JoVE Logo
Autores
Entre em contato

Entrar

É necessária uma assinatura da JoVE para visualizar este conteúdo. Faça login ou comece sua avaliação gratuita.

Neste Artigo

  • Resumo
  • Resumo
  • Introdução
  • Protocolo
  • Resultados
  • Discussão
  • Divulgações
  • Agradecimentos
  • Materiais
  • Referências
  • Reimpressões e Permissões

Resumo

Este protocolo descreve como a injeção intraesplênica de RNA em grampo de cabelo pequeno entregue por AAV8 atinge a mesma eficiência de knockdown de genes no fígado que a injeção na veia porta, representando um procedimento mais simples com mortalidade e complicações perioperatórias e pós-operatórias muito menores.

Resumo

O fígado é um órgão importante que desempenha funções metabólicas essenciais. O desenvolvimento de um método eficiente e seguro para reduzir a expressão gênica no fígado fornece uma ferramenta importante para determinar a função gênica na fisiopatologia hepática. Neste estudo, descrevemos um método para injeção intraesplênica de vírus adeno-associado sorotipo 8 (AAV8) projetado para expressar um pequeno RNA em grampo (shRNA) contra um gene alvo de interesse, nucleostemina (NS). A injeção intraesplênica de AAV8 expressando um shRNA direcionado a NS (AAV8-shNS1) alcançou a mesma eficiência de knockdown de NS no fígado que a injeção na veia porta, em comparação com a injeção de AAV8 expressando uma sequência embaralhada shRNA (AAV8-shScr). Além disso, a injeção do vírus AAV8-shRNA desencadeou reações inflamatórias mínimas no parênquima hepático. Mais importante ainda, este protocolo de injeção intraesplênica não foi tecnicamente exigente e causou sangramento mínimo no local da injeção, que é a principal causa de mortalidade perioperatória e pós-operatória ao realizar a injeção da veia porta. Este estudo relata um método aprimorado e relativamente seguro para obter um knockdown genético eficiente no fígado.

Introdução

O fígado é um órgão vital que metaboliza nutrientes e produtos químicos, mas também está sob constante exposição a insultos citotóxicos e cancerígenos. Embora o fígado adulto seja capaz de crescer novamente após uma lesão, seu poder regenerativo é severamente prejudicado por1 ano de idade. Até o momento, a única opção terapêutica para pacientes com doenças hepáticas crônicas em estágio terminal ou dano hepático agudo maciço é o transplante hepático, que apresenta muitos desafios por si só2. Para entender melhor a fisiopatologia molecular do fígado, interrogando as funções dos genes de interesse, manipulações genéticas foram desenvolvidas para aplicação in vivo , incluindo knockdown mediado por RNAi e deleção direcionada por uma Cre recombinase na presença de locais loxP3. O de expressão Cre e a construção shRNA podem ser entregues por veículos virais.

O sorotipo 8 do vírus adeno-associado (AAV8) é um vetor robusto para entrega de genes a tipos seletivos de tecidos (por exemplo, fígado, músculo esquelético, coração, cérebro e pâncreas) com alta eficiência e baixa resposta inflamatória 4,5. Para atingir os órgãos internos do corpo, o AAV8 é comumente introduzido por injeção na veia da cauda, na qual as partículas virais viajam primeiro pelo pulmão antes de atingir a circulação sistêmica. Em contraste, a injeção da veia porta permite que eles cheguem ao fígado antes de circular pelo pulmão, uma fonte potencial de sequestro e diluição. No entanto, a injeção da veia porta é tecnicamente desafiadora e muitas vezes complicada pelo sangramento induzido pela operação e uma alta taxa de mortalidade. Para obter um knockdown genético eficiente (KD) no fígado, evitando o problema de alta mortalidade peri / pós-operatória, testamos um método de injeção intraesplênica de AAV8 carregando um shRNA projetado visando nucleostinada (NS) (AAV8-shNS1) e comparamos sua eficiência KD com a de AAV8-shNS1 injetado na veia porta.

