Dépistage et isolement des bactéries intestinales clivant le glycoside C

Résumé

Cette étude établit un ensemble de procédures opératoires standard (PON) pour dépister et isoler efficacement les bactéries intestinales capables de cliver les C-glycosides.

Résumé

Les C-glycosides se trouvent couramment dans les plantes médicinales et présentent une grande diversité structurelle ainsi que diverses bioactivités, notamment des activités antibactériennes, anti-inflammatoires, antivirales, antioxydantes et antinéoplasiques. Dans les glycosides C, le carbone anomérique de la fraction sucre est directement connecté à un aglycone par liaison carbone-carbone. Par rapport aux O-glycosides, les C-glycosides sont structurellement stables et résistants aux acides et aux enzymes. Par conséquent, ils sont généralement incassables, ce qui entraîne une faible capacité d’absorption et une faible biodisponibilité. Il est intéressant de noter que certaines bactéries intestinales peuvent cliver les liaisons glycosidiques C-C, fournissant une approche biologique spécifique et respectueuse de l’environnement pour dégrader les C-glycosides. Dans cette étude, un ensemble de procédures opérationnelles standard (PON) a été développé pour le dépistage des bactéries intestinales capables de cliver les liaisons glycosidiques C-C sur la base du modèle de biotransformation des composés naturels. Les POS comprennent la préparation et l’enrichissement des bactéries intestinales, le criblage axé sur l’activité et la validation de l’activité dans un milieu source à faible teneur en carbone. Cette méthodologie fournit une référence fondamentale pour les chercheurs visant à isoler et à étudier ces bactéries fonctionnelles spécialisées.

Introduction

Les glycosides C sont un groupe de composés caractérisé par la liaison directe des groupes glycosyle aux aglycones par le biais de liaisons C-C¹. Dans la nature, l’orientine, la vitexine, la puérarine et leurs dérivés sont couramment identifiés comme des C-glycosides². Ces composés sont fréquemment trouvés dans les plantes médicinales telles que Trollius chinensis³ et chez les animaux tels que Styela plicata⁴. Des études ont démontré que ces composés offrent des avantages pour la santé et présentent diverses bioactivités, notamment antibactériennes ^5,6,7, anti-inflammatoires ^8,9,10,11,12, antivirales ^3,12,13, antioxydantes 14,15,16 et Activités antinéoplasiques¹⁷.

En raison de la liaison des groupes glycosyle au squelette par le biais de liaisons C-C, ces composés présentent une stabilité et une résistance élevées à l’hydrolyse acide et enzymatique¹⁸, ce qui entraîne une faible absorbabilité et une faible biodisponibilité¹⁹. Cette limitation affecte le développement et l’utilisation des C-glycosides. Cependant, les médicaments contenant des glycosides C, souvent administrés par voie orale, sont déglycosylés par des enzymes spécifiques, produisant des aglycones bioactives plus puissantes 20,21,22,23. Alors que les enzymes de l’hôte sont incapables de déglycosyler les C-glycosides, il a été rapporté que les bactéries intestinales métabolisent certains types. Par exemple, certaines bactéries intestinales convertissent la mangiférine en norathyriol, qui présente une plus grande puissance en tant qu’agent antidiabétique ou antinéoplasique²⁴. Malgré ces découvertes, seul un nombre limité de bactéries capables de clivage des C-glycosides a été caractérisé, et les mécanismes sous-jacents restent mal compris. Un dépistage efficace et standardisé de ces bactéries permettra de mieux comprendre leurs fonctions et d’accélérer le développement des C-glycosides.

La méthode de dépistage a été développée et affinée au fil du temps pour devenir un système mature. Les approches de base comprennent l’enrichissement, le criblage axé sur l’activité et la validation de l’activité dans les milieux sources à faible teneur en carbone. Cette méthode facilite l’isolement des souches cibles pures, ainsi que l’identification des espèces, des données génomiques et des traits des micro-organismes cibles. Grâce à ce système, les bactéries intestinales capables de cliver les C-glycosides peuvent être efficacement dépistées et isolées.

