筛选和分离 C-糖苷裂解肠道细菌

摘要

本研究建立了一套标准作程序 （SOP），用于有效筛选和分离能够裂解 C-糖苷类的肠道细菌。

摘要

C-糖苷常见于药用植物中，表现出广泛的结构多样性以及各种生物活性，包括抗菌、抗炎、抗病毒、抗氧化和抗肿瘤活性。在 C-糖苷中，糖基团的异头碳通过碳-碳键直接连接到糖苷配基。与 O-糖苷相比，C-糖苷结构稳定，耐酸和酶。因此，它们通常是牢不可破的，导致吸收性差和生物利用度低。有趣的是，一些肠道细菌可以裂解 C-C 糖苷键，提供了一种特异性且环保的生物方法来降解 C-糖苷。在本研究中，基于天然化合物的生物转化模型，开发了一套标准作程序 （SOP），用于筛选能够裂解 C-C 糖苷键的肠道细菌。SOP 包括肠道细菌的制备和富集、以活性为导向的筛选以及在低碳源培养基中的活性验证。该方法为旨在分离和研究这些特殊功能细菌的研究人员提供了基础参考。

引言

C-糖苷是一组化合物，其特征是糖基通过 C-C 键与糖苷配基直接键合¹。在自然界中，荭草素、牡荆素、葛根素及其衍生物通常被鉴定为 C-糖苷²。这些化合物经常存在于药用植物（如 Trollius chinensis³）和动物（如 Styela plicata⁴）中。研究表明，这些化合物对健康有益，并表现出多种生物活性，包括抗菌 ^5,6,7、抗炎 ^{8,9,10,11,12、}抗病毒 ^3,12,13、抗氧化剂 14,15,16 和抗肿瘤活性¹⁷.

由于糖基通过 C-C 键与骨架连接，这些化合物表现出高稳定性和抗酸性和耐酶解^{性 18}，导致吸收性差和生物利用度低¹⁹。这种限制影响了 C-糖苷的开发和利用。然而，含有 C-糖苷类药物的药物（通常口服给药）被特定酶去糖基化，产生更有效的生物活性糖苷配基 20,21,22,23。虽然宿主自身的酶无法使 C-糖苷类物质去糖基化，但据报道肠道细菌会代谢某些类型。例如，一些肠道细菌将芒果苷转化为去甲甲状腺醇，后者作为抗糖尿病或抗肿瘤剂表现出更大的效力²⁴。尽管有这些发现，但只有有限数量的能够裂解 C-糖苷类的细菌被表征，并且其潜在机制仍然知之甚少。对这些细菌进行高效和标准化的筛选将增强对其功能的理解并加速 C-糖苷类药物的开发。

随着时间的推移，筛查方法已经发展和改进成一个成熟的系统。核心方法包括富集、面向活性的筛选和低碳源培养基中的活性验证。该方法有助于分离纯靶标菌株，以及鉴定靶微生物的物种、基因组数据和性状。使用该系统，可以有效地筛选和分离能够裂解 C-糖苷的肠道细菌。

研究方案

进行的实验遵守了适用于与每种菌株相关的特定生物安全危害的地方、国家和国际生物安全遏制法规。从至少一周未服用任何药物的健康志愿者身上收集粪便样本。 材料表中提供了所用试剂和设备的详细信息。

