C-Glikozit-Parçalayan Bağırsak Bakterilerinin Taranması ve İzolasyonu

Özet

Bu çalışma, C-glikozitleri parçalayabilen bağırsak bakterilerini verimli bir şekilde taramak ve izole etmek için bir dizi standart işletim prosedürü (SOP) oluşturur.

Özet

C-glikozitler tıbbi bitkilerde yaygın olarak bulunur ve antibakteriyel, antienflamatuar, antiviral, antioksidan ve antineoplastik aktiviteler dahil olmak üzere çeşitli biyoaktivitelerle birlikte geniş yapısal çeşitlilik sergiler. C-glikozitlerde, şeker parçasının anomerik karbonu, karbon-karbon bağı yoluyla doğrudan bir aglikona bağlanır. O-glikozitlerle karşılaştırıldığında, C-glikozitler yapısal olarak kararlıdır ve asitlere ve enzimlere karşı dirençlidir. Sonuç olarak, tipik olarak kırılamazlar, bu da zayıf emilebilirlik ve düşük biyoyararlanım ile sonuçlanır. İlginç bir şekilde, bazı bağırsak bakterileri C-C glikozidik bağlarını parçalayabilir ve C-glikozitleri parçalamak için spesifik ve çevre dostu bir biyolojik yaklaşım sağlar. Bu çalışmada, doğal bileşiklerin biyotransformasyon modeline dayalı olarak C-C glikozidik bağlarını parçalayabilen bağırsak bakterilerini taramak için bir dizi standart işletim prosedürü (SOP) geliştirilmiştir. SÇP'ler, bağırsak bakterilerinin hazırlanmasını ve zenginleştirilmesini, aktivite odaklı taramayı ve düşük karbonlu bir kaynak ortamında aktivite doğrulamasını içerir. Bu metodoloji, bu özel fonksiyonel bakterileri izole etmeyi ve incelemeyi amaçlayan araştırmacılar için temel bir referans sağlar.

Giriş

C-glikozitler, glikosil gruplarının CC bağları¹ yoluyla aglikonlara doğrudan bağlanması ile karakterize edilen bir bileşik grubudur. Doğada, orientin, vitexin, puerin ve türevleri yaygın olarak C-glikozitler² olarak tanımlanır. Bu bileşikler sıklıkla Trollius chinensis³ gibi tıbbi bitkilerde ve Styela plicata⁴ gibi hayvanlarda bulunur. Çalışmalar, bu bileşiklerin sağlık yararları sağladığını ve antibakteriyel ^5,6,7, anti-inflamatuar 8,9,10,11,12, antiviral ^3,12,13, antioksidan 14,15,16 ve Antineoplastik aktiviteler¹⁷.

Glikosil gruplarının CC bağları yoluyla iskelete bağlanması nedeniyle, bu bileşikler asidik ve enzimatik hidrolize¹⁸ karşı yüksek stabilite ve direnç sergiler, bu da zayıf emilebilirliğe ve düşük biyoyararlanıma¹⁹ yol açar. Bu sınırlama, C-glikozitlerin gelişimini ve kullanımını etkiler. Bununla birlikte, genellikle oral yoldan uygulanan C-glikozitler içeren ilaçlar, spesifik enzimler tarafından deglikosile edilir ve daha güçlü biyoaktif aglikonlar üretir 20,21,22,23. Konağın kendi enzimleri C-glikozitleri deglikosile edemezken, bağırsak bakterilerinin belirli türleri metabolize ettiği bildirilmiştir. Örneğin, bazı bağırsak bakterileri mangiferini antidiyabetik veya antineoplastik bir ajan olarak daha fazla etki gösteren noratiriole dönüştürür²⁴. Bu bulgulara rağmen, C-glikozitleri parçalayabilen sadece sınırlı sayıda bakteri karakterize edilmiştir ve altta yatan mekanizmalar tam olarak anlaşılamamıştır. Bu bakterilerin verimli ve standartlaştırılmış taraması, işlevlerinin anlaşılmasını artıracak ve C-glikozitlerin gelişimini hızlandıracaktır.

