Screening e isolamento dei batteri intestinali che scindono il glicoside C

Riepilogo

Questo studio stabilisce una serie di procedure operative standard (SOP) per lo screening e l'isolamento efficiente dei batteri intestinali in grado di scindere i glicosidi C.

Abstract

I C-glicosidi si trovano comunemente nelle piante medicinali e mostrano un'ampia diversità strutturale insieme a varie bioattività, tra cui attività antibatteriche, antinfiammatorie, antivirali, antiossidanti e antineoplastiche. Nei C-glicosidi, il carbonio anomerico della porzione zuccherina è direttamente collegato a un aglicone attraverso il legame carbonio-carbonio. Rispetto agli O-glicosidi, i C-glicosidi sono strutturalmente stabili e resistenti agli acidi e agli enzimi. Di conseguenza, sono in genere infrangibili, con conseguente scarsa assorbibilità e bassa biodisponibilità. È interessante notare che alcuni batteri intestinali possono scindere i legami glicosidici C-C, fornendo un approccio biologico specifico e rispettoso dell'ambiente per degradare i glicosidi C. In questo studio, è stata sviluppata una serie di procedure operative standard (SOP) per lo screening dei batteri intestinali in grado di scindere i legami glicosidici C-C sulla base del modello di biotrasformazione dei composti naturali. Le SOP includono la preparazione e l'arricchimento dei batteri intestinali, lo screening orientato all'attività e la convalida dell'attività in un mezzo di origine a basse emissioni di carbonio. Questa metodologia fornisce un riferimento fondamentale per i ricercatori che mirano a isolare e studiare questi batteri funzionali specializzati.

Introduzione

I C-glicosidi sono un gruppo di composti caratterizzati dal legame diretto dei gruppi glicosilici agli agliconi attraverso i legami C-C¹. In natura, l'orientina, la vitexina, la puerrina e i loro derivati sono comunemente identificati come C-glicosidi². Questi composti si trovano frequentemente in piante medicinali come il Trollius chinensis³ e in animali come la Styela plicata⁴. Gli studi hanno dimostrato che questi composti forniscono benefici per la salute e mostrano varie bioattività, tra cui antibatterico ^5,6,7, antinfiammatorio 8,9,10,11,12, antivirale ^3,12,13, antiossidante 14,15,16 e attività antineoplastiche¹⁷.

A causa del legame dei gruppi glicosilici allo scheletro attraverso legami C-C, questi composti mostrano un'elevata stabilità e resistenza all'idrolisi acida ed enzimatica¹⁸, portando a una scarsa assorbibilità e bassa biodisponibilità¹⁹. Questa limitazione influisce sullo sviluppo e sull'utilizzo dei glicosidi C. Tuttavia, i farmaci contenenti C-glicosidi, spesso somministrati per via orale, sono deglicosilati da enzimi specifici, producendo agliconi bioattivi più potenti 20,21,22,23. Mentre gli enzimi dell'ospite non sono in grado di deglicosilare i glicosidi C, è stato riportato che i batteri intestinali metabolizzano alcuni tipi. Ad esempio, alcuni batteri intestinali convertono la mangiferina in noratiriolo, che mostra una maggiore potenza come agente antidiabetico o antineoplastico²⁴. Nonostante questi risultati, è stato caratterizzato solo un numero limitato di batteri in grado di scindere i glicosidi C e i meccanismi sottostanti rimangono poco compresi. Uno screening efficiente e standardizzato di questi batteri migliorerà la comprensione delle loro funzioni e accelererà lo sviluppo dei glicosidi C.

Il metodo di screening è stato sviluppato e perfezionato nel tempo in un sistema maturo. Gli approcci principali includono l'arricchimento, lo screening orientato all'attività e la convalida dell'attività in mezzi sorgente a basse emissioni di carbonio. Questo metodo facilita l'isolamento di ceppi bersaglio puri, nonché l'identificazione di specie, dati genomici e tratti di microrganismi bersaglio. Utilizzando questo sistema, i batteri intestinali in grado di scindere i glicosidi C possono essere efficacemente sottoposti a screening e isolati.

