JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

يصف هذا البروتوكول كيف يحقق الحقن داخل الطحال للحمض النووي الريبي الصغير الذي يتم تسليمه بواسطة AAV8 نفس كفاءة الضربة القاضية للجين في الكبد مثل حقن الوريد البابي ، مما يمثل إجراء أبسط مع انخفاض بكثير في معدل الوفيات والمضاعفات في الفترة المحيطة بالجراحة وبعد الجراحة.

Abstract

الكبد هو عضو رئيسي يؤدي وظائف التمثيل الغذائي الأساسية. يوفر تطوير طريقة فعالة وآمنة للقضاء على التعبير الجيني في الكبد أداة مهمة لتحديد وظيفة الجينات في الفيزيولوجيا المرضية للكبد. في هذه الدراسة ، نصف طريقة للحقن داخل الطحال من النمط المصلي للفيروس المرتبط بالغدة 8 (AAV8) المصممة للتعبير عن الحمض النووي الريبي الصغير لدبوس الشعر (shRNA) ضد الجين المستهدف المعني ، النيوكليوستمين (NS). حقق الحقن داخل الطحال ل AAV8 الذي يعبر عن shRNA الذي يستهدف NS(AAV8-shNS1) نفس كفاءة الضربة القاضية ل NS في الكبد كما فعل حقن الوريد البابي ، مقارنة بحقن AAV8 الذي يعبر عن تسلسل متقطع shRNA (AAV8-shScr). علاوة على ذلك ، أدى حقن فيروس AAV8-shRNA إلى الحد الأدنى من التفاعلات الالتهابية في حمة الكبد. الأهم من ذلك ، أن بروتوكول الحقن داخل الطحال هذا لم يكن متطلبا من الناحية الفنية وتسبب في الحد الأدنى من النزيف في موقع الحقن ، وهو السبب الرئيسي للوفيات في الفترة المحيطة بالجراحة وبعد الجراحة عند إجراء حقن الوريد البابي. تشير هذه الدراسة إلى طريقة محسنة وآمنة نسبيا لتحقيق ضربة قاضية فعالة للجينات في الكبد.

Introduction

الكبد هو عضو حيوي يقوم باستقلاب العناصر الغذائية والمواد الكيميائية ، ولكنه أيضا يتعرض باستمرار للإهانات السامة للخلايا والمسرطنة. في حين أن الكبد البالغ قادر على إعادة النمو بعد الإصابة ، فإن قوته التجديدية تتأثر بشدة بعمر1. حتى الآن ، فإن الخيار العلاجي الوحيد للمرضى الذين يعانون من أمراض الكبد المزمنة في المرحلة النهائية أو تلف الكبد الحاد الهائل هو زراعة الكبد ، والتي تطرح العديد من التحديات الخاصةبها 2. لفهم الفيزيولوجيا المرضية الجزيئية للكبد بشكل أفضل من خلال استجواب وظائف الجينات ذات الأهمية ، تم تطوير التلاعب الجيني للتطبيق في الجسم الحي ، بما في ذلك الضربة القاضية بوساطة RNAi والحذف المستهدف بواسطة Cre recombinase في وجود مواقع loxP3. يمكن تسليم كاسيت التعبير Cre وبناء shRNA بواسطة المركبات الفيروسية.

النمط المصلي للفيروس 8 المرتبط بالغدة (AAV8) هو ناقل قوي لتوصيل الجينات إلى أنواع الأنسجة الانتقائية (على سبيل المثال ، الكبد والعضلات الهيكلية والقلب والدماغ والبنكرياس) بكفاءة عالية واستجابة التهابية منخفضة4،5. لاستهداف أعضاء الجسم الداخلية ، يتم إدخال AAV8 عادة عن طريق حقن وريد الذيل ، حيث تنتقل الجزيئات الفيروسية أولا عبر الرئة قبل الوصول إلى الدورة الدموية الجهازية. في المقابل ، يسمح لهم حقن الوريد البابي بالوصول إلى الكبد أولا قبل أن ينتشر عبر الرئة ، وهو مصدر محتمل للعزل والتخفيف. ومع ذلك ، فإن حقن الوريد البابي يمثل تحديا تقنيا وغالبا ما يكون معقدا بسبب النزيف الناجم عن العملية وارتفاع معدل الوفيات. لتحقيق ضربة قاضية فعالة للجينات (KD) في الكبد مع تجنب مشكلة ارتفاع معدل الوفيات في الفترة المحيطة / بعد الجراحة ، اختبرنا طريقة للحقن داخل الطحال ل AAV8 التي تحمل shRNA هندسيا يستهدف النيوكليوستمين (NS) (AAV8-shNS1) وقارنا كفاءته في KD بتلك الخاصة بحقن الوريد البابي AAV8-shNS1.

