JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

تضع هذه الدراسة مجموعة من إجراءات التشغيل القياسية (SOPs) لفحص وعزل البكتيريا المعوية القادرة على شق C-glycosides.

Abstract

توجد جليكوزيدات C بشكل شائع في النباتات الطبية وتظهر تنوعا هيكليا واسعا إلى جانب العديد من الأنشطة الحيوية ، بما في ذلك الأنشطة المضادة للبكتيريا والمضادة للالتهابات والفيروسات ومضادات الأكسدة ومضادات الأورام. في C-glycosides ، يرتبط الكربون الشاذ لجزء السكر مباشرة بمادة aglycone من خلال رابطة الكربون والكربون. بالمقارنة مع O-glycosides ، فإن C-glycosides مستقرة هيكليا ومقاومة للأحماض والإنزيمات. وبالتالي ، فهي عادة ما تكون غير قابلة للكسر ، مما يؤدي إلى ضعف الامتصاص وانخفاض التوافر البيولوجي. ومن المثير للاهتمام أن بعض البكتيريا المعوية يمكن أن تشق الروابط الجليكوسيدية C-C ، مما يوفر نهجا بيولوجيا محددا وصديقا للبيئة لتحلل C-glycosides. في هذه الدراسة ، تم تطوير مجموعة من إجراءات التشغيل القياسية (SOPs) لفحص البكتيريا المعوية القادرة على شق الروابط الجليكوسيدية C-C بناء على نموذج التحول الأحيائي للمركبات الطبيعية. وتشمل الإجراءات التشغيلية الموحدة إعداد وإثراء البكتيريا المعوية، والفحص الموجه نحو النشاط، والتحقق من صحة النشاط في وسط منخفض المصدر الكربوني. توفر هذه المنهجية مرجعا أساسيا للباحثين الذين يهدفون إلى عزل ودراسة هذه البكتيريا الوظيفية المتخصصة.

Introduction

C-glycosides هي مجموعة من المركبات التي تتميز بالارتباط المباشر لمجموعات الجليكوسيل بالأجليكونات من خلال روابطC-C 1. في الطبيعة ، يتم تحديد أورينتين ، وفيتكسين ، وبورارين ، ومشتقاتها بشكل شائع على أنها C-glycosides2. توجد هذه المركبات بشكل متكرر في النباتات الطبية مثل Trollius chinensis3 وفي مثل Styela plicata4. أظهرت الدراسات أن هذه المركبات توفر فوائد صحية وتظهر أنشطة حيوية مختلفة ، بما في ذلك مضادات البكتيريا5،6،7 ، ومضادة للالتهابات8،9،10،11،12 ، ومضادة للفيروسات3،12،13 ، ومضادات الأكسدة14،15،16 ، و الأنشطة المضادة للأورام17.

نظرا لارتباط مجموعات الجليكوسيل بالهيكل العظمي من خلال روابط C-C ، تظهر هذه المركبات ثباتا عاليا ومقاومة للتحلل المائي الحمضي والأنزيمي18 ، مما يؤدي إلى ضعف الامتصاص وانخفاض التوافر البيولوجي19. يؤثر هذا القيد على تطوير واستخدام جليكوسيدات. ومع ذلك ، فإن الأدوية التي تحتوي على C-glycosides ، والتي غالبا ما يتم تناولها عن طريق الفم ، يتم إزالة الجليكوزيلات بواسطة إنزيمات معينة ، مما ينتج عنه أكثر فعالية من الغليكونات النشطةبيولوجيا 20،21،22،23. في حين أن إنزيمات المضيف الخاصة غير قادرة على إزالة جليكوسيدات C ، فقد تم الإبلاغ عن أن البكتيريا المعوية تستقلب أنواعا معينة. على سبيل المثال ، تقوم بعض البكتيريا المعوية بتحويل المانجيفيرين إلى نوراثيريول ، والذي يظهر فاعلية أكبر كعامل مضاد لمرض السكري أو مضاد للأورام24. على الرغم من هذه النتائج ، تم تمييز عدد محدود فقط من البكتيريا القادرة على شق جليكوسيدات C ، ولا تزال الآليات الأساسية غير مفهومة جيدا. سيؤدي الفحص الفعال والموحد لهذه البكتيريا إلى تعزيز فهم وظائفها وتسريع تطور C-glycosides.