Tarama yöntemi zaman içinde geliştirilmiş ve rafine edilerek olgun bir sisteme dönüştürülmüştür. Temel yaklaşımlar, düşük karbonlu kaynak ortamlarında zenginleştirme, aktivite odaklı tarama ve aktivite doğrulamasını içerir. Bu yöntem, saf hedef suşların izolasyonunun yanı sıra türlerin, genomik verilerin ve hedef mikroorganizmaların özelliklerinin tanımlanmasını kolaylaştırır. Bu sistemi kullanarak, C-glikozitleri parçalayabilen bağırsak bakterileri etkili bir şekilde taranabilir ve izole edilebilir.

Protokol

Yürütülen deneyler, her bir suşla ilişkili spesifik biyogüvenlik tehlikelerine uygun yerel, ulusal ve uluslararası biyogüvenlik muhafaza düzenlemelerine bağlı kalmıştır. En az bir hafta boyunca herhangi bir ilaç kullanmayan sağlıklı gönüllülerden dışkı örnekleri toplandı. Kullanılan reaktiflerin ve ekipmanın ayrıntıları Malzeme Tablosunda verilmiştir.

1. İnsan bağırsağı bakteriyel dönüşüm modelinin in vitro olarak oluşturulması

1. Genel Anaerobik Ortamın (GAM) ^{Hazırlanması25}
   1. Çözelti A'nın Hazırlanması
      1. 10.0 g tripton, 10.0 g proteoz pepton, 3.0 g soya peptonu, 13.5 g sindirim serumu tozu, 1.2 g karaciğer özü tozu, 2.2 g sığır özü ve 5.0 g maya özütünü 500 mL'lik bir Erlenmeyer şişesinde birleştirin.
      2. 500 mL damıtılmış su ekleyin ve maddeler tamamen eriyene kadar ısıtma altında karıştırın.
   2. Çözelti B'nin Hazırlanması
      1. 3.0 g glikoz, 5.0 g çözünür nişasta, 2.5 g dipotasyum hidrojen fosfat ve 3.0 g sodyum klorürü 250 mL'lik bir Erlenmeyer şişesinde birleştirmek dışında, Çözelti A ile aynı prosedürü izleyerek Çözelti B'yi hazırlayın.
   3. Çözelti C'nin Hazırlanması
      1. 0.3 g L-sistein hidroklorür ve 0.3 g sodyum tiyoglikolatı 100 mL'lik bir Erlenmeyer şişesinde birleştirmek dışında, Çözelti A ve B ile aynı prosedürü izleyerek Çözelti C'yi hazırlayın.
      2. Üç çözeltiyi de 1000 mL'lik bir Erlenmeyer şişesinde karıştırın, %10'luk bir sodyum hidroksit çözeltisi kullanarak pH'ı 7.2'ye ayarlayın ve 1000 mL'lik bir nihai hacim oluşturmak için damıtılmış su ekleyin.
      3. Ortamı 250 mL Erlenmeyer şişelerine dağıtın ve 121 ° C'de 30 dakika boyunca otoklavlayın. Oda sıcaklığına soğutun ve 4 °C'de saklayın.
   4. Katı genel anaerobik ortamın hazırlanması
      1. GAM sıvı ortamına %1-%2 agar ekleyin ve tamamen eriyene kadar ısıtın. 250 mL Erlenmeyer şişelerine dağıtın ve 121 ° C'de 30 dakika boyunca otoklava koyun.
   5. Düşük karbonlu kaynak ortamının hazırlanması
      1. Düşük karbonlu kaynak ortamını GAM ile aynı prosedürü kullanarak hazırlayın, ancak maya özütü, glikoz ve çözünür nişastayı atlayın.
2. Karışık İnsan Bağırsak Florasının Hazırlanması
   1. Azot gazı ile doldurulmuş tek kullanımlık steril dışkı toplama tüpünde 1-2 g taze insan dışkısı toplayın. Tüpü derhal kapatın. Steril bir anaerobik inkübatörde 24 saat boyunca 37 ° C'de 5 mL GAM ortamı, mühür ve kültür ekleyin.
      NOT: Anaerobik inkübatörün oksijen seviyelerini izlemek için bir oksijen ölçer kullanın ve anaerobik koşulları korumak için gerektiği gibi nitrojen gazını değiştirin.
3. Karışık insan bağırsak florasının aktivasyonu
   1. 24 saat sonra, 0.5 mL insan bağırsağı bakteri süspansiyonunu 4.5 mL taze GAM ortamı içeren yeni bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın.
   2. Aktif karışık insan bağırsak florası elde etmek için anaerobik koşullar altında 37 ° C'de 24 saat boyunca kapatın ve inkübe edin.
4. Referans çözeltilerin hazırlanması
   1. Her biri 5 mg oryantin ve luteolin tartın ve 5 mg / mL konsantrasyonda oryantin ve luteolin referans çözeltileri hazırlamak için bunları 1 mL DMSO içinde ayrı ayrı çözün.
5. C-glikozitleri parçalayabilen aktif bağırsak florasının taranması
   1. 260 μL aktif bağırsak florasını, 40 μL oryantin referans çözeltisi içeren 6 mL taze düşük karbonlu kaynak ortamla karıştırın ve 37 °C'de inkübe edin.
   2. Bir kontrol grubu (6 mL düşük karbonlu kaynak ortamı, 40 μL oryantin referans çözeltisi ve 260 μL normal salin) ve boş bir grup (6 mL düşük karbonlu kaynak ortamı, 40 μL normal salin ve 260 μL aktif bağırsak florası) içerir.
      NOT: Tüm testleri anaerobik bir inkübatörde üç kopya halinde gerçekleştirin.
6. Dönüşüm çözümlerinin ön arıtımı
   1. 24 saat ve 48 saat sonra, 1 mL reaksiyon çözeltisini 1.5 mL mikrosantrifüj tüplerine pipetleyin ve bakterileri uzaklaştırmak için oda sıcaklığında 15 dakika boyunca 13.400 x g'da santrifüjleyin.
   2. 600 μL metanole 200 μL süpernatan ekleyin, karıştırın ve proteinleri çıkarmak için oda sıcaklığında 15 dakika boyunca 13.400 x g'da santrifüjleyin.
7. Dönüşüm ürünlerinin tespiti
   1. Süpernatanı 0,22 μm mikro gözenekli bir membran kullanarak filtreleyin ve süzüntüyü yüksek performanslı sıvı kromatografisi (HPLC) ile analiz edin. C₁₈ sütunu (4,6 mm × 250 mm, 5 μm) ile donatılmış bir cihazda HPLC analizi yapın.
   2. Kolon fırın sıcaklığını 40 mL/dk akış hızıyla 1 °C'de tutun. Mobil faz A olarak asetonitril ve arıtılmış suda mobil faz B olarak %0.1 formik asit kullanın.
      NOT: Aşağıdaki gibi doğrusal bir gradyan sistemi kullanın: 0-20 dakikada %5 - %55 A, 20-25 dakikada %55 - %95 A, 25-30 dakikada %95 - %5 A ve 30-32 dakikada %5 A.

2. İnsan bağırsak bakteri florasından tek suşların izolasyonu

1. Karışık insan bağırsak bakteri florasının aktivasyonu
   1. Aktive edilmiş insan bağırsağı bakteri florası çözeltisini elde etmek için, adım 1.3'te açıklandığı gibi oryantasyonini parçalayabilen karışık insan bağırsağı bakteri florasını aktive edin.
2. Katı GAM plakalarının hazırlanması
   1. Hazırlanan katı GAM ortamını ısıtarak çözün ve anaerobik bir inkübatörde tek kullanımlık steril petri kaplarına dökün. Katı GAM plakaları hazırlamak için ortamın katılaşmasına izin verin.
3. İnsan bağırsak bakteri florasından tek suşların ön taraması
   1. 100 μL aktif bakteri solüsyonunu 1 mL normal salin içeren 1.5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne pipetleyin.
   2. Tek kullanımlık bir aşılama halkası kullanarak uygun miktarda bakteri solüsyonunu bir petri kabına aşılayın. Çanağı kapatın ve anaerobik bir inkübatörde inkübe edin.
4. Koloni morfolojisinin gözlemlenmesi
   1. 37 ° C'de 48 saatlik inkübasyondan sonra, plaka üzerindeki kolonilerin boyutunu, morfolojisini ve rengini gözlemleyin.
5. Tek suşlar elde etmek için bireysel kolonilerin seçimi
   1. Farklı tek bakteri kolonilerini seçin ve bunları 4.5 mL taze GAM ortamı içeren 10 mL mikrosantrifüj tüplerinde kültürleyin. Tek suşlar elde etmek için anaerobik koşullar altında 37 ° C'de 24 saat inkübe edin.
6. Tek suş aktivitesinin doğrulanması
   1. Adım 1.5, 1.6 ve 1.7'de açıklandığı gibi tek suşların aktivitesini doğrulayın. Yüksek performanslı sıvı kromatografisi (HPLC) ve plaka işaretleme²⁵ kullanarak aktivite doğrulaması yapın.
7. İnsan bağırsak bakteri florasından tek suşların saflaştırılması
   1. Aktif tek suşu adım 2.1'de açıklandığı gibi saflaştırın. Adım 1.5, 1.6 ve 1.7'de belirtilen prosedürleri izleyerek orientin ile dönüşüm deneyleri yoluyla aktivitesini doğrulayın.

Sonuçlar

On sağlıklı gönüllüden alınan dışkı örnekleri, dönüşüm deneyleri kullanılarak tarandı ve bu, oryantini deglikosile etmede aktivite gösteren bir örnekle sonuçlandı. Bu bulgu, aktif numuneler için taramanın fizibilitesini doğruladı. Aktif numune, plaka işaretleme yöntemi kullanılarak izole edildi. Kolonilerin morfolojisine ve özelliklerine dayanarak, daha fazla analiz için sarı veya beyaz renkli, çeşitli şekillere ve düzensiz kenarlara sahip yaklaşık 18...

Tartışmalar

C-glikozitleri parçalayabilen insan bağırsak bakterilerini taramak için standart işletim prosedürü (SOP) oluşturulmuştur. Bu prosedürler kullanılarak, saf bir aktif suş başarılı bir şekilde elde edildi ve deglikosilasyon özelliği, dönüşüm testleri ile doğrulandı. SOP, bağırsak bakterilerinin hazırlanması ve zenginleştirilmesi, aktivite odaklı tarama ve düşük karbonlu kaynak ortamında aktivite doğrulamasından oluşur.

Tarama ...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetonitrile	Thermo Fisher Scientific	F2408R205	HPLC
Anaerobic Incubator	Shanghai CIMO Medical Instrument Manufacturing Co., LTD		YQX- II
Beef Extract	Beijing Abxing Biotechnology Co., LTD	01-009	BR
Digestive Serum Powder	Beijing Abxing Biotechnology Co., LTD	01-087	BR
Dipotassium Hydrogen Phosphate	Beijing Chemical Works	M26298	AR
Disposable Sterile Stool Collection Tube	Lang Fu Co., LTD		5 mL
Distilled Water	Department of Biopharmaceutical, Beijing University of Traditional Chinese Medicine
DMSO	Sigma-Aldrich Corporation	WXBD2861V	AR
EP Tube	Beijing Biodee Biotechnology Co., LTD		10 mL/1.5 mL
Eppendorf Centrifuge	Eppendorf AG		5418
Glucose	Beijing Chemical Works	GC205003	AR
High Performance Liquid Chromatograph	Shimadzu Corporation		LC-20
High-pressure Steam Sterilizer	Sanyo Denki Shanghai Co., LTD		MLS-3780
Innoval C18 Chromatographic Column	Agela Technologies Co., LTD		4.6 mm × 250 mm, 5 µm
L-cysteine Hydrochloride	Beijing Abxing Biotechnology Co., LTD	BGASY01	BR
Liver Extract Powder	Beijing Abxing Biotechnology Co., LTD	01-085	BR
Luteolin	National Institutes for Food and Drug Control		>98%
Magnetic Stirrer	Ika Werke Co., LTD		RCT basic
Methanol	Thermo Fisher Scientific	20240901312	AR
Millipore Filter Membrane	Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.		0.22 µL × 50 mm
Orientin	Yishiming (Beijing) Biotechnology Co., LTD	19120601	>98%
Peptone	Beijing Abxing Biotechnology Co., LTD	1685787	BR
Petri Dish	Beijing Biodee Biotechnology Co., LTD		150 mm
Sodium Chloride	Beijing Abxing Biotechnology Co., LTD	BN20008	AR
Sodium Thioglycolate	Shanghai Jianglai Biotechnology Co., LTD	J031S219019	AR
Soluble Starch	Beijing Abxing Biotechnology Co., LTD	S9765	BR
Soya Peptone	Beijing Abxing Biotechnology Co., LTD	2147955	BR
Tryptone	Agela Technologies Co., LTD	1685787	BR
Ultrasonic Cleaner	Kun Shan Ultrasonic Instruments Co., LTD		KQ-500DE
Yeast Extract	Beijing Abxing Biotechnology Co., LTD	01-014	BR