NS هو بروتين غني بالخلايا الجذعية / السلفية تم اكتشافه أولا في الخلايا الجذعية العصبية ولاحقا في عدة أنواع أخرى من الخلايا الجذعية والسرطانات6،7. تظهر الأهمية البيولوجية ل NS من خلال النمط الظاهري الجنيني المبكر المميت لفئران NS-knockout (NSKO) في الجسم الحي3،8 والاضطراب الناجم عن NSKD للتجديد الذاتي في المختبر9،10. في البالغة ، توجد مستويات عالية من تعبير NS في الخصية والعديد من الأنسجة التي تخضع للتجدد ، بما في ذلك الخلايا الظهارية المصطبغة بالنيوت بعد استئصال العدس وخلايا العضلات بعد بتر الأطراف11 ، بالإضافة إلى تجديد أنسجة الثدييات ، مثل خلايا عضلة القلب في الفئران بعد إصابة القلب12 وخلايا الكبد بعد إصابة الكبد (على سبيل المثال ، CCl4) أو الاستئصال الجراحي (على سبيل المثال ، استئصال الكبد الجزئي)13،14. علاوة على ذلك ، ثبت أن NS يلعب أدوارا مهمة في تطور أورام الثدي والكبد والفم15،16،17. ميكانيكيا ، ثبت أن NS يعزز التجديد الذاتي من خلال حماية الجينوم المتماثل من تلف الحمض النووي18،19. ومع ذلك ، نظرا للنمط الظاهري الجنيني القاتل المبكر للخط الجرثومي NSKO ، هناك حاجة إلى طريقة تجريبية لإدخال NSKD مؤقتا بعد الانتهاء من نمو الأنسجة لتحديد أنشطتها البيولوجية في الأعضاء البالغة.

في هذه المقالة ، نستخدم NS كمثال على ذلك لتوضيح إنشاء واختبار طريقة جين الكبد في الجسم الحي KD التي تتسم بالكفاءة وذات معدل وفيات منخفض ناتج عن الإجراءات.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

تمت مراجعة جميع التجارب على التي تم إكمالها في هذه الدراسة والموافقة عليها من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدامه (IACUC) في مركز العلوم الصحية بجامعة تكساس إيه آند إم في هيوستن (رقم الموافقة: 2021-0264-IBT) وتم إجراؤها وفقا والامتثال لجميع الإرشادات التنظيمية والمؤسسية ذات الصلة. تم استخدام إناث الفئران C57BL / 6J (4-5 أشهر ، وزن الجسم 23-30 جم). تفاصيل الكواشف والمعدات المستخدمة مدرجة في جدول المواد.

1. AAV8- تصميم وإنتاج shRNA

ملاحظة: يرجى الرجوع إلى Sands et al.4 للحصول على التفاصيل الإجرائية.