1. 体外构建人肠道细菌转化模型

1. 通用厌氧培养基 （GAM） 的制备²⁵
   1. 溶液 A 的制备
      1. 将 10.0 克胰蛋白胨、10.0 克蛋白胨、3.0 克大豆蛋白胨、13.5 克消化血清粉、1.2 克肝脏提取物粉、2.2 克牛肉提取物和 5.0 克酵母提取物混合在一个 500 mL 锥形瓶中。
      2. 加入 500 mL 蒸馏水，加热搅拌，直至物质完全溶解。
   2. 溶液 B 的制备
      1. 按照与溶液 A 相同的程序制备溶液 B，不同之处在于将 3.0 g 葡萄糖、5.0 g 可溶性淀粉、2.5 g 磷酸氢二钾和 3.0 g 氯化钠混合在 250 mL 锥形瓶中。
   3. 溶液 C 的制备
      1. 按照与溶液 A 和 B 相同的程序制备溶液 C，不同之处在于将 0.3 g L-半胱氨酸盐酸盐和 0.3 g 巯基乙酸钠混合在 100 mL 锥形瓶中。
      2. 在 1000 mL 锥形瓶中混合所有三种溶液，使用 10% 氢氧化钠溶液将 pH 值调节至 7.2，然后加入蒸馏水，使最终体积为 1000 mL。
      3. 将培养基分配到 250 mL 锥形瓶中，并在 121 °C 下高压灭菌 30 分钟。冷却至室温并在 4 °C 下储存。
   4. 固体一般厌氧培养基的制备
      1. 向 GAM 液体培养基中加入 1%-2% 琼脂，加热至完全溶解。分配到 250 mL 锥形瓶中，并在 121 °C 下高压灭菌 30 分钟。
   5. 低碳源培养基的制备
      1. 使用与 GAM 相同的程序制备低碳源培养基，但省略酵母提取物、葡萄糖和可溶性淀粉。
2. 混合人类肠道菌群的制备
   1. 在充满氮气的一次性无菌粪便收集管中收集 1-2 g 新鲜人粪便。立即密封试管。加入 5 mL GAM 培养基，密封，并在 37 °C 下在无菌厌氧培养箱中培养 24 小时。
      注意：使用氧气计监测厌氧培养箱的氧气水平，并根据需要更换氮气以维持厌氧条件。
3. 激活人类混合肠道菌群
   1. 24 小时后，将 0.5 mL 人肠道细菌悬浮液转移到含有 4.5 mL 新鲜 GAM 培养基的新微量离心管中。
   2. 密封并在厌氧条件下在 37 °C 下孵育 24 小时，以获得活性混合人肠道菌群。
4. 参考溶液的制备
   1. 称取荭草素和木犀草素各 5 mg，分别溶于 1 mL DMSO 中，制备浓度为 5 mg/mL 的荭草素和木犀草素参比溶液。
5. 筛选能够裂解 C-糖苷的活性肠道菌群
   1. 将 260 μL 活化的肠道菌群与 6 mL 含有 40 μL 荭草素参比溶液的新鲜低碳源培养基混合，并在 37 °C 下孵育。
   2. 包括一个对照组（6 mL 低碳源培养基、40 μL 辭脂素参比溶液和 260 μL 生理盐水）和一个空白组（6 mL 低碳源培养基、40 μL 生理盐水和 260 μL 活化肠道菌群）。
      注意：在厌氧培养箱中一式三份进行所有测试。
6. 转化液的预处理
   1. 24 小时和 48 小时后，将 1 mL 反应溶液移液到 1.5 mL 微量离心管中，并在室温下以 13,400 x g 离心 15 分钟以去除细菌。
   2. 将 200 μL 上清液加入 600 μL 甲醇中，混合，并在室温下以 13,400 x g 离心 15 分钟以去除蛋白质。
7. 转化产物检测
   1. 使用 0.22 μm 微孔膜过滤上清液， 并通过 高效液相色谱 （HPLC） 分析滤液。在配备 C₁₈ 色谱柱（4.6 mm × 250 mm、5 μm）的仪器上进行 HPLC 分析。
   2. 将柱温箱温度保持在 40 °C，流速为 1 mL/min。以乙腈为流动相 A，以 0.1% 甲酸的纯水溶液作为流动相 B。
      注：采用线性梯度系统如下：0-20 分钟时为 5%-55% A，20-25 分钟时为 55%-95% A，25-30 分钟时为 95%-5% A，30-32 分钟时为 5% A。

2. 从人肠道细菌菌群中分离单个菌株

1. 激活人类肠道混合菌群
   1. 如步骤 1.3 所述，激活能够裂解辜荭素的混合人肠道细菌菌群，以获得活化的人肠道细菌菌群溶液。
2. 固体 GAM 板的制备
   1. 通过加热溶解制备的固体 GAM 培养基，并将其倒入厌氧培养箱中的一次性无菌培养皿中。让培养基凝固以制备固体 GAM 板。
3. 从人肠道细菌菌群中初步筛选单个菌株
   1. 将 100 μL 活化的细菌溶液移液到含有 1 mL 生理盐水的 1.5 mL 微量离心管中。
   2. 使用一次性接种环将适当体积的细菌溶液接种到培养皿上。密封培养皿并在厌氧培养箱中孵育。
4. 菌落形态的观察
   1. 在 37 °C 下孵育 48 小时后，观察平板上菌落的大小、形态和颜色。
5. 选择单个菌落以获得单个菌株
   1. 选择不同的单个细菌菌落，并在含有 4.5 mL 新鲜 GAM 培养基的 10 mL 微量离心管中培养它们。在 37 °C 厌氧条件下孵育 24 小时以获得单个菌株。
6. 验证单菌株活性
   1. 如步骤 1.5、1.6 和 1.7 中所述验证单个菌株的活性。使用高效液相色谱 （HPLC） 和板标记²⁵ 进行活性验证。
7. 从人肠道细菌菌群中纯化单菌株
   1. 如步骤 2.1 中所述纯化活性单菌株。按照步骤 1.5、1.6 和 1.7 中概述的程序，通过蜭荭素的转化实验验证其活性。