تم تطوير طريقة الغربلة وتحسينها بمرور الوقت لتصبح نظاما ناضجا. تشمل النهج الأساسية الإثراء ، والفحص الموجه نحو النشاط ، والتحقق من صحة النشاط في وسائط المصدر منخفضة الكربون. تسهل هذه الطريقة عزل السلالات المستهدفة النقية ، بالإضافة إلى تحديد الأنواع والبيانات الجينومية وسمات الكائنات الحية الدقيقة المستهدفة. باستخدام هذا النظام ، يمكن فحص البكتيريا المعوية القادرة على شق C-glycosides وعزلها بشكل فعال.

Protocol

التزمت التجارب التي أجريت بلوائح احتواء السلامة البيولوجية المحلية والوطنية والدولية المناسبة لمخاطر السلامة البيولوجية المحددة المرتبطة بكل سلالة. تم جمع عينات البراز من متطوعين أصحاء لم يتناولوا أي أدوية لمدة أسبوع واحد على الأقل. وترد تفاصيل الكواشف والمعدات المستخدمة في جدول المواد.

1. بناء نموذج التحول البكتيري المعوي البشري في المختبر

  1. تحضير الوسط اللاهوائي العام (GAM)25
    1. تحضير الحل أ
      1. يمزج 10.0 جم من التربتون ، و 10.0 جم من البيبتون البروتيوز ، و 3.0 جم من بتون الصويا ، و 13.5 جم من مسحوق مصل الجهاز الهضمي ، و 1.2 جم من مسحوق مستخلص الكبد ، و 2.2 جم من مستخلص اللحم البقري ، و 5.0 جم من مستخلص الخميرة في قارورة إرلينماير سعة 500 مل.
      2. أضف 500 مل من الماء المقطر وحركه تحت التسخين حتى تذوب المواد تماما.
    2. تحضير الحل ب
      1. قم بإعداد المحلول B باتباع نفس الإجراء مثل المحلول أ ، باستثناء الجمع بين 3.0 جم من الجلوكوز ، و 5.0 جم من النشا القابل للذوبان ، و 2.5 جم من فوسفات الهيدروجين ثنائي البوتاسيوم ، و 3.0 جم من كلوريد الصوديوم في قارورة إرلينماير سعة 250 مل.
    3. تحضير المحلول ج
      1. قم بإعداد المحلول C باتباع نفس الإجراء مثل المحاليل A و B ، باستثناء الجمع بين 0.3 جم من L-cysteine hydrochloride و 0.3 جم من ثيوغليكولات الصوديوم في قارورة Erlenmeyer سعة 100 مل.
      2. امزج جميع المحاليل الثلاثة في قارورة Erlenmeyer سعة 1000 مل ، واضبط الرقم الهيدروجيني على 7.2 باستخدام محلول هيدروكسيد الصوديوم بنسبة 10٪ ، وأضف الماء المقطر لتكوين الحجم النهائي البالغ 1000 مل.
      3. وزعي الوسط على 250 مل من قوارير Erlenmeyer والأوتوكلاف عند 121 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. تبرد إلى درجة حرارة الغرفة وتخزن في 4 درجات مئوية.
    4. تحضير وسط لاهوائي عام صلب
      1. أضف 1٪ -2٪ أجار إلى وسط سائل GAM وسخنه حتى يذوب تماما. وزعيها على 250 مل من قوارير Erlenmeyer والأوتوكلاف عند 121 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
    5. تحضير وسط مصدر منخفض الكربون
      1. قم بإعداد وسط المصدر منخفض الكربون باستخدام نفس الإجراء مثل GAM ، ولكن احذف مستخلص الخميرة والجلوكوز والنشا القابل للذوبان.
  2. تحضير الفلورا المعوية البشرية المختلطة
