הפלת גנים יעילה בכבד באמצעות הזרקה תוך-טחולית של RNA סיכת ראש קטנה המסופקת על ידי נגיף הקשור לאדנו Serotype 8 (AAV8)

Summary

פרוטוקול זה מתאר כיצד הזרקה תוך-טחולית של RNA סיכת ראש קטנה המועברת על ידי AAV8 משיגה את אותה יעילות הפלת גנים בכבד כמו הזרקת וריד פורטלי, המייצגת הליך פשוט יותר עם תמותה וסיבוכים נמוכים בהרבה סביב הניתוח ואחרי הניתוח.

Abstract

הכבד הוא איבר מרכזי המבצע פונקציות מטבוליות חיוניות. פיתוח שיטה יעילה ובטוחה לפגיעה בביטוי גנים בכבד מספק כלי חשוב לקביעת תפקוד גנים בפתופיזיולוגיה של הכבד. במחקר זה, אנו מתארים שיטה להזרקה תוך טחולית של סרוטיפ 8 של נגיף הקשור לאדנו-(AAV8) שהונדס לבטא RNA סיכת ראש קטנה (shRNA) כנגד גן מטרה מעניין, נוקלאוסטמין (NS). הזרקה תוך-טחולית של AAV8 המבטאת shRNA מכוון NS, (AAV8-shNS1) השיגה את אותה יעילות נוקדאון של NS בכבד כמו הזרקת וריד פורטלי, בהשוואה להזרקת AAV8 המבטאת shRNA ברצף מקושקש (AAV8-shScr). יתר על כן, הזרקת נגיף AAV8-shRNA עוררה תגובות דלקתיות מינימליות בפרנכימת הכבד. והכי חשוב, פרוטוקול הזרקה תוך טחול זה לא היה תובעני מבחינה טכנית וגרם לדימום מינימלי במקום ההזרקה, שהוא הגורם המוביל לתמותה סביב הניתוח ואחרי הניתוח בעת ביצוע הזרקת וריד פורטלי. מחקר זה מדווח על שיטה משופרת ובטוחה יחסית להשגת הפלת גנים יעילה בכבד.

Introduction

הכבד הוא איבר חיוני המבצע חילוף חומרים מזינים וכימיקלים, אך גם חשוף כל הזמן לעלבונות ציטוטוקסיים ומסרטנים. בעוד שהכבד הבוגר מסוגל לצמוח מחדש לאחר פציעה, כוח ההתחדשות שלו נפגע קשות עד גיל^שנה. נכון להיום, האופציה הטיפולית היחידה לחולים עם מחלות כבד כרוניות סופניות או נזק חריף מסיבי לכבד היא השתלת כבד, המציבה אתגרים^{רבים בפני} עצמה. כדי להבין טוב יותר את הפתופיזיולוגיה המולקולרית של הכבד על ידי חקירת התפקודים של גנים מעניינים, פותחו מניפולציות גנטיות ליישום in vivo , כולל נוקדאון בתיווך RNAi ומחיקה ממוקדת על ידי Cre recombinase בנוכחות אתרי loxP³. קלטת ביטוי Cre ומבנה shRNA יכולים להיות מועברים על ידי כלי רכב ויראליים.

סרוטיפ 8 של נגיף הקשור לאדנו (AAV8) הוא וקטור חזק להעברת גנים לסוגי רקמות סלקטיביות (למשל, כבד, שרירי שלד, לב, מוח ולבלב) עם יעילות גבוהה ותגובה דלקתית נמוכה ^4,5. כדי להתמקד באיברי גוף פנימיים, AAV8 מוחדר בדרך כלל על ידי הזרקת וריד זנב, שבה חלקיקים נגיפיים עוברים תחילה דרך הריאה לפני שהם מגיעים למחזור הדם המערכתי. לעומת זאת, הזרקת וריד פורטלי מאפשרת להם להגיע תחילה לכבד לפני שהם מסתובבים דרך הריאות, מקור פוטנציאלי לבידוד ודילול. עם זאת, הזרקת וריד פורטלי היא מאתגרת מבחינה טכנית ולעתים קרובות מסובכת על ידי דימום המושרה על ידי ניתוח ושיעור תמותה גבוה. כדי להשיג הפלה יעילה של גנים (KD) בכבד תוך הימנעות מנושא התמותה הגבוהה לפני ואחרי הניתוח, בדקנו שיטה של הזרקה תוך טחולית של AAV8 הנושא shRNA מהונדס המכוון לנוקלאוסטמין (NS) (AAV8-shNS1) והשווינו את יעילות ה-KD שלו לזו של AAV8-shNS1 המוזרק לווריד פורטלי.

NS הוא חלבון מועשר בתאי גזע/אב שהתגלה תחילה בתאי גזע עצביים ובהמשך במספר סוגים אחרים של תאי גזע וסרטן ^6,7. החשיבות הביולוגית של NS מוצגת על ידי הפנוטיפ הקטלני העוברי המוקדם של עכברי NS-knockout (NSKO) in vivo ^3,8 ועל ידי הפרעה הנגרמת על ידי NSKD של חידוש עצמי במבחנה ^9,10. בבעלי חיים בוגרים, רמות גבוהות של ביטוי NS נמצאות באשך ובמספר רקמות שעוברות התחדשות, כולל תאי אפיתל פיגמנטיים של ניוט לאחר כריתת עדשה ותאי שריר לאחר כריתת גפיים¹¹, כמו גם רקמות יונקים מתחדשות, כגון קרדיומיוציטים של עכברים לאחר פגיעה לבבית¹² והפטוציטים לאחר פגיעה בכבד (למשל, CCl₄) או כריתה כירורגית (למשל, כריתת כבד חלקית)^13,14. יתר על כן, הוכח כי NS ממלא תפקידים חשובים בהתפתחות גידולי שד, כבד ופה 15,16,17. מבחינה מכנית, הוכח כי NS מקדם התחדשות עצמית על ידי הגנה על הגנום המשתכפל מפני נזק ל-DNA^18,19. עם זאת, בשל הפנוטיפ הקטלני העוברי המוקדם של NSKO, יש צורך בשיטה ניסיונית להחדרה זמנית של NSKD לאחר השלמת התפתחות הרקמה כדי לקבוע עוד יותר את פעילותו הביולוגית באיברים בוגרים.

במאמר זה, אנו משתמשים ב-NS כמקרה לדוגמה כדי להמחיש את ההקמה והבדיקה של שיטת KD של גן כבד in vivo שהיא יעילה ובעלת תמותה נמוכה הנגרמת על ידי הליך.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

כל הניסויים בבעלי חיים שהושלמו במחקר זה נבדקו ואושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (IACUC) במרכז מדעי הבריאות של אוניברסיטת טקסס A&M ביוסטון (מספר אישור: 2021-0264-IBT) ובוצעו בהתאם ובהתאם לכל ההנחיות הרגולטוריות והמוסדיות הרלוונטיות. נעשה שימוש בעכברי C57BL/6J נקבות (בנות 4-5 חודשים, משקל גוף 23-30 גרם). פרטי הריאגנטים והציוד המשמשים מפורטים בטבלת החומרים.

1. AAV8- תכנון וייצור shRNA

הערה: אנא עיין ב-Sands et ^al.4 לפרטים פרוצדורליים.

1. חוש תכנון ואנטי-חוש shRNA אוליגונוקלאוטידים המכוונים לרצף ארוך של 21 נוקלאוטידים באזור המקודד של הגן המעניין. במקרה זה, נעשה שימוש ב-NS של עכבר (shNS1) וברצף מקושקש של 21 נוקלאוטידים כבקרה שלילית (shScr) (איור 1A, פאנל תחתון).
2. כלול במבנה סיכת הראש רצף לולאת גזע של TTCAAGAGA, קצה קהה 5', קצה מגובש תואם 3' XhoI, ורצף חישה ממוקד ספציפי לגן של 5'-GAA CTA AAA CAG CAG CAG AAA-3' (shNS1) או רצף מקושקש של 5'-TCT CGC TTG GGC GAG AGT AAG-3' (shScr).
3. זרחן וחישול כל זוג אוליגונוקלאוטידים.
4. עיכול וקטור העברת גנים AAV, AV5-siRNA-GFP (איור 1A, פאנל עליון), עם HpaI ו-XhoI, דפוספורילאט וג'ל מטהרים את שבר הווקטור.
5. קשר אוליגונוקלאוטידים מחוסמים לווקטור המטוהר בג'ל.
6. הפוך מוצרי DNA קשורים לחיידקי DH5α מוכשרים עם יעילות תת-שיבוט.
7. בחר שיבוטים בודדים על ידי עמידות לאמפיצילין וגדל תרבית חיידקים של 100 מ"ל עבור מיני-הכנת פלסמיד. אשר שיבוט נכון על ידי ריצוף והכנת פלסמידים באמצעות הערכה נטולת האנדוטוקסינים הזמינה מסחרית (בהתאם להוראות היצרן).
8. ארוז נגיפי AAV8 על ידי העברת וקטור ההעברה AV5, סרוטיפ Rep/Cap 8 ופלסמידים מסייעים של AdF6 לתאי 293T באמצעות מגיב טרנספקציה iMFectin. בסך הכל 40 × 15 ס"מ הועברו ונקטפו / עוכלו 3 ימים לאחר הטרנספקציה.
9. שחזר AAV8 הקשור לתאים על ידי ליזה תאית וזרז AAV8 המופרש במדיה עם 40% PEG. לאחר העיכול, שלב נגיפי AAV8 בליזאט התא ובמדיום, מטהר על שיפוע יודיקסנול לא רציף, ורכז ביחידות צנטריפוגה חתוכות במשקל מולקולרי (1,00,000 מגה-וואט).
10. כמת טיטרים של AAV8 על ידי qPCR נקודת קצה מוחלטת עם פריימרים: WPRE-172 (5'- TTTATGAGGAGTTGTGGCCC-3') ו-WPRE-392 (5'- CAACACCACGGAATTGTCAG-3').

2. הזרקה תוך-טחולית של AAV8 (איור 1B, 1C) 

1. הנח עכברי C57BL6/J בתא הרדמה מלא ב-2% איזופלורן וחמצן (בהתאם לפרוטוקולים שאושרו על ידי המוסד). לאחר אובדן הכרה, העבירו עכברים לאזור הניתוח האספטי בתנוחת שכיבה רוחבית ימנית. שמור על הרדמה על ידי 2% איזופלורן עם חמצן המועבר דרך חרוט אף.
2. עקר את מקום החתך עם 2% כלורהקסידין ואחריו 80% אתנול. השתמש במספריים רפואיים בגודל 6.3 אינץ' כדי לבצע חתך של 15 מ"מ בדופן הבטן העליונה השמאלית, ולאחר מכן חתך של 10 מ"מ על הצפק.
3. חשפו בעדינות את הטחול בעזרת מלקחיים והחזיקו אותו במקומו בעזרת גזה רטובה המונחת מתחת לאיבר.
4. מערבבים בעדינות והזרקו נגיפי AAV8 (50 מיקרוליטר) במשך תקופה של 30 שניות לתוך הטחול באמצעות מחט 30 G כשהקצה ממוקם בעומק של 3 מ"מ מתחת לפני השטח (איור 1B). מכסים את מקום ההזרקה בחתיכת צמר גפן ודוחסים למשך דקה.
5. לתפור את הצפק בתפר מעי כרומי נספג 4-0.
6. סגור את דופן הבטן והעור עם תפר משי 4-0.
7. הניחו עכברים בכלוב נקי על גבי כרית חום חשמלית ועקבו אחריהם עד להתאוששות.

3. הזרקת וריד פורטל של AAV8

1. להרדים עכברי C57BL6/J על ידי שאיפת איזופלורן (2%) מעורבב עם חמצן (בהתאם לפרוטוקולים שאושרו על ידי המוסד).
2. בצע לפרוטומיה ^4,13 דרך חתך בקו האמצע (~1 אינץ') על העור ולאחר מכן לתוך הצפק.
3. הניחו פד גזה סטרילי ספוג במי מלח סטריליים בצד שמאל של העכבר והשתמשו במקלון צמר גפן סטרילי כדי לשלוף בעדינות את המעי הגס והדק. הניחו את המעי על גבי גזה רטובה וכסו אותו בפד כדי למנוע מגע עם העור או ייבוש.
4. הזריק את נגיף ה-AAV לווריד הפורטל עם מחט סטרילית 32 G בנפח של 50 מיקרוליטר. הכנס את המחט 3-5 מ"מ לווריד היציאה בזווית של פחות מ-5 מעלות. אפשר לדם לזרום מעבר למחט למשך 5 שניות כדי למנוע זרימה חוזרת.
5. הנח קצה צמר גפן סטרילי על גבי מקום ההזרקה בלחץ עדין עד לסגירת הווריד כולו וללא דימום (כ-5 דקות) כדי למנוע דימום.
6. החזירו בעדינות איברים פנימיים לחלל הבטן.
7. סגור את דופן הבטן והעור עם תפר משי 4-0.

4. ניתוח qRT-PCR

1. חלץ RNA מ-50-100 מ"ג של רקמת כבד ^4,13 באמצעות מגיב בידוד RNA זמין מסחרית בהתאם להוראות היצרן (ראה טבלת חומרים).
2. סנתז cDNA^גדיל אחד מסך ה-RNAs עם הקסמרים אקראיים ו-M-MLV reverse transcriptase ^20,21.
3. קבע את ערכי ה-ΔC(t) בין גן היעד לגני הייחוס באמצעות מערכת זיהוי PCR בזמן אמת בצבע יחיד ומגיב ירוק סופרמיקס SYBR בעקבות דוחות שפורסמו^{בעבר 22,23}.
4. מדוד את ערכי ΔΔC(t) מארבעה שכפולים ביולוגיים ושלוש חזרות טכניות (n = 12). הגדר את T_m על 60 מעלות צלזיוס עבור כל התגובות. אשר את התוצאות באמצעות שני גני ייחוס, Rps3 ו-Rplp0.
5. תכנן רצפי פריימר באופן הבא: Ns, 5'-gtc tga tct agt acc aaa gg-3' ו-5'-ggg aaa cca atc act cca ac-3'; Rps3, 5'-atg gcg gtg cag att tcc aa-3' ו-5'-cat tct gtg tcc tgg tgg c-3'; Rplp0, 5'-ctg aag tgc tcg aca tca ca-3' ו-5'-agt ctc cac aga caa tgc ca-3'.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

יעילות הגן KD בכבד על ידי תוך-טחול לעומת הזרקת וריד פורטל של AAV8-shRNA
מלאי נגיף AAV8 דולל לריכוז עבודה של 2E+12 עותקי גנום (gc) למיליליטר (gc/mL). לעכברים בודדים הוזרקו 1E+11 gc של AAV8-shNS1 או AAV8-shScr (50 מיקרוליטר) באמצעות הזרקה תוך טחולית או וריד פורטלי. שבועיים לאחר ההזרקה...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

גן KD על ידי מסירה ויראלית של מבנה המבטא shRNA ברקע פראי^24,25 או מבנה המבטא Cre recombinase ברקע פלוקסי²⁶ הוא דרך רבת עוצמה לחקור את תפקוד הגנים in vivo באופן אינדוקטיבי ומבוקר זמן. שיטת אספקה אידיאלית למחקרי KO/KD בגן in vivo אמורה להשיג י...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Amicon filter centrifugation units	MilliporeSigma	UFC9100	Fast ultrafiltration
AV5-siRNA-GFP	Addgene	#124972	Plasmid
Competent DH5α bacteria	Invitrogen	#18265-017	Chemically competent strain for cloning
HpaI	New England Biolabs	R0105	Restriction enzyme
iMFectin transfection reagent	GenDepot	I7100-101
M-MLV reverse transcriptase	Promega	M1708	RNA-dependent DNA polymerase
MyiQ single-color real-time PCR detection system	Bio-Rad	BUN9740RAD	qRT-PCR
Omega endotoxin-free kit	Bioteck	D6915-03	Plasmid DNA midi prep
Random hexamers	Invitrogen	48190-011
Supermix SYBR green reagent	Bio-Rad	1708882	Real-time PCR applications
T4 DNA Ligase	Promega	M1801
TRIzol Reagent	Life Technologies	15596-018	Isolation of high-quality total RNA
XhoI	New England Biolabs	R0146	Restriction enzyme