结果

使用转化实验筛选了 10 名健康志愿者的粪便样本，结果一个样本显示出去糖基化辜胭脂蛋白的活性。这一发现证实了筛选活性样本的可行性。使用板标记方法分离活性样品。根据菌落的形态和特征，选择了大约 18 个具有黄色或白色、形状不同和边缘不均匀的单个细菌菌落进行进一步分析。其中，只有一个菌落表现出将荭草素裂解成其糖苷配基木犀草素的能力。按照前面?...

讨论

建立了用于筛选能够裂解 C-糖苷类的人肠道细菌的标准作程序 （SOP）。使用这些程序，成功获得了纯活性菌株，并通过转化试验证实了其去糖基化特性。SOP 包括肠道细菌的制备和富集、以活性为导向的筛选以及在低碳源培养基中的活性验证。

筛选过程最重要的方面是使用低碳源培养基来诱导细菌活性并提高筛选成功率。在转化实验中，使用 GAM 培养...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetonitrile	Thermo Fisher Scientific	F2408R205	HPLC
Anaerobic Incubator	Shanghai CIMO Medical Instrument Manufacturing Co., LTD		YQX- II
Beef Extract	Beijing Abxing Biotechnology Co., LTD	01-009	BR
Digestive Serum Powder	Beijing Abxing Biotechnology Co., LTD	01-087	BR
Dipotassium Hydrogen Phosphate	Beijing Chemical Works	M26298	AR
Disposable Sterile Stool Collection Tube	Lang Fu Co., LTD		5 mL
Distilled Water	Department of Biopharmaceutical, Beijing University of Traditional Chinese Medicine
DMSO	Sigma-Aldrich Corporation	WXBD2861V	AR
EP Tube	Beijing Biodee Biotechnology Co., LTD		10 mL/1.5 mL
Eppendorf Centrifuge	Eppendorf AG		5418
Glucose	Beijing Chemical Works	GC205003	AR
High Performance Liquid Chromatograph	Shimadzu Corporation		LC-20
High-pressure Steam Sterilizer	Sanyo Denki Shanghai Co., LTD		MLS-3780
Innoval C18 Chromatographic Column	Agela Technologies Co., LTD		4.6 mm × 250 mm, 5 µm
L-cysteine Hydrochloride	Beijing Abxing Biotechnology Co., LTD	BGASY01	BR
Liver Extract Powder	Beijing Abxing Biotechnology Co., LTD	01-085	BR
Luteolin	National Institutes for Food and Drug Control		>98%
Magnetic Stirrer	Ika Werke Co., LTD		RCT basic
Methanol	Thermo Fisher Scientific	20240901312	AR
Millipore Filter Membrane	Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.		0.22 µL × 50 mm
Orientin	Yishiming (Beijing) Biotechnology Co., LTD	19120601	>98%
Peptone	Beijing Abxing Biotechnology Co., LTD	1685787	BR
Petri Dish	Beijing Biodee Biotechnology Co., LTD		150 mm
Sodium Chloride	Beijing Abxing Biotechnology Co., LTD	BN20008	AR
Sodium Thioglycolate	Shanghai Jianglai Biotechnology Co., LTD	J031S219019	AR
Soluble Starch	Beijing Abxing Biotechnology Co., LTD	S9765	BR
Soya Peptone	Beijing Abxing Biotechnology Co., LTD	2147955	BR
Tryptone	Agela Technologies Co., LTD	1685787	BR
Ultrasonic Cleaner	Kun Shan Ultrasonic Instruments Co., LTD		KQ-500DE
Yeast Extract	Beijing Abxing Biotechnology Co., LTD	01-014	BR