    1. اجمع 1-2 جم من البراز البشري الطازج في أنبوب تجميع براز معقم يمكن التخلص منه مملوء بغاز النيتروجين. أغلق الأنبوب على الفور. أضف 5 مل من وسط GAM ، وختم ، وزراعة عند 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة في حاضنة لاهوائية معقمة.
      ملاحظة: استخدم مقياس الأكسجين لمراقبة مستويات الأكسجين في الحاضنة اللاهوائية ، واستبدال غاز النيتروجين حسب الضرورة للحفاظ على الظروف اللاهوائية.
  3. تنشيط الفلورا المعوية البشرية المختلطة
    1. بعد 24 ساعة ، انقل 0.5 مل من المعلق البكتيري المعوي البشري إلى أنبوب طرد مركزي دقيق جديد يحتوي على 4.5 مل من وسط GAM الطازج.
    2. ختم واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة في ظل الظروف اللاهوائية للحصول على الفلورا المعوية البشرية المختلطة النشطة.
  4. إعداد الحلول المرجعية
    1. يزن 5 ملغ لكل من أورينتين ولوتولين ، ويذوب بشكل منفصل في 1 مل من DMSO لتحضير المحاليل المرجعية أورينتين واللوتولين بتركيز 5 مجم / مل.
  5. فحص الفلورا المعوية النشطة القادرة على شق جليكوزيدات C
    1. امزج 260 ميكرولتر من الفلورا المعوية المنشطة مع 6 مل من وسط المصدر الطازج منخفض الكربون الذي يحتوي على 40 ميكرولتر من محلول أورينتين المرجعي ، واحتضانه عند 37 درجة مئوية.
    2. قم بتضمين مجموعة تحكم (6 مل من وسط المصدر منخفض الكربون ، و 40 ميكرولتر من المحلول المرجعي للشرق ، و 260 ميكرولتر من المحلول الملحي العادي) ومجموعة فارغة (6 مل من وسط المصدر منخفض الكربون ، و 40 ميكرولتر من المحلول الملحي العادي ، و 260 ميكرولتر من الفلورا المعوية المنشطة).
      ملاحظة: قم بإجراء جميع الاختبارات ثلاث نسخ في حاضنة لاهوائية.
  6. المعالجة المسبقة لحلول التحويل
    1. بعد 24 ساعة و48 ساعة، ضع الماصة 1 مل من محاليل التفاعل في أنابيب طرد مركزي دقيقة سعة 1.5 مل وأجهزة طرد مركزي بسعة 13,400 × جم لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة لإزالة البكتيريا.
    2. أضف 200 ميكرولتر من المادة الطافية إلى 600 ميكرولتر من الميثانول ، واخلطها وأجهزة الطرد المركزي عند 13,400 × جم لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة لإزالة البروتينات.
  7. الكشف عن منتجات التحول
    1. قم بتصفية المادة الطافية باستخدام غشاء صغير يسهل اختراقه 0.22 ميكرومتر وتحليل المرشح عبر كروماتوغرافيا سائلة عالية الأداء (HPLC). إجراء تحليل HPLC على أداة مجهزة بعمود C18 (4.6 مم × 250 مم ، 5 ميكرومتر).
    2. حافظ على درجة حرارة الفرن العمودي عند 40 درجة مئوية ، بمعدل تدفق 1 مل / دقيقة. استخدم الأسيتونيتريل كمرحلة متحركة أ وحمض فورميك 0.1٪ في الماء النقي كمرحلة ب متنقلة.
      ملاحظة: استخدم نظام التدرج الخطي على النحو التالي: 5٪ -55٪ A في 0-20 دقيقة ، 55٪ -95٪ A في 20-25 دقيقة ، 95٪ -5٪ A في 25-30 دقيقة ، و 5٪ A في 30-32 دقيقة.