A NS é uma proteína enriquecida com células-tronco / progenitoras descoberta primeiro em células-tronco neurais e depois em vários outros tipos de células-tronco e cânceres 6,7. A importância biológica da NS é demonstrada pelo fenótipo letal embrionário precoce de camundongos germinativos nocaute para NS (NSKO) in vivo 3,8 e pela perturbação da auto-renovação induzida por NSKD in vitro 9,10. Em animais adultos, altos níveis de expressão de NS são encontrados no testículo e em vários tecidos em regeneração, incluindo as células epiteliais pigmentadas por tritões desdiferenciáveis após lentectomia e células musculares após amputação de membros11, bem como tecidos de mamíferos em regeneração, como cardiomiócitos de camundongos após lesão cardíaca12 e hepatócitos após lesão hepática (por exemplo, CCl4) ou ressecção cirúrgica (por exemplo, hepatectomia parcial)13,14. Além disso, a SN demonstrou desempenhar papéis importantes no desenvolvimento de tumores mamários, hepáticos e orais 15,16,17. Mecanicamente, a NS demonstrou promover a auto-renovação, protegendo o genoma replicante de danos ao DNA18,19. No entanto, devido ao fenótipo letal embrionário precoce da linha germinativa NSKO, é necessário um método experimental para introduzir temporariamente a NSKD após a conclusão do desenvolvimento do tecido para determinar melhor suas atividades biológicas em órgãos adultos.

Neste artigo, usamos o NS como um caso em questão para ilustrar o estabelecimento e teste de um método de DK do gene hepático in vivo que é eficiente e tem uma baixa mortalidade induzida por procedimento.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocolo

Todos os experimentos com animais concluídos neste estudo foram revisados e aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) no Centro de Ciências da Saúde da Universidade Texas A&M em Houston (número de aprovação: 2021-0264-IBT) e realizados de acordo e em conformidade com todas as diretrizes regulatórias e institucionais relevantes. Foram utilizados camundongos C57BL/6J fêmeas (4-5 meses de idade, peso corporal 23-30 g). Os detalhes dos reagentes e equipamentos usados estão listados na Tabela de Materiais.

1. AAV8- design e produção de shRNA

NOTA: Consulte Sands et al.4 para obter detalhes do procedimento.

  1. Oligonucleotídeos shRNA de design sense e anti-sense que visam uma sequência longa de 21 nucleotídeos dentro da região codificadora do gene de interesse. Neste caso, foram utilizados NS de camundongo (shNS1) e uma sequência embaralhada de 21 nucleotídeos como controle negativo (shScr) (Figura 1A, painel inferior).
  2. Inclua na estrutura do gancho uma sequência de alça de haste de TTCAAGAGA, uma extremidade romba de 5 ', uma extremidade coesiva compatível com XhoI de 3 'e uma sequência de sentido direcionado específica do gene de 5'-GAA CTA AAA CAG CAG AAA-3 '(shNS1) ou uma sequência embaralhada de 5'-TCT CGC TTG GGC GAG AGT AAG-3 '(shScr).
  3. Fosforilar e recozer cada par de oligonucleotídeos.
  4. Digerir o vetor de transferência do gene AAV, AV5-siRNA-GFP (Figura 1A, painel superior), com HpaI e XhoI, desfosforilar e purificar o gel do fragmento do vetor.
  5. Ligue oligonucleotídeos recozidos no vetor purificado por gel.
  6. Transforme produtos de DNA ligados em bactérias DH5α competentes com eficiência de subclonagem.
  7. Escolha clones únicos por resistência à ampicilina e cultive 100 mL de cultura bacteriana para minipreparação de plasmídeo. Confirme a clonagem correta por sequenciamento e prepare plasmídeos usando o kit livre de endotoxinas disponível comercialmente (seguindo as instruções do fabricante).
  8. Embale os vírus AAV8 transfectando o vetor de transferência AV5, o sorotipo 8 Rep/Cap e os plasmídeos auxiliares AdF6 em células 293T usando o reagente de transfecção iMFectin. Um total de 40 × placas de 15 cm foram transfectadas e colhidas/digeridas aos 3 dias pós-transfecção.
  9. Recupere AAV8 associado a células por lise celular e precipite AAV8 secretado por meio com 40% de PEG. Após a digestão, combinar os vírus AAV8 no lisado celular e no meio, purificar num gradiente descontínuo de iodixanol e concentrar em unidades de centrifugação de corte de peso molecular (1,00,000 MW).
  10. Quantifique os títulos de AAV8 por qPCR de endpoint absoluto com primers: WPRE-172 (5'- TTTATGAGGAGTTGTGGCCC-3') e WPRE-392 (5'- CAACACCACGGAATTGTCAG-3').

2. Injeção intraesplênica de AAV8 (Figura 1B, 1C) 

  1. Coloque os camundongos C57BL6/J em uma câmara de anestesia cheia de isoflurano a 2% e oxigênio (seguindo protocolos aprovados institucionalmente). Após a perda de consciência, transfira os camundongos para a área cirúrgica asséptica em decúbito lateral direito. Mantenha a anestesia com isoflurano a 2% com oxigênio fornecido por meio de um cone nasal.
  2. Esterilize o local da incisão com clorexidina a 2% seguida de etanol a 80%. Use uma tesoura médica de 6,3 polegadas para fazer uma incisão de 15 mm na parede abdominal superior esquerda, seguida por uma incisão de 10 mm no peritônio.
  3. Exponha suavemente o baço usando uma pinça e segure-o no lugar com uma gaze úmida colocada embaixo do órgão.
  4. Misture e injete suavemente os vírus AAV8 (50 μL) durante um período de 30 s no baço usando uma agulha de 30 G com a ponta colocada a uma profundidade de 3 mm abaixo da superfície (Figura 1B). Cubra o local da injeção com um pedaço de cotonete e comprima por 1 min.
  5. Suturar o peritônio com uma sutura de intestino crômico absorvível 4-0.
  6. Feche a parede abdominal e a pele com uma sutura de seda 4-0.
  7. Coloque os ratos em uma gaiola limpa em cima de uma almofada térmica elétrica e monitore-os até a recuperação.

3. Injeção de AAV8 na veia porta

  1. Anestesiar camundongos C57BL6/J por inalação de isoflurano (2%) misturado com oxigênio (seguindo protocolos aprovados institucionalmente).
  2. Realize a laparotomia 4,13 através de uma incisão na linha média (~ 1 polegada) na pele e depois no peritônio.
  3. Coloque uma gaze estéril embebida em solução salina estéril no lado esquerdo do mouse e use um cotonete estéril para retirar suavemente o intestino grosso e delgado. Coloque o intestino em cima de uma gaze molhada e cubra-a com uma almofada para evitar entrar em contato com a pele ou secar.
  4. Injete o vírus AAV na veia porta com uma agulha estéril de 32 G em um volume de 50 μL. Insira a agulha 3-5 mm na veia da porta em um ângulo inferior a 5 graus. Deixe o sangue fluir pela agulha por 5 s para evitar o refluxo.
  5. Coloque uma ponta de cotonete estéril em cima do local da injeção com uma leve pressão até o fechamento total da veia e sem sangramento (cerca de 5 min) para evitar sangramento.
  6. Coloque suavemente os órgãos internos de volta na cavidade abdominal.
  7. Feche a parede abdominal e a pele com sutura de seda 4-0.

4. Análise qRT-PCR

  1. Extrair ARNs de 50-100 mg de tecido hepático 4,13 utilizando um reagente de isolamento de ARN disponível no mercado, seguindo as instruções do fabricante (ver Tabela de Materiais).
  2. Sintetize cDNAs de fita1ª a partir de RNAs totais com hexâmeros aleatórios e transcriptase reversa M-MLV20,21.
  3. Determine os valores de ΔC(t) entre o gene alvo e os genes de referência usando o sistema de detecção de PCR em tempo real de cor única e o reagente verde SYBR supermix seguindo relatórios publicados anteriormente22,23.
  4. Medir os valores de ΔΔC(t) a partir de quatro réplicas biológicas e três repetições técnicas (n = 12). DefinirT m a 60 °C para todas as reacções. Confirme os resultados usando dois genes de referência, Rps3 e Rplp0.
  5. Projete sequências de primers da seguinte forma: Ns, 5'-gtc tga tct agt acc aaa gg-3' e 5'-ggg aaa cca atc act cca ac-3'; Rps3, 5'-atg gcg gtg cag att tcc aa-3' e 5'-cat tct gtg tcc tgg tgg c-3'; Rplp0, 5'-ctg aag tgc tcg aca tca ca-3' e 5'-agt ctc cac aga caa tgc ca-3'.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Resultados

Eficiências do gene KD no fígado por via intraesplênica vs. injeção de AAV8-shRNA na veia porta
Os estoques virais AAV8 foram diluídos para uma concentração de trabalho de 2E + 12 cópias do genoma (gc) por mililitro (gc / mL). Camundongos individuais foram injetados com 1E + 11 gc de AAV8-shNS1 ou AAV8-shScr (50 μL) por meio de injeção intraesplênica ou na veia porta. Duas semanas após a injeção, os tecidos hepáticos foram coletados ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussão

O gene KD por entrega viral de uma construção que expressa shRNA em um fundo de tipo selvagem24,25 ou construção de expressão de Cre recombinase em um fundo floxed26 é uma maneira poderosa de interrogar a função do gene in vivo de maneira induzível e controlada pelo tempo. Um método de entrega ideal para estudos in vivo do gene KO/KD deve alcançar uma alta eficiência de KO/KD ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Divulgações

Os autores declaram não haver conflito de interesses.