  1. إحساس التصميم وقليل النوكليوتيدات shRNA المضادة للإحساس التي تستهدف تسلسلا طويلا مكونا من 21 نيوكليوتيد داخل منطقة الترميز للجين محل الاهتمام. في هذه الحالة ، تم استخدام NS للفأر (shNS1) وتسلسل مختلط من 21 نيوكليوتيد كتحكم سلبي (shScr) (الشكل 1 أ ، اللوحة السفلية).
  2. قم بتضمين تسلسل حلقة جذعية من TTCAAGAGA ، ونهاية حادة 5 بوصات ، ونهاية متماسكة متوافقة مع XhoI مقاس 3 بوصات ، وتسلسل إحساس مستهدف خاص بالجين ل 5'-GAA CTA AAA CAG CAG CAG AAA-3 '(shNS1) أو تسلسل مشوش من 5'-TCT CGC TTG GGC GAG AGT AAG-3 '(shScr).
  3. الفوسفوريلات والتلدين كل زوج من قليل النوكليوتيدات.
  4. هضم ناقل نقل الجينات AAV ، AV5-siRNA-GFP (الشكل 1 أ ، اللوحة العلوية) ، مع HpaI و XhoI ، وإزالة الفوسفوريلات ، والهلام لتنقية جزء الناقل.
  5. ربط قليل النوكليوتيدات الملدنة في ناقل منقى بالهلام.
  6. تحويل منتجات الحمض النووي المربوطة إلى بكتيريا DH5α المختصة بكفاءة الاستنساخ الفرعي.
  7. اختر المستنسخة المفردة عن طريق مقاومة الأمبيسلين وقم بزراعة 100 مل من أجل التحضير الصغير للبلازميد. تأكد من الاستنساخ الصحيح عن طريق التسلسل وإعداد البلازميدات باستخدام المجموعة الخالية من السموم الداخلية المتوفرة تجاريا (باتباع تعليمات الشركة المصنعة).
  8. قم بتعبئة فيروسات AAV8 عن طريق نقل ناقل نقل AV5 والنمط المصلي Rep/Cap 8 والبلازميدات المساعدة AdF6 إلى خلايا 293T باستخدام كاشف الإرسال iMFectin. تم نقل ما مجموعه 40 × 15 سم وحصادها / هضمها بعد 3 أيام من التعدين.
  9. استعادة AAV8 المرتبط بالخلايا عن طريق تحلل الخلايا وترسيب AAV8 المفرز بالوسائط بنسبة 40٪ PEG. بعد الهضم ، اجمع بين فيروسات AAV8 في محللة الخلية والوسط ، وتنقيها على تدرج يوديكسانول متقطع ، وركز في وحدات الطرد المركزي لقطع الوزن الجزيئي (1،00،000 ميجاوات).
  10. قم بقياس عيار AAV8 بواسطة نقطة النهاية المطلقة qPCR باستخدام الاشعال: WPRE-172 (5'- TTTATGAGGAGTTGGCCC-3') و WPRE-392 (5'- CAACACCACGGAATTGTCAG-3').

2. الحقن داخل الطحال من AAV8 (الشكل 1 ب ، 1 ج) 

  1. ضع الفئران C57BL6 / J في غرفة تخدير مملوءة ب 2٪ من الأيزوفلوران والأكسجين (باتباع البروتوكولات المعتمدة مؤسسيا). بعد فقدان الوعي ، انقل الفئران إلى المنطقة الجراحية المعقمة في وضع الاستلقاء الجانبي الأيمن. حافظ على التخدير بنسبة 2٪ من الأيزوفلوران مع توصيل الأكسجين عبر مخروط الأنف.
  2. تعقيم موقع الشق ب 2٪ كلورهيكسيدين متبوعا بنسبة 80٪ إيثانول. استخدم مقصا طبيا مقاس 6.3 بوصة لعمل شق 15 مم على جدار البطن العلوي الأيسر ، متبوعا بشق 10 مم في الصفاق.
  3. قم بتعريض الطحال برفق باستخدام الملقط وثبته في مكانه باستخدام شاش مبلل يوضع أسفل العضو.
  4. امزج بلطف وحقن فيروسات AAV8 (50 ميكرولتر) على مدى 30 ثانية في الطحال باستخدام إبرة 30 جم مع وضع الطرف على عمق 3 مم تحت السطح (الشكل 1 ب). غطي موقع الحقن بقطعة من قطعة قطن وضغطي لمدة 1 دقيقة.
  5. خياطة الصفاق بخياطة أمعاء كرومية قابلة للامتصاص 4-0.
  6. أغلق جدار البطن والجلد بخياطة حريرية 4-0.
  7. ضع الفئران في قفص نظيف فوق وسادة حرارية كهربائية وراقبها حتى الشفاء.