2. عزل السلالات المفردة من الفلورا البكتيرية المعوية البشرية

  1. تنشيط الفلورا البكتيرية المعوية البشرية المختلطة
    1. قم بتنشيط الفلورا البكتيرية المعوية البشرية المختلطة القادرة على شق الشرق، كما هو موضح في الخطوة 1.3، للحصول على محلول الفلورا البكتيرية المعوية البشرية المنشط.
  2. تحضير ألواح GAM الصلبة
    1. قم بإذابة وسط GAM الصلب المحضر عن طريق التسخين ، واسكبه في أطباق بتري معقمة يمكن التخلص منها في حاضنة لاهوائية. اسمح للوسيط بالتصلب لإعداد ألواح GAM الصلبة.
  3. الفحص الأولي لسلالات مفردة من الفلورا البكتيرية المعوية البشرية
    1. ماصة 100 ميكرولتر من المحلول البكتيري المنشط في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 مل يحتوي على 1 مل من المحلول الملحي العادي.
    2. قم بتلقيح حجم مناسب من المحلول البكتيري على طبق بتري باستخدام حلقة تلقيح يمكن التخلص منها. أغلق الطبق واحتضنه في حاضنة لاهوائية.
  4. مراقبة مورفولوجيا المستعمرة
    1. بعد 48 ساعة من الحضانة عند 37 درجة مئوية ، لاحظ حجم وتشكل ولون المستعمرات على اللوحة.
  5. اختيار المستعمرات الفردية للحصول على سلالات واحدة
    1. حدد مستعمرات بكتيرية مفردة مميزة وزرعها في أنابيب طرد مركزي دقيقة سعة 10 مل تحتوي على 4.5 مل من وسط GAM الطازج. احتضان في ظل ظروف لاهوائية عند 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة للحصول على سلالات مفردة.
  6. التحقق من نشاط السلالة الفردية
    1. تحقق من نشاط السلالات المفردة كما هو موضح في الخطوات 1.5 و 1.6 و 1.7. قم بإجراء التحقق من النشاط باستخدام الكروماتوغرافيا السائلة عالية الأداء (HPLC) ووضع علامات على اللوحة25.
  7. تنقية السلالات المفردة من الفلورا البكتيرية المعوية البشرية
    1. قم بتنقية السلالة المفردة النشطة كما هو موضح في الخطوة 2.1. تحقق من نشاطها من خلال تجارب التحويل مع orientin ، باتباع الإجراءات الموضحة في الخطوات 1.5 و 1.6 و 1.7.

النتائج

تم فحص عينات البراز من عشرة متطوعين أصحاء باستخدام تجارب التحويل ، مما أدى إلى عينة واحدة تظهر نشاطا في إزالة الجليكوزيل أورينتين. أكدت هذه النتيجة جدوى فحص العينات النشطة. تم عزل العينة النشطة باستخدام طريقة تعليم اللوحة. بناء على مورفولوجيا وخصائص المستعمرات ، تم اختي...

Discussion

تم وضع إجراء التشغيل القياسي (SOP) لفحص البكتيريا المعوية البشرية القادرة على شق C-glycosides. باستخدام هذه الإجراءات ، تم الحصول على سلالة نشطة نقية بنجاح ، وتم تأكيد خاصية إزالة الجليكوزيلات من خلال اختبارات التحول. يتكون الإجراء التشغيلي الموحد من تحضير وإثراء البكتيريا الم...

Disclosures

يعلن أصحاب البلاغ عدم وجود تضارب في المصالح.