Protocole

Les expériences menées ont respecté les réglementations locales, nationales et internationales en matière de confinement de la biosécurité adaptées aux dangers spécifiques de la biosécurité associés à chaque souche. Des échantillons de matières fécales ont été prélevés sur des volontaires sains qui n’avaient pas pris de médicaments depuis au moins une semaine. Les détails des réactifs et de l’équipement utilisés sont fournis dans la table des matériaux.

1. Construction d’un modèle de transformation bactérienne intestinale humaine in vitro

1. Préparation d’un milieu anaérobie général (GAM)²⁵
   1. Préparation de la solution A
      1. Mélangez 10,0 g de tryptone, 10,0 g de peptone de protéose, 3,0 g de peptone de soja, 13,5 g de poudre de sérum digestif, 1,2 g de poudre d’extrait de foie, 2,2 g d’extrait de bœuf et 5,0 g d’extrait de levure dans un erlenmeyer de 500 ml.
      2. Ajouter 500 ml d’eau distillée et remuer sous chauffage jusqu’à ce que les substances soient complètement dissoutes.
   2. Préparation de la solution B
      1. Préparez la solution B en suivant la même procédure que la solution A, sauf que vous combinez 3,0 g de glucose, 5,0 g d’amidon soluble, 2,5 g d’hydrogénophosphate dipotassique et 3,0 g de chlorure de sodium dans un erlenmeyer de 250 ml.
   3. Préparation de la solution C
      1. Préparez la solution C en suivant la même procédure que les solutions A et B, mais combinez 0,3 g de chlorhydrate de L-cystéine et 0,3 g de thioglycolate de sodium dans un erlenmeyer de 100 ml.
      2. Mélangez les trois solutions dans un erlenmeyer de 1000 ml, ajustez le pH à 7,2 à l’aide d’une solution d’hydroxyde de sodium à 10 % et ajoutez de l’eau distillée pour obtenir un volume final de 1000 ml.
      3. Répartir le milieu dans des erlenmeyers de 250 mL et l’autoclave à 121 °C pendant 30 min. Laisser refroidir à température ambiante et conserver à 4 °C.
   4. Préparation d’un milieu anaérobie général solide
      1. Ajoutez 1 à 2 % de gélose au milieu liquide GAM et chauffez jusqu’à dissolution complète. Répartir dans des erlenmeyers de 250 mL et dans l’autoclave à 121 °C pendant 30 min.
   5. Préparation d’un milieu source bas carbone
      1. Préparez le milieu source à faible teneur en carbone en utilisant la même procédure que le GAM, mais en omettant l’extrait de levure, le glucose et l’amidon soluble.
2. Préparation de la flore intestinale humaine mixte
   1. Prélever 1 à 2 g d’excréments humains frais dans un tube de prélèvement de selles stérile jetable rempli d’azote gazeux. Fermez rapidement le tube. Ajouter 5 mL de milieu GAM, sceller et cultiver à 37 °C pendant 24 h dans un incubateur anaérobie stérile.
      REMARQUE : Utilisez un oxygénomètre pour surveiller les niveaux d’oxygène de l’incubateur anaérobie et remplacez l’azote gazeux si nécessaire pour maintenir des conditions anaérobies.
3. Activation de la flore intestinale humaine mixte
   1. Après 24 h, transférer 0,5 mL de suspension bactérienne intestinale humaine dans un nouveau tube de microcentrifugation contenant 4,5 mL de milieu GAM frais.
   2. Sceller et incuber à 37 °C pendant 24 h dans des conditions anaérobies pour obtenir une flore intestinale humaine mixte active.
4. Préparation des solutions de référence
   1. Peser 5 mg d’orientine et de lutéoline et les dissoudre séparément dans 1 mL de DMSO pour préparer des solutions de référence d’orientine et de lutéoline à une concentration de 5 mg/mL.
5. Dépistage de la flore intestinale active capable de cliver les C-glycosides
   1. Mélanger 260 μL de flore intestinale activée avec 6 mL de milieu source frais à faible teneur en carbone contenant 40 μL de solution de référence d’orientine, et incuber à 37 °C.
   2. Inclure un groupe témoin (6 ml de milieu source à faible teneur en carbone, 40 μL de solution de référence d’orientine et 260 μL de solution saline normale) et un groupe à blanc (6 ml de milieu source à faible teneur en carbone, 40 μL de solution saline normale et 260 μL de flore intestinale activée).
      REMARQUE : Effectuez tous les tests en trois exemplaires dans un incubateur anaérobie.
6. Prétraitement des solutions de transformation
   1. Après 24 h et 48 h, pipeter 1 mL des solutions réactionnelles dans des tubes de microcentrifugation de 1,5 mL et centrifuger à 13 400 x g pendant 15 min à température ambiante pour éliminer les bactéries.
   2. Ajouter 200 μL de surnageant à 600 μL de méthanol, mélanger et centrifuger à 13 400 x g pendant 15 min à température ambiante pour éliminer les protéines.
7. Détection des produits de transformation
   1. Filtrer le surnageant à l’aide d’une membrane microporeuse de 0,22 μm et analyser le filtrat par chromatographie liquide à haute performance (HPLC). Effectuez une analyse HPLC sur un instrument équipé d’une colonne C₁₈ (4,6 mm × 250 mm, 5 μm).
   2. Maintenir la température du four à colonne à 40 °C, avec un débit de 1 mL/min. Utilisez de l’acétonitrile comme phase mobile A et de l’acide formique à 0,1 % dans l’eau purifiée comme phase mobile B.
      REMARQUE : Utilisez un système de gradient linéaire comme suit : 5 % -55 % A à 0-20 min, 55 % -95 % A à 20-25 min, 95 % à 5 % A à 25-30 min et 5 % A à 30-32 min.

2. Isolement de souches uniques dans la flore bactérienne intestinale humaine

1. Activation de la flore bactérienne intestinale humaine mixte
   1. Activer la flore bactérienne intestinale humaine mixte capable de cliver l’orientine, comme décrit à l’étape 1.3, pour obtenir la solution de flore bactérienne intestinale humaine activée.
2. Préparation de plaques GAM pleines
   1. Dissoudre le milieu solide GAM préparé en le chauffant et versez-le dans des boîtes de Pétri stériles jetables dans un incubateur anaérobie. Laissez le milieu se solidifier pour préparer des plaques GAM solides.
3. Criblage préliminaire de souches uniques de flore bactérienne intestinale humaine
   1. Pipeter 100 μL de la solution bactérienne activée dans un tube de microcentrifugation de 1,5 mL contenant 1 mL de solution saline normale.
   2. Inoculer un volume approprié de solution bactérienne sur une boîte de Pétri à l’aide d’un anneau d’inoculation jetable. Fermez le plat et incubez-le dans un incubateur anaérobie.
4. Observation de la morphologie de la colonie
   1. Après 48 h d’incubation à 37 °C, observez la taille, la morphologie et la couleur des colonies sur la plaque.
5. Sélection de colonies individuelles pour obtenir des souches uniques
   1. Sélectionner des colonies bactériennes uniques distinctes et les cultiver dans des tubes de microcentrifugation de 10 mL contenant 4,5 mL de milieu GAM frais. Incuber dans des conditions anaérobies à 37 °C pendant 24 h pour obtenir des souches uniques.
6. Vérification de l’activité d’une seule souche
   1. Vérifiez l’activité des souches uniques comme décrit aux étapes 1.5, 1.6 et 1.7. Effectuer la vérification de l’activité à l’aide de la chromatographie liquide à haute performance (HPLC) et du marquage de plaque²⁵.
7. Purification de souches uniques de la flore bactérienne intestinale humaine
   1. Purifier la souche unique active comme décrit à l’étape 2.1. Vérifiez son activité par des expériences de transformation avec l’orientine, en suivant les procédures décrites aux étapes 1.5, 1.6 et 1.7.

Résultats

Des échantillons fécaux de dix volontaires sains ont été analysés à l’aide d’expériences de transformation, ce qui a permis de démontrer l’activité de l’orientine déglycosylante. Cette constatation a confirmé la faisabilité du dépistage des échantillons actifs. L’échantillon actif a été isolé à l’aide de la méthode de marquage sur plaque. Sur la base de la morphologie et des caractéristiques des colonies, environ 18 colonies bactériennes uniques avec une...

Discussion

Une procédure opérationnelle normalisée (PON) pour le dépistage des bactéries intestinales humaines capables de cliver les C-glycosides a été établie. En utilisant ces procédures, une souche active pure a été obtenue avec succès, et sa propriété de déglycosylation a été confirmée par des tests de transformation. La POS comprend la préparation et l’enrichissement des bactéries intestinales, le criblage axé sur l’activité et la validation de l’activité dans un ...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetonitrile	Thermo Fisher Scientific	F2408R205	HPLC
Anaerobic Incubator	Shanghai CIMO Medical Instrument Manufacturing Co., LTD		YQX- II
Beef Extract	Beijing Abxing Biotechnology Co., LTD	01-009	BR
Digestive Serum Powder	Beijing Abxing Biotechnology Co., LTD	01-087	BR
Dipotassium Hydrogen Phosphate	Beijing Chemical Works	M26298	AR
Disposable Sterile Stool Collection Tube	Lang Fu Co., LTD		5 mL
Distilled Water	Department of Biopharmaceutical, Beijing University of Traditional Chinese Medicine
DMSO	Sigma-Aldrich Corporation	WXBD2861V	AR
EP Tube	Beijing Biodee Biotechnology Co., LTD		10 mL/1.5 mL
Eppendorf Centrifuge	Eppendorf AG		5418
Glucose	Beijing Chemical Works	GC205003	AR
High Performance Liquid Chromatograph	Shimadzu Corporation		LC-20
High-pressure Steam Sterilizer	Sanyo Denki Shanghai Co., LTD		MLS-3780
Innoval C18 Chromatographic Column	Agela Technologies Co., LTD		4.6 mm × 250 mm, 5 µm
L-cysteine Hydrochloride	Beijing Abxing Biotechnology Co., LTD	BGASY01	BR
Liver Extract Powder	Beijing Abxing Biotechnology Co., LTD	01-085	BR
Luteolin	National Institutes for Food and Drug Control		>98%
Magnetic Stirrer	Ika Werke Co., LTD		RCT basic
Methanol	Thermo Fisher Scientific	20240901312	AR
Millipore Filter Membrane	Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.		0.22 µL × 50 mm
Orientin	Yishiming (Beijing) Biotechnology Co., LTD	19120601	>98%
Peptone	Beijing Abxing Biotechnology Co., LTD	1685787	BR
Petri Dish	Beijing Biodee Biotechnology Co., LTD		150 mm
Sodium Chloride	Beijing Abxing Biotechnology Co., LTD	BN20008	AR
Sodium Thioglycolate	Shanghai Jianglai Biotechnology Co., LTD	J031S219019	AR
Soluble Starch	Beijing Abxing Biotechnology Co., LTD	S9765	BR
Soya Peptone	Beijing Abxing Biotechnology Co., LTD	2147955	BR
Tryptone	Agela Technologies Co., LTD	1685787	BR
Ultrasonic Cleaner	Kun Shan Ultrasonic Instruments Co., LTD		KQ-500DE
Yeast Extract	Beijing Abxing Biotechnology Co., LTD	01-014	BR