 핵분열 및 융합을 포함한 생물학적 막의 리모델링을 매개합니다 1,2,3. 이러한 단백질의 돌연변이는 신경 퇴행성 질환과 같은 다양한 인간 질병을 유발합니다. 다이나민 슈퍼패밀리의 구성원은 일반적으로 GTPase 도메인, 나선형 다발로 구성된 중간 도메인, 멤브레인 결합을 위한 모티프 및 GTPase 이펙터 도메인(GED)을 포함합니다. 이러한 다이나민과 같은 GTPase 중 하나는 아틀라스틴 (ATL)으로, 소포체 (ER)의 동형 막 융합을 촉매하여 네트워크4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 을 형성합니다. 포유류에는 세 가지 ATL(ATL1-3)이 있습니다. ATL 분자는 GTPase 도메인과 3나선 중간 도메인(3HB)을 포함한 N-말단 세포질 영역(ATLcyto)과 2개의 막관통 영역으로 구성되지만 일반적인 GED는 없습니다. 대안적으로, ATL은 막 융합 11,12,13에서 중요한 역할을 하는 C-말단 꼬리를 포함합니다.

효율적인 막 융합은 ATLcyto14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 에서 GTP 가수 분해 의존적 도메인 재배열에 의존하는 것으로보고되었습니다. 그러나, 이형막 융합21을 구동하기 위해 구조적 변화로부터의 접힘 에너지를 사용하는 SNARE 복합체와 비교하여, ATL 및 기타 융합 특이적 다이나민 유사 단백질(22)에 의해 매개되는 동형막 융합 과정은 여전히 파악하기 어렵습니다. 인간 ATL1cyto의 세 가지 결정 구조는 서로 다른 뉴클레오티드 로딩 조건 14,15,16,23에서 결정되었습니다. 구조에서 이량체에 있는 두 개의 3HB는 서로 다른 방향을 가리키지만, ATLcyto의 구조적 역학과 GTPase 활성이 어떻게 결합되는지 설명하는 포괄적인 모델은 아직 누락되었습니다.

이전 모델에서는 단량체 ATL 분자가 GTP 의존적 방식으로 서로 다른 멤브레인에 걸쳐 이량체를 형성하여 멤브레인 융합을 유도했습니다. 여기에서는 단일 분자 Förster 공명 에너지 전달(smFRET)을 적용하여 개별 ATL1세포 분자의 거동을 직접 관찰하고 정확하게 검출하기 위한 세 가지 전략을 설명합니다. smFRET은 GPCR 매개 β-어레스틴 활성화24, Snf225에 의한 염색질 리모델링, GTP 가수분해 주기26과 결합된 다이나민 유사 단백질 MxA의 도메인 재배열과 같은 개별 생체 분자의 구조적 역학 및 상호 작용을 실시간으로 조사하는 데 광범위하게 사용되는 강력한 기술입니다. smFRET은 ~3 nm에서 ~8 nm까지의 거리 변화만 효과적으로 감지할 수 있기 때문에 각 뉴클레오티드 로딩 상태에 대한 ATL1cyto의 구조를 종합적으로 분석하기 위해서는 분자간 및 분자내 smFRET 실험이 모두 필요합니다. 모든 네이티브 시스테인이 알라닌 및 K400(ATL1cyto-K)으로 치환되거나 T51/K400 쌍(ATL1cyto-TK)이 형광단 표지를 위해 시스테인으로 돌연변이된 ATL1cyto의 세 가지 구조를 생성했습니다. 분자간 또는 분자내 smFRET 실험을 위해 스트렙타비딘으로 코팅된 미세유체 챔버(그림 1A)에서 ATL1사이토 이량체 또는 단량체를 고정화하는 전략은 그림 1B-D에 나와 있습니다. 이 방법은 GTP 가수분해의 각 단계에서 다이나민 유사 단백질의 구조적 역학에 대한 자세한 내용을 제공합니다27.

프로토콜

이 연구에 사용된 시약 및 장비의 세부 정보는 재료 표에 나열되어 있습니다.