Agradecimentos

Este trabalho foi apoiado pelo Prêmio de Pesquisa de Investigador Individual (RP200081) do Instituto de Pesquisa de Prevenção do Câncer do Texas (CPRIT) para RYT.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
Amicon filter centrifugation unitsMilliporeSigmaUFC9100Fast ultrafiltration
AV5-siRNA-GFP Addgene #124972Plasmid
Competent DH5α bacteria Invitrogen#18265-017Chemically competent strain for cloning 
HpaI New England BiolabsR0105Restriction enzyme
iMFectin transfection reagent GenDepotI7100-101
M-MLV reverse transcriptase PromegaM1708RNA-dependent DNA polymerase 
MyiQ single-color real-time PCR detection system Bio-RadBUN9740RADqRT-PCR
Omega endotoxin-free kit BioteckD6915-03Plasmid DNA midi prep 
Random hexamers Invitrogen48190-011
Supermix SYBR green reagent Bio-Rad1708882Real-time PCR applications
T4 DNA LigasePromegaM1801
TRIzol Reagent Life Technologies15596-018Isolation of high-quality total RNA
XhoINew England BiolabsR0146Restriction enzyme

Referências

  1. Wang, J., et al. Epigenome-wide analysis of aging effects on liver regeneration. BMC Biol. 21 (1), 30(2023).
  2. Jindal, A., Jagdish, R. K., Kumar, A. Hepatic regeneration in cirrhosis. J Clin Exp Hepatol. 12 (2), 603-616 (2022).
  3. Meng, L., et al. Nucleostemin deletion reveals an essential mechanism that maintains the genomic stability of stem and progenitor cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (28), 11415-11420 (2013).
  4. Sands, M. S. Aav-mediated liver-directed gene therapy. Methods Mol Biol. 807, 141-157 (2011).
  5. Tenney, R. M., Bell, C. L., Wilson, J. M. AAV8 capsid variable regions at the two-fold symmetry axis contribute to high liver transduction by mediating nuclear entry and capsid uncoating. Virology. 454-455, 227-236 (2014).
  6. Tsai, R. Y., Mckay, R. D. A nucleolar mechanism controlling cell proliferation in stem cells and cancer cells. Genes Dev. 16 (23), 2991-3003 (2002).
  7. Tsai, R. Y., Meng, L. Nucleostemin: A latecomer with new tricks. Int J Biochem Cell Biol. 41 (11), 2122-2124 (2009).
  8. Zhu, Q., Yasumoto, H., Tsai, R. Y. Nucleostemin delays cellular senescence and negatively regulates trf1 protein stability. Mol Cell Biol. 26 (24), 9279-9290 (2006).
  9. Qu, J., Bishop, J. M. Nucleostemin maintains self-renewal of embryonic stem cells and promotes reprogramming of somatic cells to pluripotency. J Cell Biol. 197 (6), 731-745 (2012).
  10. Lin, T., Meng, L., Li, Y., Tsai, R. Y. Tumor-initiating function of nucleostemin-enriched mammary tumor cells. Cancer Res. 70 (22), 9444-9452 (2010).
  11. Maki, N., et al. Rapid accumulation of nucleostemin in nucleolus during newt regeneration. Dev Dyn. 236 (4), 941-950 (2007).
  12. Siddiqi, S., et al. Myocardial induction of nucleostemin in response to postnatal growth and pathological challenge. Circ Res. 103 (1), 89-97 (2008).
  13. Lin, T., Ibrahim, W., Peng, C. -Y., Finegold, M. J., Tsai, R. Y. A novel role of nucleostemin in maintaining the genome integrity of dividing hepatocytes during mouse liver development and regeneration. Hepatology. 58 (6), 2176-2187 (2013).
  14. Shugo, H., et al. Nucleostemin in injury-induced liver regeneration. Stem Cells Dev. 21 (16), 3044-3054 (2012).
  15. Lin, T., et al. Nucleostemin reveals a dichotomous nature of genome maintenance in mammary tumor progression. Oncogene. 38 (20), 3919-3931 (2019).
  16. Wang, J., et al. Nucleostemin modulates outcomes of hepatocellular carcinoma via a tumor adaptive mechanism to genomic stress. Mol Cancer Res. 18 (5), 723-734 (2020).
  17. Crawford, M., Liu, X., Cheng, Y. L., Tsai, R. Y. Nucleostemin upregulation and stat3 activation as early events in oral epithelial dysplasia progression to squamous cell carcinoma. Neoplasia. 23 (12), 1289-1299 (2021).
  18. Lin, T., Meng, L., Wu, L. J., Pederson, T., Tsai, R. Y. Nucleostemin and gnl3l exercise distinct functions in genome protection and ribosome synthesis, respectively. J Cell Sci. 127 (10), 2302-2312 (2014).
  19. Tsai, R. Y. Balancing self-renewal against genome preservation in stem cells: How do they manage to have the cake and eat it too. Cell Mol Life Sci. 73 (9), 1803-1823 (2016).
  20. Meng, L., Hsu, J. K., Tsai, R. Y. Gnl3l depletion destabilizes mdm2 and induces p53-dependent G2/m arrest. Oncogene. 30 (14), 1716-1726 (2011).
  21. Huang, G., Meng, L., Tsai, R. Y. P53 configures the G2/m arrest response of nucleostemin-deficient cells. Cell Death Discov. 1, e15060(2015).
  22. Liu, X., Wang, J., Wu, L. J., Trinh, B., Tsai, R. Y. L. IMPDH inhibition decreases TERT expression and synergizes the cytotoxic effect of chemotherapeutic agents in glioblastoma cells. Int J Mol Sci. 25 (11), 5992(2024).
  23. Liu, X., Wang, J., Li, F., Timchenko, N., Tsai, R. Y. L. Transcriptional control of a stem cell factor nucleostemin in liver regeneration and aging. PLoS One. 19 (9), e0310219(2024).
  24. Mayra, A., et al. Intraperitoneal AAV9-shRNA inhibits target expression in neonatal skeletal and cardiac muscles. Biochem Biophys Res Commun. 405 (2), 204-209 (2011).
  25. Cohen, A., et al. Virus-mediated shRNA knockdown of prodynorphin in the rat nucleus accumbens attenuates depression-like behavior and cocaine locomotor sensitization. PLoS One. 9 (5), e97216(2014).
  26. Jeon, Y., et al. Topbp1 deficiency causes early embryonic lethality and induces cellular senescence in primary cells. J Biol Chem. 286 (7), 5414-5422 (2011).
  27. Smith, T. A., et al. Adenovirus-mediated expression of therapeutic plasma levels of human factor IX in mice. Nat Genet. 5 (4), 397-402 (1993).
  28. Nakai, H., Iwaki, Y., Kay, M. A., Couto, L. B. Isolation of recombinant adeno-associated virus vector-cellular DNA junctions from mouse liver. J Virol. 73 (7), 5438-5447 (1999).
  29. Jung, S. C., et al. Adeno-associated viral vector-mediated gene transfer results in long-term enzymatic and functional correction in multiple organs of Fabry mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 98 (5), 2676-2681 (2001).
  30. Hurford, R. K., Dranoff, G., Mulligan, R. C., Tepper, R. I. Gene therapy of metastatic cancer by in vivo retroviral gene targeting. Nat Genet. 10 (4), 430-435 (1995).
  31. Sarkar, R., Xiao, W., Kazazian, H. H. Jr A single adeno-associated virus (AAV)-murine factor viii vector partially corrects the hemophilia a phenotype. J Thromb Haemost. 1 (2), 220-226 (2003).
  32. Czekaj, P., et al. Optimization of methods for intrasplenic administration of human amniotic epithelial cells in order to perform safe and effective cell-based therapy for liver diseases. Stem Cell Rev Rep. 20 (6), 1599-1617 (2024).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reimpressões e Permissões

Solicitar permissão para reutilizar o texto ou figuras deste artigo JoVE

Solicitar Permissão

Explore Mais Artigos

Pesquisa do C ncerEdi o 213V rus Adeno associadoAAV8RNA em grampo pequenoNucleosteminaFisiopatologia do F gadoInje o na Veia PortaRea es Inflamat riasAAV8 shRNAProtocolo de Inje oMortalidade Perioperat riaMortalidade P s Operat ria

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacidade

Termos de uso

Políticas

Entre em contato

recomende à biblioteca

Newsletter

Pesquisa

Educação

Autores

Bibliotecários

SOBRE A JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. Todos os direitos reservados