Acknowledgements

تم دعم العمل من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين 82374134.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
AcetonitrileThermo Fisher ScientificF2408R205HPLC
Anaerobic IncubatorShanghai CIMO Medical Instrument Manufacturing Co., LTDYQX- II
Beef ExtractBeijing Abxing Biotechnology Co., LTD01-009BR
Digestive Serum PowderBeijing Abxing Biotechnology Co., LTD01-087BR
Dipotassium Hydrogen PhosphateBeijing Chemical WorksM26298AR
Disposable Sterile Stool Collection TubeLang Fu Co., LTD5 mL
Distilled WaterDepartment of Biopharmaceutical, Beijing University of Traditional Chinese Medicine
DMSOSigma-Aldrich CorporationWXBD2861VAR
EP TubeBeijing Biodee Biotechnology Co., LTD10 mL/1.5 mL
Eppendorf CentrifugeEppendorf AG5418
GlucoseBeijing Chemical WorksGC205003AR
High Performance Liquid ChromatographShimadzu CorporationLC-20
High-pressure Steam SterilizerSanyo Denki Shanghai Co., LTDMLS-3780
Innoval C18 Chromatographic ColumnAgela Technologies Co., LTD4.6 mm × 250 mm, 5 µm
L-cysteine HydrochlorideBeijing Abxing Biotechnology Co., LTDBGASY01BR
Liver Extract PowderBeijing Abxing Biotechnology Co., LTD01-085BR
LuteolinNational Institutes for Food and Drug Control>98%
Magnetic StirrerIka Werke Co., LTDRCT basic
MethanolThermo Fisher Scientific20240901312AR
Millipore Filter MembraneSangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.0.22 µL × 50 mm
OrientinYishiming (Beijing) Biotechnology Co., LTD19120601>98%
PeptoneBeijing Abxing Biotechnology Co., LTD1685787BR
Petri DishBeijing Biodee Biotechnology Co., LTD150 mm
Sodium ChlorideBeijing Abxing Biotechnology Co., LTDBN20008AR
Sodium ThioglycolateShanghai Jianglai Biotechnology Co., LTDJ031S219019AR
Soluble StarchBeijing Abxing Biotechnology Co., LTDS9765BR
Soya PeptoneBeijing Abxing Biotechnology Co., LTD2147955BR
TryptoneAgela Technologies Co., LTD1685787BR
Ultrasonic CleanerKun Shan Ultrasonic Instruments Co., LTDKQ-500DE
Yeast ExtractBeijing Abxing Biotechnology Co., LTD01-014BR