3. حقن الوريد البابي ل AAV8

  1. تخدير الفئران C57BL6 / J عن طريق استنشاق الأيزوفلوران (2٪) ممزوجا بالأكسجين (باتباع البروتوكولات المعتمدة مؤسسيا).
  2. إجراء شق البطن4،13 من خلال شق خط الوسط (~ 1 بوصة) على الجلد ثم في الصفاق.
  3. ضع وسادة شاش معقمة مبللة بمحلول ملحي معقم على الجانب الأيسر من الفأر واستخدم قطعة قطن معقمة لسحب الأمعاء الغليظة والدقيقة برفق. ضع الأمعاء فوق شاش مبلل وقم بتغطيته بقطعة لتجنب ملامسة الجلد أو الجفاف.
  4. حقن فيروس AAV في الوريد البابي بإبرة معقمة 32 جم بحجم 50 ميكرولتر. أدخل الإبرة 3-5 مم في وريد المنفذ بزاوية أقل من 5 درجات. اسمح للدم بالتدفق عبر الإبرة لمدة 5 ثوان لتجنب التدفق العكسي.
  5. ضع طرف قطعة قطن معقمة أعلى موقع الحقن بضغط برفق حتى إغلاق الوريد بالكامل وعدم حدوث نزيف (حوالي 5 دقائق) لتجنب النزيف.
  6. ضع الأعضاء الداخلية برفق مرة أخرى في تجويف البطن.
  7. أغلق جدار البطن والجلد بخياطة حريرية 4-0.

4. تحليل qRT-PCR

  1. استخرج الحمض النووي الريبي من 50-100 مجم من أنسجة الكبد4،13 باستخدام كاشف عزل الحمض النووي الريبي المتاح تجاريا باتباع تعليمات الشركة المصنعة (انظر جدول المواد).
  2. قم بتجميع 1st strand cDNAs من إجمالي الحمض النووي الريبي باستخدام سداسيات عشوائية و M-MLV للنسخ العكسي20،21.
  3. حدد قيم ΔC (t) بين الجين المستهدف والجينات المرجعية باستخدام نظام الكشف عن تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الفعلي أحادي اللون والكاشف الأخضر SYBR الفائق المزيج بعد التقارير المنشورةسابقا 22،23.
  4. قم بقياس قيم ΔΔC (t) من أربعة تكرارات بيولوجية وثلاثة تكرارات تقنية (ن = 12). اضبط Tm على 60 درجة مئوية لجميع التفاعلات. تأكيد النتائج باستخدام جينين مرجعيين ، Rps3 و Rplp0.
  5. تسلسلات التصميم التمهيدي على النحو التالي: Ns ، 5'-gtc tga tct agt acc aaa gg-3 'و 5'-ggg aaa cca atc act cca ac-3 '; Rps3 و 5'-atg gcg gtg cag att tcc aa-3 'و 5'-cat tct gtg tcc tgg tgg c-3 '; Rplp0 و 5'-ctg aag tgc tcg aca tca ca-3 'و 5'-agt ctc cac aga caa tgc ca-3'.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

كفاءات الجين KD في الكبد عن طريق داخل الطحال مقابل. حقن الوريد البابي ل AAV8-shRNA
تم تخفيف المخزونات الفيروسية AAV8 إلى تركيز عمل يبلغ 2E + 12 نسخة جينوم (gc) لكل مليلتر (gc / mL). تم حقن الفئران الفردية ب 1E + 11 gc من AAV8-shNS1 أو AAV8-shScr (50 ميكرولتر) عن طريق حقن داخل الطحال أو ?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

الجين KD عن طريق التوصيل الفيروسي إما لبناء التعبير عن shRNA في خلفية من النوع البري24،25 أو بناء Cre المعبر عن إعادة التركيب في خلفية floxed26 هي طريقة قوية لاستجواب وظيفة الجينات في الجسم الحي بطريقة محفزة يتم التحكم فيها بالوقت. ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

ويعلن أصحاب البلاغ عدم وجود تضارب في المصالح.

Acknowledgements

تم دعم هذا العمل من قبل جائزة أبحاث الباحث الفردي (RP200081) لمعهد أبحاث الوقاية من السرطان في تكساس (CPRIT) إلى RYT.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Amicon filter centrifugation unitsMilliporeSigmaUFC9100Fast ultrafiltration
AV5-siRNA-GFP Addgene #124972Plasmid
Competent DH5α bacteria Invitrogen#18265-017Chemically competent strain for cloning 
HpaI New England BiolabsR0105Restriction enzyme
iMFectin transfection reagent GenDepotI7100-101
M-MLV reverse transcriptase PromegaM1708RNA-dependent DNA polymerase 
MyiQ single-color real-time PCR detection system Bio-RadBUN9740RADqRT-PCR
Omega endotoxin-free kit BioteckD6915-03Plasmid DNA midi prep 
Random hexamers Invitrogen48190-011
Supermix SYBR green reagent Bio-Rad1708882Real-time PCR applications
T4 DNA LigasePromegaM1801
TRIzol Reagent Life Technologies15596-018Isolation of high-quality total RNA
XhoINew England BiolabsR0146Restriction enzyme

References

  1. Wang, J., et al. Epigenome-wide analysis of aging effects on liver regeneration. BMC Biol. 21 (1), 30(2023).
  2. Jindal, A., Jagdish, R. K., Kumar, A. Hepatic regeneration in cirrhosis. J Clin Exp Hepatol. 12 (2), 603-616 (2022).
  3. Meng, L., et al. Nucleostemin deletion reveals an essential mechanism that maintains the genomic stability of stem and progenitor cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (28), 11415-11420 (2013).
  4. Sands, M. S. Aav-mediated liver-directed gene therapy. Methods Mol Biol. 807, 141-157 (2011).
  5. Tenney, R. M., Bell, C. L., Wilson, J. M. AAV8 capsid variable regions at the two-fold symmetry axis contribute to high liver transduction by mediating nuclear entry and capsid uncoating. Virology. 454-455, 227-236 (2014).
  6. Tsai, R. Y., Mckay, R. D. A nucleolar mechanism controlling cell proliferation in stem cells and cancer cells. Genes Dev. 16 (23), 2991-3003 (2002).
  7. Tsai, R. Y., Meng, L. Nucleostemin: A latecomer with new tricks. Int J Biochem Cell Biol. 41 (11), 2122-2124 (2009).
  8. Zhu, Q., Yasumoto, H., Tsai, R. Y. Nucleostemin delays cellular senescence and negatively regulates trf1 protein stability. Mol Cell Biol. 26 (24), 9279-9290 (2006).
  9. Qu, J., Bishop, J. M. Nucleostemin maintains self-renewal of embryonic stem cells and promotes reprogramming of somatic cells to pluripotency. J Cell Biol. 197 (6), 731-745 (2012).
  10. Lin, T., Meng, L., Li, Y., Tsai, R. Y. Tumor-initiating function of nucleostemin-enriched mammary tumor cells. Cancer Res. 70 (22), 9444-9452 (2010).
  11. Maki, N., et al. Rapid accumulation of nucleostemin in nucleolus during newt regeneration. Dev Dyn. 236 (4), 941-950 (2007).
  12. Siddiqi, S., et al. Myocardial induction of nucleostemin in response to postnatal growth and pathological challenge. Circ Res. 103 (1), 89-97 (2008).
  13. Lin, T., Ibrahim, W., Peng, C. -Y., Finegold, M. J., Tsai, R. Y. A novel role of nucleostemin in maintaining the genome integrity of dividing hepatocytes during mouse liver development and regeneration. Hepatology. 58 (6), 2176-2187 (2013).
  14. Shugo, H., et al. Nucleostemin in injury-induced liver regeneration. Stem Cells Dev. 21 (16), 3044-3054 (2012).
  15. Lin, T., et al. Nucleostemin reveals a dichotomous nature of genome maintenance in mammary tumor progression. Oncogene. 38 (20), 3919-3931 (2019).
  16. Wang, J., et al. Nucleostemin modulates outcomes of hepatocellular carcinoma via a tumor adaptive mechanism to genomic stress. Mol Cancer Res. 18 (5), 723-734 (2020).
  17. Crawford, M., Liu, X., Cheng, Y. L., Tsai, R. Y. Nucleostemin upregulation and stat3 activation as early events in oral epithelial dysplasia progression to squamous cell carcinoma. Neoplasia. 23 (12), 1289-1299 (2021).
  18. Lin, T., Meng, L., Wu, L. J., Pederson, T., Tsai, R. Y. Nucleostemin and gnl3l exercise distinct functions in genome protection and ribosome synthesis, respectively. J Cell Sci. 127 (10), 2302-2312 (2014).
  19. Tsai, R. Y. Balancing self-renewal against genome preservation in stem cells: How do they manage to have the cake and eat it too. Cell Mol Life Sci. 73 (9), 1803-1823 (2016).
  20. Meng, L., Hsu, J. K., Tsai, R. Y. Gnl3l depletion destabilizes mdm2 and induces p53-dependent G2/m arrest. Oncogene. 30 (14), 1716-1726 (2011).
  21. Huang, G., Meng, L., Tsai, R. Y. P53 configures the G2/m arrest response of nucleostemin-deficient cells. Cell Death Discov. 1, e15060(2015).
  22. Liu, X., Wang, J., Wu, L. J., Trinh, B., Tsai, R. Y. L. IMPDH inhibition decreases TERT expression and synergizes the cytotoxic effect of chemotherapeutic agents in glioblastoma cells. Int J Mol Sci. 25 (11), 5992(2024).
  23. Liu, X., Wang, J., Li, F., Timchenko, N., Tsai, R. Y. L. Transcriptional control of a stem cell factor nucleostemin in liver regeneration and aging. PLoS One. 19 (9), e0310219(2024).
  24. Mayra, A., et al. Intraperitoneal AAV9-shRNA inhibits target expression in neonatal skeletal and cardiac muscles. Biochem Biophys Res Commun. 405 (2), 204-209 (2011).
  25. Cohen, A., et al. Virus-mediated shRNA knockdown of prodynorphin in the rat nucleus accumbens attenuates depression-like behavior and cocaine locomotor sensitization. PLoS One. 9 (5), e97216(2014).
  26. Jeon, Y., et al. Topbp1 deficiency causes early embryonic lethality and induces cellular senescence in primary cells. J Biol Chem. 286 (7), 5414-5422 (2011).
  27. Smith, T. A., et al. Adenovirus-mediated expression of therapeutic plasma levels of human factor IX in mice. Nat Genet. 5 (4), 397-402 (1993).
  28. Nakai, H., Iwaki, Y., Kay, M. A., Couto, L. B. Isolation of recombinant adeno-associated virus vector-cellular DNA junctions from mouse liver. J Virol. 73 (7), 5438-5447 (1999).
  29. Jung, S. C., et al. Adeno-associated viral vector-mediated gene transfer results in long-term enzymatic and functional correction in multiple organs of Fabry mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 98 (5), 2676-2681 (2001).
  30. Hurford, R. K., Dranoff, G., Mulligan, R. C., Tepper, R. I. Gene therapy of metastatic cancer by in vivo retroviral gene targeting. Nat Genet. 10 (4), 430-435 (1995).
  31. Sarkar, R., Xiao, W., Kazazian, H. H. Jr A single adeno-associated virus (AAV)-murine factor viii vector partially corrects the hemophilia a phenotype. J Thromb Haemost. 1 (2), 220-226 (2003).
  32. Czekaj, P., et al. Optimization of methods for intrasplenic administration of human amniotic epithelial cells in order to perform safe and effective cell-based therapy for liver diseases. Stem Cell Rev Rep. 20 (6), 1599-1617 (2024).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

213 AAV8 AAV8 shRNA

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved