Screening und Isolierung von C-Glykosid-spaltenden Darmbakterien

Zusammenfassung

Diese Studie etabliert eine Reihe von Standardarbeitsanweisungen (SOPs) für das effiziente Screening und die Isolierung von Darmbakterien, die in der Lage sind, C-Glykoside zu spalten.

Zusammenfassung

C-Glykoside kommen häufig in Heilpflanzen vor und weisen eine umfangreiche strukturelle Vielfalt sowie verschiedene Bioaktivitäten auf, darunter antibakterielle, entzündungshemmende, antivirale, antioxidative und antineoplastische Aktivitäten. In C-Glykosiden ist der anomere Kohlenstoff des Zuckeranteils durch Kohlenstoff-Kohlenstoff-Bindungen direkt mit einem Aglykon verbunden. Im Vergleich zu O-Glykoside sind C-Glykoside strukturstabil und resistent gegen Säuren und Enzyme. Folglich sind sie in der Regel unzerbrechlich, was zu einer schlechten Absorptionsfähigkeit und einer geringen Bioverfügbarkeit führt. Interessanterweise können einige Darmbakterien C-C-glykosidische Bindungen spalten, was einen spezifischen und umweltfreundlichen biologischen Ansatz zum Abbau von C-Glykoside bietet. In dieser Studie wurde eine Reihe von Standardarbeitsanweisungen (SOPs) für das Screening von Darmbakterien entwickelt, die in der Lage sind, C-C-glykosidische Bindungen zu spalten, basierend auf dem Biotransformationsmodell von Naturstoffen. Die SOPs umfassen die Aufbereitung und Anreicherung von Darmbakterien, das aktivitätsorientierte Screening und die Aktivitätsvalidierung in einem kohlenstoffarmen Ausgangsmedium. Diese Methodik bietet eine grundlegende Referenz für Forscher, die diese spezialisierten funktionellen Bakterien isolieren und untersuchen möchten.

Einleitung

C-Glykoside sind eine Gruppe von Verbindungen, die durch die direkte Bindung von Glykosylgruppen an Aglykone durch C-C-Bindungen^{gekennzeichnet sind 1}. In der Natur werden Orientin, Vitexin, Puerarin und ihre Derivate allgemein als C-Glykoside² bezeichnet. Diese Verbindungen kommen häufig in Heilpflanzen wie Trollius chinensis³ und in Tieren wie Styela plicata⁴ vor. Studien haben gezeigt, dass diese Verbindungen gesundheitliche Vorteile bieten und verschiedene Bioaktivitäten aufweisen, darunter antibakteriell ^5,6,7, entzündungshemmend ^8,9,10,11,12, antiviral ^3,12,13, antioxidans 14,15,16 und Antineoplastische Tätigkeiten¹⁷.

Aufgrund der Bindung von Glykosylgruppen an das Skelett durch C-C-Bindungen weisen diese Verbindungen eine hohe Stabilität und Beständigkeit gegen saure und enzymatische Hydrolyse^{auf 18}, was zu einer schlechten Resorbierbarkeit und geringen Bioverfügbarkeit^{führt 19}. Diese Einschränkung wirkt sich auf die Entwicklung und Verwertung von C-Glykosiden aus. Arzneimittel, die C-Glykoside enthalten und häufig oral verabreicht werden, werden jedoch durch spezifische Enzyme deglykosyliert, wodurch wirksamere bioaktive Aglykone produziert^werden 20,21,22,23. Während die wirtseigenen Enzyme nicht in der Lage sind, C-Glykoside zu deglykosylieren, wurde berichtet, dass Darmbakterien bestimmte Typen metabolisieren. Zum Beispiel wandeln einige Darmbakterien Mangiferin in Norathyriol um, das eine größere Wirksamkeit als Antidiabetikum oder antineoplastisches Mittel aufweist²⁴. Trotz dieser Ergebnisse wurde nur eine begrenzte Anzahl von Bakterien charakterisiert, die in der Lage sind, C-Glykoside zu spalten, und die zugrunde liegenden Mechanismen sind nach wie vor wenig verstanden. Ein effizientes und standardisiertes Screening dieser Bakterien wird das Verständnis ihrer Funktionen verbessern und die Entwicklung von C-Glykosiden beschleunigen.