References

  1. Zhang, Y. Q., Zhang, M., Wang, Z. L., Qiao, X., Ye, M. Advances in plant-derived C-glycosides: phytochemistry, bioactivities, and biotechnological production. Biotechnol Adv. 60, 108030 (2022).
  2. Franz, G., Grun, M. Chemistry, occurrence and biosynthesis of C-glycosyl compounds in plants. Planta Med. 47 (3), 131-140 (1983).
  3. Cai, S., et al. Antiviral flavonoid-type C-glycosides from the flowers of Trollius chinensis. Chem Biodivers. 3 (3), 343-348 (2006).
  4. Shi, X., et al. A flavone C-glycoside from Styela plicata. Biochem Syst Ecol. 86, 103924 (2019).
  5. Xiao, J., Capanoglu, E., Jassbi, A. R., Miron, A. Advance on the flavonoid C-glycosides and health benefits. Crit Rev Food Sci Nutr. 56 (Suppl 1), S29-S45 (2016).
  6. Ma, R., Cheng, S., Sun, J., Zhu, W., Fu, P. Antibacterial gilvocarcin-type aryl-C-glycosides from a soil-derived Streptomyces species. J Nat Prod. 85 (10), 2282-2289 (2022).
  7. Le Dang, Q., et al. Desmodinosides A-E: New flavonoid C-glycosides from Desmodium heterocarpon var. stigosum with hepatoprotective and antifungal activity. Fitoterapia. 169, 105609 (2023).
  8. Choi, J. S., et al. Effects of C-glycosylation on antidiabetic, anti-Alzheimers disease and anti-inflammatory potential of apigenin. Food Chem Toxicol. 64, 27-33 (2014).
  9. Courts, F. L., Williamson, G. The occurrence, fate and biological activities of C-glycosyl flavonoids in the human diet. Crit Rev Food Sci Nutr. 55 (10), 1352-1367 (2015).
  10. Thao, N. P., et al. Anti-inflammatory flavonoid C-glycosides from Piper aduncum leaves. Planta Med. 82 (17), 1475-1481 (2016).
  11. Kim, M. K., Yun, K. J., Lim, D. H., Kim, J., Jang, Y. P. Anti-inflammatory properties of flavone di-C-glycosides as active principles of camellia mistletoe, Korthalsella japonica. Biomol Ther (Seoul). 24 (6), 630-637 (2016).
  12. Chen, Y. L., Chen, C. Y., Lai, K. H., Chang, Y. C., Hwang, T. L. Anti-inflammatory and antiviral activities of flavone C-glycosides of Lophatherum gracile for COVID-19. J Funct Foods. 101, 105407 (2023).
  13. Wang, Y., et al. Flavone C-glycosides from the leaves of Lophatherum gracile and their in vitro antiviral activity. Planta Med. 78 (1), 46-51 (2012).
  14. Devkota, H. P., Fukusako, K., Ishiguro, K., Yahara, S. Flavone C-glycosides from Lychnis senno and their antioxidative activity. Nat Prod Commun. 8 (10), 1413-1414 (2013).
  15. Stark, T. D., et al. Isolation and structure elucidation of highly antioxidative 3,8-linked biflavanones and flavanone-C-glycosides from Garcinia buchananii bark. J Agric Food Chem. 60 (8), 2053-2062 (2012).
  16. Stark, T. D., Germann, D., Balemba, O. B., Wakamatsu, J., Hofmann, T. New highly in vitro antioxidative 3,8-linked biflav(an)ones and flavanone-C-glycosides from Garcinia buchananii stem bark. J Agric Food Chem. 61 (51), 12572-12581 (2013).
  17. Xiao, J., Capanoglu, E., Jassbi, A. R., Miron, A. Advance on the flavonoid C-glycosides and health benefits. Crit Rev Food Sci Nutr. 56 (Suppl 1), 29-45 (2016).
  18. Xie, K., Zhang, X., Sui, S., Ye, F., Dai, J. Exploring and applying the substrate promiscuity of a C-glycosyltransferase in the chemo-enzymatic synthesis of bioactive C-glycosides. Nat Commun. 11 (1), 5162 (2020).
  19. Liu, L., et al. Characterization of the intestinal absorption of seven flavonoids from the flowers of Trollius chinensis using the Caco-2 cell monolayer model. PLoS One. 10 (3), e0119263 (2015).
  20. Xu, M., et al. Mechanism and application of microbial transformation of glycosides in traditional Chinese medicine. World Sci Technol. 2, 24-27 (2006).
  21. Xie, L., et al. Comparison of flavonoid O-glycoside, C-glycoside and their aglycones on antioxidant capacity and metabolism during in vitro digestion and in vivo. Foods. 11 (6), 882 (2022).
  22. Hostetler, G. L., Ralston, R. A., Schwartz, S. J. Flavones: Food sources, bioavailability, metabolism, and bioactivity. Adv Nutr. 8 (3), 423-435 (2017).
  23. Xiao, J. Dietary flavonoid aglycones and their glycosides: which show better biological significance. Crit Rev Food Sci Nutr. 57 (9), 1874-1905 (2017).
  24. Hasanah, U., Miki, K., Nitoda, T., Kanzaki, H. Aerobic bioconversion of C-glycoside mangiferin into its aglycone norathyriol by an isolated mouse intestinal bacterium. Biosci Biotechnol Biochem. 85 (4), 989-997 (2021).
  25. Yang, X., Xu, W. Establishment of model and standard operation procedure for biotransformation of chemical constituents of traditional Chinese medicine by human intestinal bacteria. China J Chin Mater Med. 36 (1), 19-26 (2011).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

C

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved