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In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt, wie die intrasplenische Injektion von AAV8-zugeführter kleiner Haarnadel-RNA in der Leber die gleiche Gen-Knockdown-Effizienz wie die Pfortader-Injektion erreicht, was ein einfacheres Verfahren mit viel geringerer perioperativer und postoperativer Mortalität und Komplikationen darstellt.

Zusammenfassung

Die Leber ist ein wichtiges Organ, das wesentliche Stoffwechselfunktionen erfüllt. Die Entwicklung einer effizienten und sicheren Methode zur Unterdrückung der Genexpression in der Leber ist ein wichtiges Werkzeug zur Bestimmung der Genfunktion in der Pathophysiologie der Leber. In dieser Studie beschreiben wir eine Methode zur intrasplenischen Injektion des Adeno-assoziierten Virus Serotyp 8 (AAV8), die so entwickelt wurde, dass sie eine kleine Haarnadel-RNA (shRNA) gegen ein Zielgen von Interesse, Nukleostemin (NS), exprimiert. Die intrasplenische Injektion von AAV8, die eine NS-gerichtete shRNA (AAV8-shNS1) exprimiert, erreichte die gleiche Knockdown-Effizienz von NS in der Leber wie die Pfortader-Injektion im Vergleich zur Injektion von AAV8, die eine verschlüsselte Sequenz-shRNA (AAV8-shScr) exprimiert. Darüber hinaus löste die Injektion des AAV8-shRNA-Virus minimale Entzündungsreaktionen im Leberparenchym aus. Am wichtigsten ist, dass dieses intrasplenische Injektionsprotokoll technisch nicht anspruchsvoll war und minimale Blutungen an der Injektionsstelle verursachte, was die Hauptursache für perioperative und postoperative Mortalität bei der Pfortaderinjektion ist. Diese Studie berichtet über eine verbesserte und relativ sichere Methode, um einen effizienten Gen-Knockdown in der Leber zu erreichen.

Einleitung

Die Leber ist ein lebenswichtiges Organ, das Nährstoffe und Chemikalien verstoffwechselt, aber auch ständig zytotoxischen und krebserregenden Schädigungen ausgesetzt ist. Während die erwachsene Leber in der Lage ist, nach einer Verletzung nachzuwachsen, wird ihre Regenerationsfähigkeit im Alter von1 Lebensjahr stark beeinträchtigt. Bisher ist die einzige Therapieoption für Patienten mit chronischen Lebererkrankungen im Endstadium oder massiven akuten Leberschäden die Lebertransplantation, die viele eigene Herausforderungen mit sich bringt2. Um die molekulare Pathophysiologie der Leber durch die Untersuchung der Funktionen von Genen von Interesse besser zu verstehen, wurden genetische Manipulationen für die In-vivo-Anwendung entwickelt, einschließlich RNAi-vermitteltem Knockdown und gezielter Deletion durch eine Cre-Rekombinase in Gegenwart von loxP-Stellen3. Die Cre-Expressionskassette und das shRNA-Konstrukt können von viralen Vehikeln abgegeben werden.

Das Adeno-assoziierte Virus Serotyp 8 (AAV8) ist ein robuster Vektor für die Genübertragung an ausgewählte Gewebetypen (z. B. Leber, Skelettmuskulatur, Herz, Gehirn und Bauchspeicheldrüse) mit hoher Effizienz und geringer Entzündungsreaktion 4,5. Um auf innere Körperorgane abzuzielen, wird AAV8 häufig durch Schwanzveneninjektion eingeführt, bei der Viruspartikel zuerst durch die Lunge wandern, bevor sie den systemischen Kreislauf erreichen. Im Gegensatz dazu ermöglicht die Pfortaderinjektion, dass sie zuerst die Leber erreichen, bevor sie durch die Lunge zirkulieren, eine potenzielle Quelle für Sequestrierung und Verdünnung. Die Pfortaderinjektion ist jedoch technisch anspruchsvoll und wird oft durch operationsbedingte Blutungen und eine hohe Mortalitätsrate erschwert. Um einen effizienten Gen-Knockdown (KD) in der Leber zu erreichen und gleichzeitig das Problem einer hohen peri-/postoperativen Mortalität zu vermeiden, haben wir eine Methode zur intrasplenischen Injektion von AAV8 getestet, die eine manipulierte shRNA trägt, die auf Nukleostemin (NS) abzielt (AAV8-shNS1), und ihre KD-Effizienz mit der von AAV8-shNS1 verglichen, die in die Pfortadern injiziert sind.

NS ist ein mit Stamm-/Vorläuferzellen angereichertes Protein, das zuerst in neuralen Stammzellen und später in mehreren anderen Arten von Stammzellen und Krebs entdeckt wurde 6,7. Die biologische Bedeutung von NS wird durch den frühen embryonalen letalen Phänotyp von Keimbahn-NS-Knockout-Mäusen (NSKO) in vivo gezeigt 3,8 und durch die NSKD-induzierte Störung der Selbsterneuerung in vitro 9,10. Bei erwachsenen Tieren findet sich eine hohe NS-Expression im Hoden und in mehreren Geweben, die sich in der Regeneration befinden, einschließlich der dedifferenzierenden molchpigmentierten Epithelzellen nach Lentektomie und Muskelzellen nach Amputation von Gliedmaßen11, sowie regenerierender Säugetiergewebe, wie z. B. Kardiomyozyten von Mäusen nach Herzverletzungen12 und Hepatozyten nach Leberschädigung (z. B.CCl 4) oder chirurgischer Resektion (z. B. partielle Hepatektomie)13,14. Darüber hinaus wurde gezeigt, dass NS eine wichtige Rolle bei der Entwicklung von Brust-, Leber- und Mundtumoren spielt 15,16,17. Mechanistisch hat sich gezeigt, dass NS die Selbsterneuerung fördert, indem es das replizierende Genom vor DNA-Schäden schützt18,19. Aufgrund des frühen embryonalen letalen Phänotyps der Keimbahn NSKO ist jedoch eine experimentelle Methode zur zeitlichen Einführung von NSKD nach Abschluss der Gewebeentwicklung erforderlich, um seine biologischen Aktivitäten in adulten Organen weiter zu bestimmen.

In diesem Artikel verwenden wir NS als typisches Beispiel, um die Etablierung und Erprobung einer in vivo Lebergen-KD-Methode zu veranschaulichen, die effizient ist und eine geringe verfahrensinduzierte Mortalität aufweist.

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Protokoll

Alle in dieser Studie durchgeführten Tierversuche wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) am Texas A&M University Health Science Center in Houston (Zulassungsnummer: 2021-0264-IBT) geprüft und genehmigt und in Übereinstimmung mit allen relevanten regulatorischen und institutionellen Richtlinien durchgeführt. Es wurden weibliche C57BL/6J-Mäuse (4-5 Monate alt, Körpergewicht 23-30 g) verwendet. Die Einzelheiten zu den verwendeten Reagenzien und Geräten sind in der Materialtabelle aufgeführt.

1. AAV8-shRNA-Design und -Produktion

HINWEIS: Bitte beziehen Sie sich auf Sands et al.4 für Details zum Verfahren.

  1. Design-Sense- und Anti-Sense-shRNA-Oligonukleotide, die auf eine 21 Nukleotide lange Sequenz innerhalb der kodierenden Region des interessierenden Gens abzielen. In diesem Fall wurden Maus-NS (shNS1) und eine verschlüsselte Sequenz von 21 Nukleotiden als Negativkontrolle (shScr) verwendet (Abbildung 1A, unteres Bild).
  2. In die Haarnadelstruktur ist eine Stammschleifensequenz von TTCAAGAGA, ein 5'-stumpfes Ende, ein 3'-XhoI-kompatibles kohäsives Ende und eine genspezifische zielgerichtete Sinnessequenz von 5'-GAA CTA AAA CAG CAG CAG AAA-3' (shNS1) oder eine verschlüsselte Sequenz von 5'-TCT CGC TTG GGC GAG AGT AAG-3' (shScr) aufzunehmen.
  3. Phosphorylieren und annealisieren Sie jedes Paar von Oligonukleotiden.
  4. Verdauen Sie den AAV-Gentransfervektor, AV5-siRNA-GFP (Abbildung 1A, oberes Bild), mit HpaI und XhoI, dephosphorylieren Sie und reinigen Sie das Gel, um das Vektorfragment aufzureinigen.
  5. Ligate geglühte Oligonukleotide in den gelgereinigten Vektor.
  6. Verwandeln Sie ligierte DNA-Produkte in kompetente DH5α-Bakterien mit Subklonierungseffizienz.
  7. Selektieren Sie einzelne Klone nach Ampicillinresistenz und züchten Sie 100 mL Bakterienkulturen für Plasmid Miniprep. Bestätigen Sie die korrekte Klonierung durch Sequenzierung und bereiten Sie die Plasmide mit dem im Handel erhältlichen endotoxinfreien Kit vor (gemäß den Anweisungen des Herstellers).
  8. Verpacken Sie AAV8-Viren durch Transfizierung des AV5-Transfervektors, des Rep/Cap-Serotyps 8 und der AdF6-Helferplasmide in 293T-Zellen unter Verwendung des iMFectin-Transfektionsreagenzes. Insgesamt wurden 40 × 15 cm große Schalen transfiziert und 3 Tage nach der Transfektion geerntet/verdaut.
  9. Rückgewinnung von zellassoziiertem AAV8 durch Zelllyse und Ausfällung von mediasekretiertem AAV8 mit 40% PEG. Nach dem Aufschluss werden AAV8-Viren im Zelllysat und im Medium kombiniert, auf einem diskontinuierlichen Iodixanol-Gradienten gereinigt und in Molekulargewichts-Cut-off-Zentrifugationseinheiten (1.00.000 MW) konzentriert.
  10. Quantifizierung der AAV8-Titer mittels absoluter Endpunkt-qPCR mit Primern: WPRE-172 (5'- TTTATGAGGAGTTGTGGCCC-3') und WPRE-392 (5'- CAACACCACGGAATTGTCAG-3').