Das Screening-Verfahren wurde im Laufe der Zeit zu einem ausgereiften System weiterentwickelt und verfeinert. Zu den Kernansätzen gehören die Anreicherung, das aktivitätsorientierte Screening und die Aktivitätsvalidierung in kohlenstoffarmen Ausgangsmedien. Diese Methode ermöglicht die Isolierung reiner Zielstämme sowie die Identifizierung von Spezies, genomischen Daten und Merkmalen von Zielmikroorganismen. Mit diesem System können Darmbakterien, die in der Lage sind, C-Glykoside zu spalten, effektiv gescreent und isoliert werden.

Protokoll

Die durchgeführten Experimente entsprachen den lokalen, nationalen und internationalen Vorschriften zur Eindämmung der biologischen Sicherheit, die den spezifischen Gefahren für die biologische Sicherheit des jeweiligen Stammes angemessen sind. Kotproben wurden von gesunden Freiwilligen gesammelt, die seit mindestens einer Woche keine Medikamente mehr eingenommen hatten. Einzelheiten zu den verwendeten Reagenzien und Geräten finden Sie in der Materialtabelle.

1. Aufbau eines humanen intestinalen bakteriellen Transformationsmodells in vitro

1. Herstellung von allgemeinem anaerobem Medium (GAM)²⁵
   1. Zubereitung von Lösung A
      1. Kombinieren Sie 10,0 g Trypton, 10,0 g Proteose-Pepton, 3,0 g Soja-Pepton, 13,5 g Verdauungsserumpulver, 1,2 g Leberextraktpulver, 2,2 g Rindfleischextrakt und 5,0 g Hefeextrakt in einem 500-ml-Erlenmeyerkolben.
      2. Fügen Sie 500 mL destilliertes Wasser hinzu und rühren Sie unter Hitze, bis sich die Substanzen vollständig aufgelöst haben.
   2. Zubereitung von Lösung B
      1. Lösung B wird nach dem gleichen Verfahren wie Lösung A hergestellt, mit der Ausnahme, dass 3,0 g Glukose, 5,0 g lösliche Stärke, 2,5 g Dikaliumhydrogenphosphat und 3,0 g Natriumchlorid in einem 250-ml-Erlenmeyerkolben kombiniert werden.
   3. Zubereitung von Lösung C
      1. Lösung C wird nach dem gleichen Verfahren wie die Lösungen A und B hergestellt, mit der Ausnahme, dass 0,3 g L-Cysteinhydrochlorid und 0,3 g Natriumthioglykolat in einem 100-ml-Erlenmeyerkolben kombiniert werden.
      2. Mischen Sie alle drei Lösungen in einem 1000-ml-Erlenmeyerkolben, stellen Sie den pH-Wert mit einer 10%igen Natronlauge auf 7,2 ein und fügen Sie destilliertes Wasser hinzu, um ein Endvolumen von 1000 mL zu erhalten.
      3. Das Medium in 250 mL Erlenmeyerkolben verteilen und 30 min bei 121 °C autoklavieren. Auf Raumtemperatur abkühlen und bei 4 °C lagern.
   4. Aufbereitung von festem allgemeinem anaerobem Medium
      1. Geben Sie 1%-2% Agar in das flüssige GAM-Medium und erhitzen Sie, bis es sich vollständig aufgelöst hat. In 250 mL Erlenmeyerkolben abfüllen und 30 min bei 121 °C autoklavieren.
   5. Aufbereitung eines kohlenstoffarmen Ausgangsmediums
      1. Bereiten Sie das kohlenstoffarme Ausgangsmedium nach dem gleichen Verfahren wie GAM vor, lassen Sie jedoch Hefeextrakt, Glukose und lösliche Stärke weg.
2. Aufbereitung der gemischten menschlichen Darmflora
   1. Sammeln Sie 1-2 g frischen menschlichen Kot in einem sterilen Einweg-Stuhlsammelröhrchen, das mit Stickstoffgas gefüllt ist. Verschließen Sie das Rohr rechtzeitig. 5 ml GAM-Medium zugeben, versiegeln und 24 Stunden lang bei 37 °C in einem sterilen anaeroben Inkubator kultivieren.
      HINWEIS: Verwenden Sie ein Sauerstoffmessgerät, um den Sauerstoffgehalt des anaeroben Inkubators zu überwachen, und ersetzen Sie das Stickstoffgas bei Bedarf, um die anaeroben Bedingungen aufrechtzuerhalten.
3. Aktivierung der gemischten menschlichen Darmflora
   1. Nach 24 Stunden werden 0,5 ml der menschlichen Darmbakteriensuspension in ein neues Mikrozentrifugenröhrchen mit 4,5 ml frischem GAM-Medium überführt.
   2. Versiegeln und 24 h unter anaeroben Bedingungen bei 37 °C inkubieren, um eine aktive gemischte menschliche Darmflora zu erhalten.
4. Erstellung von Referenzlösungen
   1. Wiegen Sie jeweils 5 mg Orientin und Luteolin und lösen Sie sie separat in 1 ml DMSO auf, um Orientin und Luteolin-Referenzlösungen in einer Konzentration von 5 mg/ml herzustellen.
5. Screening einer aktiven Darmflora, die in der Lage ist, C-Glykoside zu spalten
   1. 260 μl aktivierte Darmflora mit 6 ml frischem kohlenstoffarmem Ausgangsmedium mit 40 μl Orientin-Referenzlösung mischen und bei 37 °C inkubieren.
   2. Einschließen Sie eine Kontrollgruppe (6 mL kohlenstoffarmes Ausgangsmedium, 40 μl Orientin-Referenzlösung und 260 μl normale Kochsalzlösung) und eine Blindgruppe (6 mL kohlenstoffarmes Ausgangsmedium, 40 μl normale Kochsalzlösung und 260 μl aktivierte Darmflora).
      HINWEIS: Führen Sie alle Tests in dreifacher Ausfertigung in einem anaeroben Inkubator durch.
6. Vorbehandlung von Transformationslösungen
   1. Nach 24 h und 48 h 1 mL der Reaktionslösungen in 1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen pipettieren und bei 13.400 x g für 15 min bei Raumtemperatur zentrifugieren, um Bakterien zu entfernen.
   2. 200 μl des Überstands zu 600 μl Methanol geben, mischen und 15 Minuten lang bei Raumtemperatur bei 13.400 x g zentrifugieren, um Proteine zu entfernen.
7. Detektion von Transformationsprodukten
   1. Filtrieren Sie den Überstand mit einer 0,22 μm mikroporösen Membran und analysieren Sie das Filtrat mittels Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC). Führen Sie die HPLC-Analyse an einem Gerät durch, das mit einer C_18-Säule (4,6 mm × 250 mm, 5 μm) ausgestattet ist.
   2. Halten Sie die Temperatur des Säulenofens bei 40 °C und einer Durchflussrate von 1 mL/min. Verwenden Sie Acetonitril als mobile Phase A und 0,1 % Ameisensäure in gereinigtem Wasser als mobile Phase B.
      HINWEIS: Verwenden Sie ein lineares Gradientensystem wie folgt: 5%-55% A bei 0-20 min, 55%-95% A bei 20-25 min, 95%-5% A bei 25-30 min und 5% A bei 30-32 min.

2. Isolierung einzelner Stämme aus der bakteriellen Darmflora des Menschen

1. Aktivierung der gemischten bakteriellen Darmflora des Menschen
   1. Aktivieren Sie die gemischte menschliche Darmbakterienflora, die in der Lage ist, Orientin zu spalten, wie in Schritt 1.3 beschrieben, um die aktivierte Lösung der menschlichen Darmbakterienflora zu erhalten.
2. Vorbereitung von massiven GAM-Platten
   1. Das vorbereitete feste GAM-Medium wird durch Erhitzen aufgelöst und in sterile Einweg-Petrischalen in einem anaeroben Inkubator gegossen. Lassen Sie das Medium erstarren, um feste GAM-Platten herzustellen.
3. Vorläufiges Screening einzelner Stämme aus der menschlichen Darmbakterienflora
   1. Pipettieren Sie 100 μl der aktivierten Bakterienlösung in ein 1,5 ml-Mikrozentrifugenröhrchen, das 1 ml normale Kochsalzlösung enthält.
   2. Impfen Sie ein angemessenes Volumen der bakteriellen Lösung mit einem Einweg-Impfring auf eine Petrischale. Verschließen Sie die Schale und inkubieren Sie sie in einem anaeroben Inkubator.
4. Beobachtung der Morphologie der Kolonie
   1. Nach 48 Stunden Inkubation bei 37 °C ist die Größe, Morphologie und Farbe der Kolonien auf der Platte zu beobachten.
5. Selektion einzelner Völker zur Gewinnung einzelner Stämme
   1. Wählen Sie unterschiedliche einzelne Bakterienkolonien aus und kultivieren Sie sie in 10-ml-Mikrozentrifugenröhrchen mit 4,5 ml frischem GAM-Medium. Unter anaeroben Bedingungen bei 37 °C für 24 h inkubieren, um einzelne Stämme zu erhalten.
6. Nachweis der Einzeldehnungsaktivität
   1. Überprüfen Sie die Aktivität einzelner Stämme, wie in den Schritten 1.5, 1.6 und 1.7 beschrieben. Führen Sie eine Aktivitätsüberprüfung mit Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) und Plattenmarkierung^{durch 25}.
7. Reinigung einzelner Stämme aus der menschlichen Darmbakterienflora
   1. Reinigen Sie den aktiven Einzelstamm wie in Schritt 2.1 beschrieben. Überprüfen Sie seine Aktivität durch Transformationsexperimente mit Orientin gemäß den in den Schritten 1.5, 1.6 und 1.7 beschriebenen Verfahren.

Ergebnisse

Stuhlproben von zehn gesunden Probanden wurden mittels Transformationsexperimenten gescreent, was dazu führte, dass eine Probe Aktivität bei der Deglykosylierung von Orientin zeigte. Dieser Befund bestätigte die Machbarkeit des Screenings auf aktive Proben. Die aktive Probe wurde mit der Plattenmarkierungsmethode isoliert. Basierend auf der Morphologie und den Eigenschaften der Kolonien wurden etwa 18 einzelne Bakterienkolonien mit gelber oder weißer Färbung, unterschiedlichen Forme...

Diskussion

Es wurden Standardarbeitsanweisungen (SOP) für das Screening menschlicher Darmbakterien festgelegt, die in der Lage sind, C-Glykoside zu spalten. Mit diesen Verfahren wurde erfolgreich ein reiner aktiver Stamm erhalten, dessen Deglykosylierungseigenschaft durch Transformationstests bestätigt wurde. Die SOP besteht aus der Aufbereitung und Anreicherung von Darmbakterien, dem aktivitätsorientierten Screening und der Aktivitätsvalidierung in einem kohlenstoffarmen Ausgangsmedium.

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetonitrile	Thermo Fisher Scientific	F2408R205	HPLC
Anaerobic Incubator	Shanghai CIMO Medical Instrument Manufacturing Co., LTD		YQX- II
Beef Extract	Beijing Abxing Biotechnology Co., LTD	01-009	BR
Digestive Serum Powder	Beijing Abxing Biotechnology Co., LTD	01-087	BR
Dipotassium Hydrogen Phosphate	Beijing Chemical Works	M26298	AR
Disposable Sterile Stool Collection Tube	Lang Fu Co., LTD		5 mL
Distilled Water	Department of Biopharmaceutical, Beijing University of Traditional Chinese Medicine
DMSO	Sigma-Aldrich Corporation	WXBD2861V	AR
EP Tube	Beijing Biodee Biotechnology Co., LTD		10 mL/1.5 mL
Eppendorf Centrifuge	Eppendorf AG		5418
Glucose	Beijing Chemical Works	GC205003	AR
High Performance Liquid Chromatograph	Shimadzu Corporation		LC-20
High-pressure Steam Sterilizer	Sanyo Denki Shanghai Co., LTD		MLS-3780
Innoval C18 Chromatographic Column	Agela Technologies Co., LTD		4.6 mm × 250 mm, 5 µm
L-cysteine Hydrochloride	Beijing Abxing Biotechnology Co., LTD	BGASY01	BR
Liver Extract Powder	Beijing Abxing Biotechnology Co., LTD	01-085	BR
Luteolin	National Institutes for Food and Drug Control		>98%
Magnetic Stirrer	Ika Werke Co., LTD		RCT basic
Methanol	Thermo Fisher Scientific	20240901312	AR
Millipore Filter Membrane	Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.		0.22 µL × 50 mm
Orientin	Yishiming (Beijing) Biotechnology Co., LTD	19120601	>98%
Peptone	Beijing Abxing Biotechnology Co., LTD	1685787	BR
Petri Dish	Beijing Biodee Biotechnology Co., LTD		150 mm
Sodium Chloride	Beijing Abxing Biotechnology Co., LTD	BN20008	AR
Sodium Thioglycolate	Shanghai Jianglai Biotechnology Co., LTD	J031S219019	AR
Soluble Starch	Beijing Abxing Biotechnology Co., LTD	S9765	BR
Soya Peptone	Beijing Abxing Biotechnology Co., LTD	2147955	BR
Tryptone	Agela Technologies Co., LTD	1685787	BR
Ultrasonic Cleaner	Kun Shan Ultrasonic Instruments Co., LTD		KQ-500DE
Yeast Extract	Beijing Abxing Biotechnology Co., LTD	01-014	BR