1. 단백질 고정 챔버를 위한 변형된 커버슬립의 제조

  1. 준비
    1. 과도한 온도를 방지하기 위해 농축 황산에 과산화수소를 천천히 첨가하여 피라냐 용액 50mL(진한 황산과 과산화수소를 3:1의 비율로 구성)를 준비합니다. 흄 후드에 조심스럽게 넣으십시오.
    2. 에톡시나트륨 용액을 준비합니다. ddH2O15mL에 NaOH 2g을 용해시키고 앱솔루트 에탄올 35mL를 첨가한 후 완전히 혼합합니다. 실온에 두십시오.
    3. 고 염 용액 (0.1 M의 NaHCO3 및 0.6 M의 K2SO4)을 준비합니다. 완전히 용해시키고 500 μL/튜브를 분주합니다. -20 °C에서 보관하십시오.
    4. SVA-mPEG 및 SVA-mPEG-비오틴을 튜브당 약 30mg, 튜브당 3mg으로 분취합니다. -20 °C에서 보관하십시오.
    5. 6쌍의 1.2mm 직경 구멍으로 현미경 슬라이드(75mm × 26mm × 1mm)를 사용자 정의할 수 있습니다.
  2. 커버슬립 표면 청소
    1. 핀셋을 사용하여 8개의 커버슬립을 집어 염색 용기에 넣습니다. 아세톤(~50mL)을 추가하여 커버슬립을 덮고 염색 용기를 초음파 세척기에 30분 동안 넣은 다음 커버슬립을 ddH2O로 세 번 헹굽니다.
    2. 1.2.1단계와 같이 메탄올로 커버슬립을 세척합니다.
    3. 염색 용기에 피라냐 용액(단계 1.1.1)을 넣고 95°C 수조 주전자에서 2시간 동안 가열합니다. 염색 용기를 실온으로 냉각한 후 ddH2O로 커버슬립을 6회 이상 헹굽니다.
    4. 염색 용기에 에톡산화 나트륨 용액을 넣고 초음파 세척기에 15 분 동안 넣은 다음 ddH2O로 3 번 헹굽니다.
    5. 염색 용기에 ddH2O를 추가하여 커버 슬립을 덮고 초음파 세척기에 15 분 동안 넣은 다음 ddH2O로 3 번 헹굽니다.
  3. 커버슬립 표면의 아미노실란화 변형.
    1. 깨끗한 벤치의 염색 용기에 커버 슬립을 고정하고 질소로 건조시킨 다음 다른 염색 용기에 넣습니다 (미리 건조 됨).
    2. 염색 용기를 120°C의 건조 오븐에서 30분 동안 구운 다음 데시케이터에서 실온으로 식힙니다.
    3. 비커에 메탄올 47.5mL, 아세트산 2.5mL, 3-아미노프로필트리에톡시실란(APTES) 0.5mL를 첨가(미리 건조)하고 골고루 섞은 후 염색 용기에 넣고 10분 동안 배양합니다.
    4. 염색 용기에 있는 커버슬립을 ddH2O로 최소 3회 헹구고 5분 동안 초음파 처리합니다.
    5. 커버 슬립을 하나씩 꺼내ddH2O로 헹구고 질소로 건조시킨 다음 10cm 직경의 페트리 접시에 넣어 PEG 변형을 준비합니다.
      알림: APTES 수정은 건조한 환경에서 수행해야 합니다.
  4. SVA-mPEG-Biotin 및 SVA-mPEG를 사용한 커버슬립 표면 변형
    참고: 커버슬립 표면의 비오틴 변형은 스트렙타비딘을 통해 비오틴화된 단백질(또는 비오틴-항-His에 결합하는 단백질)을 유지하는 데 도움이 됩니다.
    1. 포장된 SVA-mPEG 및 SVA-mPEG-비오틴을 고염 용액(10μL 고염 용액에 해당하는 1mg)에 완전히 용해시킵니다. SVA-mPEG-비오틴 용액을 1:100의 비율로 SVA-mPEG 용액에 첨가합니다.
      참고: 소용돌이를 사용하여 용액을 흔들어 SVA-mPEG 또는 SVA-mPEG-비오틴이 완전히 용해되도록 합니다. SVA-mPEG 또는 SVA-mPEG-비오틴 수용액은 사용 전에 준비해야 합니다.
    2. 준비된 혼합 용액을 커버슬립에 떨어뜨리고 다른 커버슬립으로 덮습니다. 이 과정은 거품 생성을 방지해야 합니다. 커버슬립을 적절한 습도로 2시간 이상 또는 밤새 완전히 배양합니다.
    3. 수정이 완료된 후 커버 슬립을 분리하고ddH2O로 헹구고 질소로 건조시킵니다. SVA-mPEG 및 SVA-mPEG-비오틴으로 변형되지 않은 커버슬립 표면을 표시합니다.
    4. 변형된 커버슬립을 50mL 마이크로 원심분리기 튜브에 조심스럽게 넣습니다. 진공 청소기로 청소한 후 -20 °C에서 보관하십시오.
      알림: 수정된 커버슬립은 1개월 동안 진공 상태에서 보관할 수 있습니다.

2. 단백질 고정 챔버를 위한 현미경 슬라이드의 준비

  1. 1.2단계에서 커버슬립에 대해 설명한 대로 현미경 슬라이드를 세척합니다.
  2. 현미경 슬라이드를 질소로 불어 건조시키고 50mL 마이크로 원심분리기 튜브에 넣습니다.
  3. 1.4.4단계에서 설명한 대로 현미경 슬라이드를 저장합니다.

3. 단백질 발현 및 정제

  1. 준비
    1. 플라스미드: 관심 아틀라스틴 패밀리 구성원 또는 관심 병원성 돌연변이를 박테리아 발현 벡터(예: pET-28a)에 복제하고 Avitag27을 추가합니다. 부위 지시 돌연변이 유발에 의해 관련 위치에 시스테인을 도입합니다(예: T51C 및 K400C27).
    2. 다음 버퍼를 준비합니다.
      1. Luria-Bertani (LB) 배양 배지 : 121 ° C에서 20 분 동안 1 L의 ddH2O. 오토 클레이브에 트립톤 10g, 효모 추출물 5g, 염화나트륨 10g을 혼합합니다.
      2. 용해 완충액: 25mM의 HEPES(pH 7.4), 150mM의 KCl, 5mM의 MgCl2, 1x 완전 EDTA-free 프로테아제 억제제 칵테일, 10mM의 이미다졸 및 0.5mM의 TCEP를 혼합합니다. 4 °C에서 보관하십시오.
      3. 세척 완충액: 25mM의 HEPES(pH 7.4), 150mM의 KCl, 5mM의 MgCl2, 30mM의 이미다졸 및 0.5mM의 Tris(2-카르복시에틸)포스핀 염산염(TCEP)을 혼합합니다. 4 °C에서 보관하십시오.
      4. 용리 완충액: 25mM의 HEPES(pH 7.4), 150mM의 KCl, 5mM의 MgCl2, 150mM의 이미다졸 및 0.5mM의 TCEP를 혼합합니다. 4 °C에서 보관하십시오.
      5. 정제 완충액: 25mM의 HEPES(pH 7.4), 150mM의 KCl, 5mM의 MgCl2, 0.5mM의 TCEP. 4 °C에서 보관하십시오.
  2. 단백질 정제
    1. 박테리아 형질전환 열 충격 방법을 사용하여 plasmids27 을 Rosetta (DE3) (Biomed) E. coli 세포로 옮깁니다. 전달된 세포를 50μg/μL 카나마이신이 첨가된 최종 농도로 LB 배양 배지에 현탁시킵니다.
      1. 600 nm에서 배양 배지의 흡광도가 0.6-0.8이 될 때까지 37 °C에서 배양한다. 최종 농도 50μM에서 이소프로필-β-D-티오갈락토시드(IPTG)를 첨가하여 16°C에서 20-24시간 동안 단백질 발현을 유도합니다.
        참고: 박테리아 또는 기타 미생물 세포 배양의 성장 속도는 600nm에서 세포 성장 배양의 광학 밀도(흡광도)를 측정하여 모니터링할 수 있습니다.
    2. 실온에서 20분 동안 4000 × g 에서 원심분리하여 세포를 수확합니다. 상등액을 버리십시오.
    3. 세포 펠릿을 30mL의 용해 완충액으로 재현탁합니다. 고압 세포 분쇄기를 사용하여 세포를 세 번 파괴합니다.
    4. 초원심분리기 로터를 사용하여 4°C에서 1시간 동안 2,00,000 × g 의 원심분리로 용해물을 정화합니다.
    5. Ni-NTA 컬럼을 사용하여 단백질을 분리합니다. Ni-NTA 컬럼을 세척 버퍼로 5 컬럼 부피로 세척합니다. 1 컬럼 부피에 대한 용리 완충액으로 단백질을 용리합니다. 용출액을 수집하고 원심 필터를 사용하여 ~ 500 μL까지 농축합니다.
    6. 또한, 크기 배제 크로마토그래피27에 의해 단백질을 정제합니다. 용리액(튜브당 500μL)을 수집합니다.
    7. 나트륨 도데실 설페이트-폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS-PAGE)에 의해 결정된 분자량으로 대상 단백질을 확인합니다.27. 추가 변형을 위해 표적 단백질을 수집합니다.

4. 단백질 비오틴닐화

  1. 준비
    1. 다음 원액을 준비합니다.
      1. 마그네슘 아세테이트 테트라하이드레이트 (MgOAc·4H2O)를 100 mM (10×)의 농도에서 25 mM의 HEPES 완충액 (pH 7.7)에 용해시킨다. 튜브당 100μL를 분취하고 -20°C에서 보관합니다.
      2. 아데노신 5-트리포스페이트 디소듐 염(ATP)을 100mM(10×)의 농도로 ddH2O에 용해시킵니다. NaOH를 사용하여 pH를 7.4로 조정합니다. 튜브당 100μL를 분취하고 -80°C에서 보관합니다.
      3. d-비오틴을 500μM 농도로 ddH2O에 용해시킵니다.튜브당 100μL 분취량으로 -20°C에서 보관합니다.
      4. 스트렙타비딘을 1mg/mL의 농도로 ddH2O에 용해시킵니다. 튜브당 20μL를 분취하고 -20°C에서 보관합니다.
    2. 단백질 비오틴화 완충액: 25mM의 HEPES(pH 7.7), 200mM의 L-글루탐산 칼륨 및 0.5mM의 TCEP를 추가합니다. 4 °C에서 보관하십시오.
    3. BirA 비오틴 리가아제를 정제하고 -80°C에서 보관합니다.
  2. 단백질 비오틴화(biotinylation)
    1. 단백질 완충액을 단백질 비오틴화 완충액으로 변경합니다. 비오틴화의 경우 100 μL의 100 mM ATP, 100 μL의 100 mM MgOAc, 100 μL의 500 μM d-비오틴, 100 μL의 100 μM BirA 비오틴 리가아제, 50 μM의 단백질을 최종 부피 1 mL에 혼합하고 4 °C에서 하룻밤 동안 배양합니다.
    2. 10 K MWCO 원심 필터를 사용하여 유리 d-비오틴을 제거합니다.
    3. 20μL 비오틴화된 단백질과 20μL 15μM 스트렙타비딘을 얼음에서 20분 동안 배양합니다. SDS-PAGE27에 의한 단백질 비오틴화의 효율성을 검출합니다.

5. 단백질 형광단 라벨링

  1. 준비
    1. 형광단 LD555(공여체) 및 LD655(수용체)를 디메틸설폭사이드(DMSO)의 최종 농도 5mM에 용해시킵니다. -20 °C에서 보관하십시오.
    2. 라벨링 완충액 준비: 25mM의 HEPES(pH 7.4), 150mM의 KCl 및 5mM의 MgCl2를 혼합합니다. 4 °C에서 보관하십시오.
    3. 단백질 완충액을 라벨링 완충액으로 변경합니다.
  2. 형광단 라벨링
    1. 분자내 smFRET 분석의 경우, ATL1cyto-TK 와 LD555 및 LD655를 1:1.2:1.2의 비율로 100 μL의 최종 부피에 혼합하고(형광단의 총 부피는 1 μL를 초과하지 않아야 함), 4 °C에서 5시간 동안 배양합니다.
    2. 분자간 smFRET 실험의 경우, ATL1cyto-K 또는 ATL1cyto-T 를 LD555와 함께 1:1.2의 비율로 배양하고, 동시에 4°C에서 5시간 동안 1:1.2의 비율로 biotinylated ATL1cyto-K 와 LD655를 동시에 배양합니다(5.2.1과 동일한 배양 부피).
      참고: 단백질과 염료의 동시 배양은 LD555(공여체) 및 LD655(수용체)에 대한 라벨링 위치에 유연성을 허용합니다. LD555가 T51C 또는 K400C로 라벨링되어 있다는 사실은 FRET 실험의 결과에 영향을 미치지 않습니다. T51C 사이트에서 라벨링되는 도여자의 개략도가 제공됩니다(그림 1C, D).
    3. 7K MWCO 스핀 탈염 컬럼27을 사용하여 과도한 유리 형광단을 제거합니다.
    4. TCEP를 0.5mM의 최종 농도로 형광단 표지 단백질에 첨가합니다.
    5. 분광 광도계를 사용하여 단백질의 표지 효율을 검출합니다. 280nm에서 단백질 흡광도, 555nm에서 LD555 흡광도, 655nm에서 LD555 흡광도를 측정하고 각각 흡광 계수를 사용하여 몰 농도를 계산합니다. 단백질 라벨링 효율 = (형광 염료의 몰 농도 / 단백질의 몰 농도) x 100%.

6. 단 하나 분자 FRET 화상 진찰

  1. 준비
    1. 배양 완충액 준비: 25mM의 HEPES(pH 7.4), 150mM의 KCl 및 5mM의 MgCl2를 혼합합니다. 4 °C에서 보관하십시오.
    2. 단백질 고정화를 위해 1mg/mL 스트렙타비딘(ddH2O에 용해) 및 1mg/mL 비오틴화 항-His 항체를 준비합니다.
    3. 25mM 벤조산(pH 7.4, 7.1.1에 설명된 대로 완충액에 용해됨) 및 100mM의 프로토카테추에이트 3,4-디옥시게나제(PCD)(40% 글리세린 용액에 용해됨)를 준비하여 smFRET 실험 중 광표백을 최소화합니다.
    4. ddH2O에 용해된 구아노신 5'-디포스페이트 나트륨 염(GDP), 구아노신 5'-O-[감마 티오]트리포스페이트(GTPγS) 및 AlCl3 원액 100mM를 준비합니다.ddH2O에 용해된 NaF 원액 1m를 준비합니다.
    5. 진공 보존 커버슬립과 현미경 슬라이드를 꺼내 깨끗한 벤치에 맞춤형 양면 테이프로 조심스럽게 붙입니다. 6개의 채널을 갖는 미세유체 챔버를 형성하기 위해 호스와 팁을 설치하십시오27.
      알림: 수정된 커버슬립을 장기간 공기에 노출시키지 마십시오. smFRET 실험을 시작하기 전에 미세유체 챔버(27 )를 준비한다.
  2. 매핑 보정
    참고: 실험 중에는 각각 공여체 및 수용체 채널에서 형광 신호를 수집해야 합니다. 현미경의 사용으로 인해 공여체 및 수용체 채널의 모니터링 필드에 약간의 편차가 있을 수 있습니다. 모니터링 필드의 편차를 줄이려면 실험을 시작하기 전에 매핑 보정을 수행해야 합니다.
    1. 10% 폴리스티렌 입자(직경 3μm)를 철저히 혼합하고 입자 10μL를 현미경 슬라이드(변형되지 않음)에 첨가한 다음 커버슬립(변형되지 않음)으로 덮습니다.
    2. 가능한 한 많은 폴리스티렌 입자가 있는 시야를 선택합니다. 전반사 형광(TIRF) 현미경을 사용하여 명시야 아래에서 비디오를 캡처합니다.
      참고: 고해상도 이미징을 위해 높은 개구수 오일 이멀젼 대물렌즈(100x)가 사용되었습니다. smFRET 실험의 경우 EMCCD 카메라를 사용하여 30ms 프레임 간격으로 신호를 캡처했습니다.
    3. 사용자 정의 스크립트를 사용하여 도너 채널 및 수용체 채널에서 동일한 폴리스티렌 입자의 중심 위치를 정렬하고 맵 파일을 txt 파일로 저장합니다. 이 연구에서 사용된 사용자 지정 MATLAB 코드는 https://github.com/yangchenguang-1994/HMM-FRET)에서 확인할 수 있습니다.
  3. 챔버의 단백질을 고정시키는 것
    1. 분자간 smFRET 실험의 경우, LD555 표지된 ATL1cyto-K 또는 ATL1cyto-T 및 LD655 표지된 ATL1cyto-K-biotin을 1mM의 GTPγS 또는 GDP/AlF4-의 최종 농도와 1:1의 비율로 혼합하고 얼음에서 1시간 동안 배양하여 단백질을 이합체화합니다.
    2. ATL1cyto-T 및 ATL1cyto-K intermolecular smFRET 실험의 경우, LD555 표지된 ATL1cyto-T 및 LD655 표지된 ATL1cyto-K-biotin을 1mM의 GTPγS 또는 GDP/AlF4-의 최종 농도와 1:1의 비율로 혼합하고 얼음에서 1시간 동안 배양하여 이합체화된 단백질을 얻습니다.
    3. 분자 내 smFRET 분석의 경우, GDP 조건에서 smFRET 실험을 수행하기 전에 얼음에서 1시간 동안 GDP의 1mM로 LD555 및 LD655 표지ATL1 cyto-TK 를 배양합니다.
    4. 분자간 smFRET 실험의 경우 10μg/mL 스트렙타비딘(200μL 배양 완충액으로 희석)을 10분 동안 배양하여 단백질을 고정시킵니다. 분자내 smFRET 분석의 경우 10μg/mL 비오틴화된 항-His 항체(200μL 배양 완충액으로 희석)를 추가하고 10분 동안 배양하여 단백질을 고정시킵니다. 각 용액을 추가하기 전에 배양 버퍼로 채널을 한 번 플러시합니다.
    5. 200μL 배양 완충액에서 ATL1 이량체를 ~0.3nM로 희석하거나 단량체를 ~1nM으로 희석하고 10분 동안 배양하여 채널의 단백질을 고정시킵니다. incubation buffer로 채널을 두 번 플러시합니다. 벤조산과 PCD를 2.5mM의 최종 농도(200μL 완충액으로 희석)로 채널에 추가합니다.
      참고: GTP 가수분해 과정에서 ATL1세포 분자의 여러 단계를 시뮬레이션하기 위해 뉴클레오타이드(GDP, GTPγS 및 GDP/AlF4-)를 채널에서 단백질을 고정시킨 후 각 단계의 완충액에 최종 농도 1mM로 첨가했습니다. GTPγS 덧셈은 GTP 결합을 모방하고, GDP/AlF4- 덧셈은 GTP 가수분해를 모방하고, GDP 덧셈은 Pi 방출을 모방하고, apo sate는 GDP 방출을 나타냅니다.
  4. smFRET 이미징
    1. 초점면을 조정합니다. 거친 초점 및 미세 초점 노브를 사용하여 초점면을 조정하여 샘플을 선명한 초점으로 가져옵니다. 여기서는 최적의 초점을 얻기 위해 자동 초점 시스템이 사용되었습니다.
    2. 여기 소스를 설정합니다. 532nm 레이저를 여기 광원으로 사용합니다. 형광단을 자극하기 위해 레이저 출력을 적절한 수준으로 조정합니다. 여기에서는 20-40mW의 레이저 출력이 사용되었습니다.
    3. EMCCD 카메라를 현미경에 연결합니다. 30ms의 프레임 간격으로 녹화하도록 카메라를 설정합니다. 카메라가 고해상도 데이터를 위해 16비트 모드에서 이미지를 캡처하도록 설정되어 있는지 확인합니다.
    4. 동영상을 기록하여 획득하는 동안 초점이 일정하게 유지되도록 합니다. 형광 신호를 기록할 때 대부분의 형광 분자가 소멸될 때까지 532nm 레이저 조사 시간을 가능한 한 연장합니다.
    5. 추가 분석을 위해 녹화된 동영상을 16비트 TIFF 형식으로 저장합니다.

7. 데이터 수집 및 분석

  1. 녹화된 동영상에서 FRET 궤적을 추출하기 전에 수정을 위해 맵 txt 파일을 로드합니다. FRET 궤적을 선택하고 추가 분석을 위해 모든 FRET 궤적 데이터를 txt 형식으로 저장합니다.
  2. txt 파일에서 데이터를 추출하고 Matlab2022a에서 수제 스크립트를 사용하여 FRET 값을 계산합니다. 사용자 지정 MATLAB 코드는 https://github.com/yangchenguang-1994/HMM-FRET 에서 사용할 수 있습니다.
    참고: FRET 값은 방정식 ILD655/(γILD555+ILD655)를 사용하여 계산됩니다. ILD555 및 ILD655 는 각각 LD555 및 LD655 형광 강도를 나타냅니다. γ는 γ = F,A/F,D로 얻은 매개변수입니다. FA 는 수용체 강도의 감소를 나타내고 FD 는 공여체 강도의 증가를 나타냅니다.
  3. Origin 2022에서 GaussAmp의 smFRET 데이터를 피팅하여 분포 히스토그램을 구합니다.
    참고: 다중 FRET 상태(분자간 smFRET의 GTPγS 조건 하의 데이터 또는 GDP 또는 Apo 조건의 분자내 smFRET 데이터)가 있는 데이터의 경우 다중 피크 피팅을 사용할 수 있습니다.

결과

smFRET 실험은 30ms마다 형광단의 형광 강도를 캡처하여 TIRF 현미경에서 수행되었습니다. 서로 다른 뉴클레오티드가 없거나 존재하는 경우 LD555(공여체) 및/또는 LD655(수용체) 표지된 ATL1세포 분자의 대표 이미지는 그림 2A-C에 나와 있습니다. 개별 입자에 대한 두 형광단의 형광 강도를 기록하고 전형적인 단일 분자 특징...

토론

FRET 기술은 두 가지 형광 염료(공여체 및 수용체) 간의 에너지 전달을 기반으로 합니다. 서로 근접한 경우(보통 1-10nm), 여기된 공여자는 에너지를 수용체로 전달하여 공여자의 형광 강도를 감소시키고 수용체의 형광 강도를 증가시킵니다.

smFRET 실험에서 분자는 매우 낮은 농도로 희석되고 슬라이드에 고정되며, 개별 분자의 FRET 신호는 TIRF 현미경으로 ...

공개

저자는 이해 상충이 없음을 선언합니다.

감사의 말

X.B.는 중국국립자연과학재단(32371287), 중앙대학 기초연구기금(63223043 및 63233053), 난카이 대학교 인재양성 프로젝트(035-BB042112)의 지원을 받고 있습니다. Y.L.은 중국 국립자연과학재단(12022409 및 T2221001)과 CAS Key Research Program of Frontier Sciences(ZDBS-LY-SLH015)의 지원을 받고 있습니다. L.M.은 중국 국립 자연 과학 재단(32271274 및 31770812)의 지원을 받습니다.

자료

NameCompanyCatalog NumberComments
10 K Centrifugal FiltersAmiconUFC901096
3-Aminopropyltriethoxysilane (APTES) Sigma-Aldrich440140
45 Ti rotor
532-nm laserOlympus
640-nm laserOlympus
7 K MWCO spin desalting columnsThermo Scientific89882
Adenosine 5-triphosphate disodium salt (ATP)Roche11140965001
Benzoic acidSigma-Aldrich242381
Biotin-PEG-SVA-5000Laysan Bio170-124
Biotinylated anti His antibodyBioss Antibodiesbs-0287R-bio
d-biotinSigma-AldrichB4501
EDTA-free protease inhibitor cocktailRoche11873580001
EMCCD cameraAndorIX897
Guanosine 5′-diphosphate sodium salt (GDP)Sigma-Aldrich G7127
Guanosine 5'-O-[gamma-thio]triphosphate (GTPγS)Roche10220647001
High numerical aperture oil immersion objectiveNikonNikon, 100x, N.A. 1.49, oil immersion
ImageJNIHhttps://imagej.net/ij/
Isopropyl-Β-D-ThiogalactosideSigma-AldrichI5502
LD555-MALLumidyne4
LD655-MALLumidyne10
L-glutamic acid potassiumSigma-AldrichG1501
Magnesium acetate tetrahydrateSigma-AldrichM0631
MatlabThe MathWorks, Natick, MAhttps://www.mathworks.com/
Microscope cover glassFisherbrand18834 (24 mm × 60 mm)
Microscope slidesCustomized, (75 mm × 26 mm × 1 mm) with 6 pairs of 1.2 mm diameter through holes
mPEG-SVA-5000Laysan Bio170-106
Ni Sepharose 6 Fast FlowCytiva17531802
OriginOrigin softwarehttps://www.originlab.com/
Polystyrene particlesQDSphereAG1265
Protocatechuate 3,4-dioxygenaseSigma-AldrichP8279
StreptavidinSangon BiotechA610492
Superdex 200 Increase (10/300 GL)Cytiva28990944
TIRF microscopeNikonTi2
Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride (TCEP)Thermo75259

참고문헌

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