2. Intrasplenische Injektion von AAV8 (Abbildung 1B, 1C) 

  1. Platzieren Sie C57BL6/J-Mäuse in einer Anästhesiekammer, die mit 2 % Isofluran und Sauerstoff gefüllt ist (gemäß den institutionell anerkannten Protokollen). Nach Bewusstlosigkeit werden die Mäuse in den aseptischen Operationsbereich in eine rechte seitliche Liegeposition gebracht. Halten Sie die Anästhesie mit 2 % Isofluran aufrecht, wobei der Sauerstoff über einen Nasenkonus abgegeben wird.
  2. Sterilisieren Sie die Inzisionsstelle mit 2 % Chlorhexidin, gefolgt von 80 % Ethanol. Verwenden Sie eine 6,3-Zoll-Medizinschere, um einen 15-mm-Schnitt an der linken oberen Bauchdecke vorzunehmen, gefolgt von einem 10-mm-Schnitt am Bauchfell.
  3. Legen Sie die Milz vorsichtig mit einer Pinzette frei und halten Sie sie mit einer feuchten Gaze unter dem Organ fest.
  4. Mischen und injizieren Sie AAV8-Viren (50 μl) vorsichtig über einen Zeitraum von 30 s in die Milz, indem Sie eine 30-G-Nadel verwenden, wobei die Spitze in einer Tiefe von 3 mm unter der Oberfläche platziert wird (Abbildung 1B). Decken Sie die Injektionsstelle mit einem Stück Wattestäbchen ab und komprimieren Sie sie 1 Minute lang.
  5. Vernähen Sie das Bauchfell mit einer resorbierbaren 4-0 chromischen Darmnaht.
  6. Verschließen Sie die Bauchdecke und die Haut mit einer 4-0 Seidennaht.
  7. Setzen Sie Mäuse in einen sauberen Käfig auf ein elektrisches Heizkissen und überwachen Sie sie, bis sie sich erholt haben.

3. Pfortaderinjektion von AAV8

  1. Anästhesieren Sie C57BL6/J-Mäuse durch Isofluran-Inhalation (2%), gemischt mit Sauerstoff (gemäß institutionell anerkannten Protokollen).
  2. Führen Sie die Laparotomie 4,13 durch einen Mittellinienschnitt (~1 Zoll) auf der Haut und dann in das Peritoneum durch.
  3. Legen Sie ein steriles, in steriler Kochsalzlösung getränktes Mullkissen auf die linke Seite der Maus und ziehen Sie mit einem sterilen Wattestäbchen vorsichtig den Dick- und Dünndarm heraus. Legen Sie den Darm auf eine befeuchtete Gaze und decken Sie ihn mit einem Pad ab, um einen Kontakt mit der Haut oder ein Austrocknen zu vermeiden.
  4. Injizieren Sie das AAV-Virus mit einer sterilen 32-G-Nadel in einem Volumen von 50 μl in die Pfortader. Führen Sie die Nadel 3-5 mm in einem Winkel von weniger als 5 Grad in die Portvene ein. Lassen Sie das Blut 5 s lang an der Nadel vorbeifließen, um einen Rückfluss zu vermeiden.
  5. Legen Sie eine sterile Wattestäbchenspitze mit leichtem Druck auf die Injektionsstelle, bis die Vene vollständig verschlossen ist und keine Blutungen mehr auftreten (ca. 5 min), um Blutungen zu vermeiden.
  6. Setzen Sie die inneren Organe vorsichtig wieder in die Bauchhöhle ein.
  7. Bauchdecke und Haut mit 4-0 Seidennaht verschließen.

4. qRT-PCR-Analyse

  1. Extrahieren Sie RNAs aus 50-100 mg Lebergewebe 4,13 unter Verwendung eines im Handel erhältlichen RNA-Isolationsreagenzes gemäß den Anweisungen des Herstellers (siehe Materialtabelle).
  2. Synthetisieren Sie1-Strang-cDNAs aus Gesamt-RNAs mit zufälligen Hexameren und M-MLV-reverser Transkriptase20,21.
  3. Bestimmen Sie die ΔC(t)-Werte zwischen dem Zielgen und den Referenzgenen unter Verwendung des einfarbigen Echtzeit-PCR-Nachweissystems und des Supermix-SYBR-Grünreagenzes gemäß den zuvor veröffentlichten Berichten22,23.
  4. Messen Sie die ΔΔC(t)-Werte von vier biologischen Replikaten und drei technischen Wiederholungen (n = 12). Tm für alle Reaktionen auf 60 °C einstellen. Bestätigen Sie die Ergebnisse mit zwei Referenzgenen, Rps3 und Rplp0.
  5. Primersequenzen wie folgt auslegen: Ns, 5'-gtc tga tct agt acc aaa gg-3' und 5'-ggg aaa cca atc act cca ac-3'; Rps3, 5'-atg gcg gtg cag att tcc aa-3' und 5'-cat tct gtg tcc tgg tgg c-3'; Rplp0, 5'-ctg aag tgc tcg aca tca ca-3' und 5'-agt ctc cac aga caa tgc ca-3'.

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Ergebnisse

Effizienzen des Gens KD in der Leber durch intrasplenische vs. Pfortaderinjektion von AAV8-shRNA
AAV8-Virusstämme wurden auf eine Arbeitskonzentration von 2E+12 Genomkopien (gc) pro Milliliter (gc/ml) verdünnt. Einzelnen Mäusen wurde 1E+11 gc AAV8-shNS1 oder AAV8-shScr (50 μl) durch intrasplenische oder portale Veneninjektion injiziert. Zwei Wochen nach der Injektion wurde Lebergewebe für die RNA-Isolierung, die1-Strang-cDNA-Synthese ...

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Diskussion

Das Gen KD durch virale Verabreichung entweder eines shRNA-exprimierenden Konstrukts in einem Wildtyp-Hintergrund24,25 oder eines Cre-rekombinase-exprimierenden Konstrukts in einem gefloxten Hintergrund26 ist ein leistungsfähiger Weg, um die Genfunktion in vivo auf induzierbare, zeitgesteuerte Weise zu untersuchen. Eine ideale Verabreichungsmethode für in vivo Gen-KO/KD-Studien sollte e...

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Offenlegungen

Die Autoren erklären, dass kein Interessenkonflikt besteht.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde durch den Individual Investigator Research Award (RP200081) des Cancer Prevention Research Institute of Texas (CPRIT) für RYT unterstützt.

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Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
Amicon filter centrifugation unitsMilliporeSigmaUFC9100Fast ultrafiltration
AV5-siRNA-GFP Addgene #124972Plasmid
Competent DH5α bacteria Invitrogen#18265-017Chemically competent strain for cloning 
HpaI New England BiolabsR0105Restriction enzyme
iMFectin transfection reagent GenDepotI7100-101
M-MLV reverse transcriptase PromegaM1708RNA-dependent DNA polymerase 
MyiQ single-color real-time PCR detection system Bio-RadBUN9740RADqRT-PCR
Omega endotoxin-free kit BioteckD6915-03Plasmid DNA midi prep 
Random hexamers Invitrogen48190-011
Supermix SYBR green reagent Bio-Rad1708882Real-time PCR applications
T4 DNA LigasePromegaM1801
TRIzol Reagent Life Technologies15596-018Isolation of high-quality total RNA
XhoINew England BiolabsR0146Restriction enzyme

Referenzen

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