Protocollo

Gli esperimenti condotti hanno aderito alle normative locali, nazionali e internazionali di contenimento della biosicurezza appropriate ai rischi specifici per la biosicurezza associati a ciascun ceppo. I campioni fecali sono stati raccolti da volontari sani che non avevano assunto alcun farmaco per almeno una settimana. I dettagli dei reagenti e delle attrezzature utilizzate sono forniti nella Tabella dei Materiali.

1. Costruzione di un modello di trasformazione batterica intestinale umana in vitro

1. Preparazione del terreno anaerobico generale (GAM)²⁵
   1. Preparazione della soluzione A
      1. Combina 10,0 g di triptone, 10,0 g di peptone proteoso, 3,0 g di peptone di soia, 13,5 g di siero digestivo in polvere, 1,2 g di estratto di fegato in polvere, 2,2 g di estratto di manzo e 5,0 g di estratto di lievito in un pallone di Erlenmeyer da 500 ml.
      2. Aggiungere 500 ml di acqua distillata e mescolare sotto fuoco fino a quando le sostanze non si saranno completamente sciolte.
   2. Preparazione della soluzione B
      1. Preparare la soluzione B seguendo la stessa procedura della soluzione A, tranne per unire 3,0 g di glucosio, 5,0 g di amido solubile, 2,5 g di idrogeno fosfato dipotassico e 3,0 g di cloruro di sodio in un pallone di Erlenmeyer da 250 ml.
   3. Preparazione della soluzione C
      1. Preparare la soluzione C seguendo la stessa procedura delle soluzioni A e B, tranne combinare 0,3 g di L-cisteina cloridrato e 0,3 g di tioglicolato di sodio in un pallone di Erlenmeyer da 100 mL.
      2. Mescolare tutte e tre le soluzioni in un matraccio di Erlenmeyer da 1000 mL, regolare il pH a 7,2 utilizzando una soluzione di idrossido di sodio al 10% e aggiungere acqua distillata per ottenere un volume finale di 1000 mL.
      3. Distribuire il terreno in matracci di Erlenmeyer da 250 mL e sterilizzare in autoclave a 121 °C per 30 minuti. Raffreddare a temperatura ambiente e conservare a 4 °C.
   4. Preparazione di un terreno anaerobico generale solido
      1. Aggiungere l'1%-2% di agar al terreno liquido GAM e scaldare fino a completa dissoluzione. Distribuire in matracci di Erlenmeyer da 250 mL e sterilizzare in autoclave a 121 °C per 30 minuti.
   5. Preparazione di un terreno di origine a basse emissioni di carbonio
      1. Preparare il terreno di origine a basse emissioni di carbonio utilizzando la stessa procedura della GAM, ma omettendo l'estratto di lievito, il glucosio e l'amido solubile.
2. Preparazione della flora intestinale umana mista
   1. Raccogliere 1-2 g di feci umane fresche in una provetta sterile monouso per la raccolta delle feci riempita di azoto gassoso. Sigillare prontamente il tubo. Aggiungere 5 mL di terreno GAM, sigillare e coltivare a 37 °C per 24 ore in un incubatore anaerobico sterile.
      NOTA: Utilizzare un misuratore di ossigeno per monitorare i livelli di ossigeno dell'incubatore anaerobico e sostituire l'azoto gassoso se necessario per mantenere le condizioni anaerobiche.
3. Attivazione della flora intestinale umana mista
   1. Dopo 24 ore, trasferire 0,5 mL di sospensione batterica intestinale umana in una nuova provetta da microcentrifuga contenente 4,5 mL di terreno GAM fresco.
   2. Sigillare e incubare a 37 °C per 24 ore in condizioni anaerobiche per ottenere una flora intestinale umana mista attiva.
4. Preparazione di soluzioni di riferimento
   1. Pesare 5 mg ciascuno di orientina e luteolina e scioglierli separatamente in 1 mL di DMSO per preparare soluzioni di riferimento di orientina e luteolina a una concentrazione di 5 mg/mL.
5. Screening della flora intestinale attiva in grado di scindere i C-glicosidi
   1. Miscelare 260 μL di flora intestinale attivata con 6 mL di terreno fresco a basso tenore di carbonio contenente 40 μL di soluzione di riferimento di orientina e incubare a 37 °C.
   2. Includere un gruppo di controllo (6 mL di terreno di origine a basse emissioni di carbonio, 40 μL di soluzione di riferimento di orientina e 260 μL di soluzione salina normale) e un gruppo bianco (6 mL di terreno di origine a basse emissioni di carbonio, 40 μL di soluzione salina normale e 260 μL di flora intestinale attivata).
      NOTA: Eseguire tutti i test in triplice copia in un'incubatrice anaerobica.
6. Pretrattamento delle soluzioni di trasformazione
   1. Dopo 24 ore e 48 ore, pipettare 1 mL di soluzioni di reazione in provette per microcentrifuga da 1,5 mL e centrifugare a 13.400 x g per 15 minuti a temperatura ambiente per rimuovere i batteri.
   2. Aggiungere 200 μl di surnatante a 600 μl di metanolo, mescolare e centrifugare a 13.400 x g per 15 minuti a temperatura ambiente per rimuovere le proteine.
7. Rilevamento dei prodotti di trasformazione
   1. Filtrare il surnatante utilizzando una membrana microporosa da 0,22 μm e analizzare il filtrato mediante cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC). Esecuzione di analisi HPLC su uno strumento dotato di colonna C₁₈ (4,6 mm × 250 mm, 5 μm).
   2. Mantenere la temperatura del forno a colonna a 40 °C, con una portata di 1 mL/min. Utilizzare l'acetonitrile come fase mobile A e l'acido formico allo 0,1% in acqua purificata come fase mobile B.
      NOTA: Utilizzare un sistema di gradiente lineare come segue: 5%-55% A a 0-20 min, 55%-95% A a 20-25 min, 95%-5% A a 25-30 min e 5% A a 30-32 min.

2. Isolamento di singoli ceppi dalla flora batterica intestinale umana

1. Attivazione della flora batterica intestinale umana mista
   1. Attivare la flora batterica intestinale umana mista in grado di scindere l'orientina, come descritto al punto 1.3, per ottenere la soluzione attivata di flora batterica intestinale umana.
2. Preparazione di piastre GAM solide
   1. Sciogliere il terreno solido GAM preparato mediante riscaldamento e versarlo in piastre di Petri sterili monouso in un incubatore anaerobico. Lasciare solidificare il terreno per preparare piastre GAM solide.
3. Screening preliminare di singoli ceppi della flora batterica intestinale umana
   1. Pipettare 100 μl della soluzione batterica attivata in una provetta per microcentrifuga da 1,5 mL contenente 1 mL di soluzione fisiologica normale.
   2. Inoculare un volume appropriato di soluzione batterica su una capsula di Petri utilizzando un anello di inoculazione monouso. Sigillare la capsula e incubarla in un'incubatrice anaerobica.
4. Osservazione della morfologia delle colonie
   1. Dopo 48 ore di incubazione a 37 °C, osservare le dimensioni, la morfologia e il colore delle colonie sulla piastra.
5. Selezione di singole colonie per ottenere singoli ceppi
   1. Selezionare singole colonie batteriche distinte e coltivarle in provette da microcentrifuga da 10 mL contenenti 4,5 mL di terreno GAM fresco. Incubare in condizioni anaerobiche a 37 °C per 24 ore per ottenere ceppi singoli.
6. Verifica dell'attività di un singolo deformazione
   1. Verificare l'attività dei singoli ceppi come descritto nei passaggi 1.5, 1.6 e 1.7. Eseguire la verifica dell'attività utilizzando la cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC) e la marcatura su piastra²⁵.
7. Purificazione di singoli ceppi dalla flora batterica intestinale umana
   1. Purificare il singolo ceppo attivo come descritto al punto 2.1. Verificare la sua attività attraverso esperimenti di trasformazione con l'orientina, seguendo le procedure descritte nei passaggi 1.5, 1.6 e 1.7.

Risultati

I campioni fecali di dieci volontari sani sono stati sottoposti a screening utilizzando esperimenti di trasformazione, ottenendo un campione che ha dimostrato attività nella deglicosilazione dell'orientina. Questa scoperta ha confermato la fattibilità dello screening per i campioni attivi. Il campione attivo è stato isolato utilizzando il metodo della marcatura su piastra. Sulla base della morfologia e delle caratteristiche delle colonie, sono state selezionate per ulteriori analisi c...

Discussione

È stata stabilita una procedura operativa standard (SOP) per lo screening dei batteri intestinali umani in grado di scindere i glicosidi C. Utilizzando queste procedure, è stato ottenuto con successo un ceppo attivo puro e la sua proprietà di deglicosilazione è stata confermata attraverso test di trasformazione. La SOP consiste nella preparazione e nell'arricchimento di batteri intestinali, nello screening orientato all'attività e nella convalida dell'attività in un mezzo di origin...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetonitrile	Thermo Fisher Scientific	F2408R205	HPLC
Anaerobic Incubator	Shanghai CIMO Medical Instrument Manufacturing Co., LTD		YQX- II
Beef Extract	Beijing Abxing Biotechnology Co., LTD	01-009	BR
Digestive Serum Powder	Beijing Abxing Biotechnology Co., LTD	01-087	BR
Dipotassium Hydrogen Phosphate	Beijing Chemical Works	M26298	AR
Disposable Sterile Stool Collection Tube	Lang Fu Co., LTD		5 mL
Distilled Water	Department of Biopharmaceutical, Beijing University of Traditional Chinese Medicine
DMSO	Sigma-Aldrich Corporation	WXBD2861V	AR
EP Tube	Beijing Biodee Biotechnology Co., LTD		10 mL/1.5 mL
Eppendorf Centrifuge	Eppendorf AG		5418
Glucose	Beijing Chemical Works	GC205003	AR
High Performance Liquid Chromatograph	Shimadzu Corporation		LC-20
High-pressure Steam Sterilizer	Sanyo Denki Shanghai Co., LTD		MLS-3780
Innoval C18 Chromatographic Column	Agela Technologies Co., LTD		4.6 mm × 250 mm, 5 µm
L-cysteine Hydrochloride	Beijing Abxing Biotechnology Co., LTD	BGASY01	BR
Liver Extract Powder	Beijing Abxing Biotechnology Co., LTD	01-085	BR
Luteolin	National Institutes for Food and Drug Control		>98%
Magnetic Stirrer	Ika Werke Co., LTD		RCT basic
Methanol	Thermo Fisher Scientific	20240901312	AR
Millipore Filter Membrane	Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.		0.22 µL × 50 mm
Orientin	Yishiming (Beijing) Biotechnology Co., LTD	19120601	>98%
Peptone	Beijing Abxing Biotechnology Co., LTD	1685787	BR
Petri Dish	Beijing Biodee Biotechnology Co., LTD		150 mm
Sodium Chloride	Beijing Abxing Biotechnology Co., LTD	BN20008	AR
Sodium Thioglycolate	Shanghai Jianglai Biotechnology Co., LTD	J031S219019	AR
Soluble Starch	Beijing Abxing Biotechnology Co., LTD	S9765	BR
Soya Peptone	Beijing Abxing Biotechnology Co., LTD	2147955	BR
Tryptone	Agela Technologies Co., LTD	1685787	BR
Ultrasonic Cleaner	Kun Shan Ultrasonic Instruments Co., LTD		KQ-500DE
Yeast Extract	Beijing Abxing Biotechnology Co., LTD	01-014	BR