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  • Introducción
  • Protocolo
  • Resultados
  • Discusión
  • Divulgaciones
  • Agradecimientos
  • Materiales
  • Referencias
  • Reimpresiones y Permisos

Resumen

Este protocolo describe cómo la inyección intraesplénica de ARN de horquilla pequeña administrado por AAV8 logra la misma eficiencia de eliminación de genes en el hígado que la inyección de vena porta, lo que representa un procedimiento más simple con mortalidad y complicaciones perioperatorias y postoperatorias mucho más bajas.

Resumen

El hígado es un órgano importante que realiza funciones metabólicas esenciales. El desarrollo de un método eficiente y seguro para reducir la expresión génica en el hígado proporciona una herramienta importante para determinar la función génica en la fisiopatología hepática. En este estudio, describimos un método para la inyección intraesplénica de virus adenoasociado serotipo 8 (AAV8) diseñado para expresar un pequeño ARN de horquilla (shRNA) contra un gen objetivo de interés, la nucleostemina (NS). La inyección intraesplénica de AAV8 que expresa un shRNA dirigido al NS (AAV8-shNS1) logró la misma eficiencia de reducción del NS en el hígado que la inyección de la vena porta, en comparación con la inyección de AAV8 que expresa un shRNA de secuencia codificada (AAV8-shScr). Además, la inyección del virus AAV8-shRNA desencadenó reacciones inflamatorias mínimas en el parénquima hepático. Lo más importante es que este protocolo de inyección intraesplénica no fue técnicamente exigente y causó un sangrado mínimo en el lugar de la inyección, que es la principal causa de mortalidad perioperatoria y postoperatoria al realizar la inyección de vena porta. Este estudio informa de un método mejorado y relativamente seguro para lograr una eliminación eficiente de genes en el hígado.

Introducción

El hígado es un órgano vital que metaboliza nutrientes y sustancias químicas, pero también está expuesto constantemente a lesiones citotóxicas y cancerígenas. Si bien el hígado adulto es capaz de volver a crecer después de una lesión, su poder regenerativo se ve gravemente obstaculizado por la edadde 1 año. Hasta la fecha, la única opción terapéutica para los pacientes con enfermedades hepáticas crónicas terminales o daño hepático agudo masivo es el trasplante hepático, que plantea muchos desafíos propios2. Para comprender mejor la fisiopatología molecular del hígado mediante el interrogatorio de las funciones de los genes de interés, se han desarrollado manipulaciones genéticas para su aplicación in vivo , incluida la eliminación mediada por ARNi y la deleción dirigida por una recombinasa Cre en presencia de sitios loxP3. El casete de expresión de Cre y la construcción de shRNA pueden ser administrados por vehículos virales.

El virus adenoasociado serotipo 8 (AAV8) es un vector robusto para la entrega de genes a tipos selectivos de tejidos (p. ej., hígado, músculo esquelético, corazón, cerebro y páncreas) con alta eficiencia y baja respuesta inflamatoria 4,5. Para dirigirse a los órganos internos del cuerpo, el AAV8 se introduce comúnmente mediante la inyección en la vena de cola, en la que las partículas virales viajan primero a través del pulmón antes de llegar a la circulación sistémica. Por el contrario, la inyección de la vena porta les permite llegar primero al hígado antes de circular a través del pulmón, una fuente potencial de secuestro y dilución. Sin embargo, la inyección de la vena porta es técnicamente desafiante y, a menudo, se complica por el sangrado inducido por la operación y una alta tasa de mortalidad. Para lograr una knockdown (KD) eficiente de genes en el hígado y evitar el problema de una alta mortalidad peri/postoperatoria, probamos un método de inyección intraesplénica de AAV8 portadora de un shRNA diseñado dirigido a la nucleostemina (NS) (AAV8-shNS1) y comparamos su eficiencia de KD con la de AAV8-shNS1 inyectada en la vena porta.

La NS es una proteína enriquecida con células madre/progenitoras descubierta primero en las células madre neurales y más tarde en varios otros tipos de células madre y cánceres 6,7. La importancia biológica de la NS se demuestra por el fenotipo letal embrionario temprano de ratones NS-knockout (NSKO) de línea germinal in vivo 3,8 y por la perturbación de la autorrenovación in vitro inducida por NSKD 9,10. En los animales adultos, se encuentran altos niveles de expresión de NS en el testículo y en varios tejidos en proceso de regeneración, incluidas las células epiteliales pigmentadas con tritón desdiferenciadas después de la lentectomía y las células musculares después de la amputación de la extremidad11, así como los tejidos de mamíferos en regeneración, como los cardiomiocitos de ratón después de una lesión cardíaca12 y los hepatocitos después de una lesión hepática (p. ej., CCl4) o resección quirúrgica (p. ej., hepatectomía parcial)13,14. Además, se ha demostrado que el SN desempeña un papel importante en el desarrollo de tumores mamarios, hepáticos y orales 15,16,17. Mecánicamente, se ha demostrado que el NS promueve la autorrenovación al proteger el genoma replicante del daño en el ADN18,19. Sin embargo, debido al fenotipo letal embrionario temprano de la línea germinal NSKO, se necesita un método experimental para introducir temporalmente NSKD después de completar el desarrollo del tejido para determinar aún más sus actividades biológicas en los órganos adultos.

En este artículo, utilizamos el NS como ejemplo para ilustrar el establecimiento y la prueba de un método de KD del gen hepático in vivo que es eficiente y tiene una baja mortalidad inducida por el procedimiento.

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Protocolo

Todos los experimentos con animales completados en este estudio fueron revisados y aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) en el Centro de Ciencias de la Salud de la Universidad de Texas A&M en Houston (número de aprobación: 2021-0264-IBT) y se realizaron de acuerdo y cumplimiento con todas las pautas regulatorias e institucionales relevantes. Se utilizaron ratones hembra C57BL/6J (4-5 meses de edad, peso corporal 23-30 g). Los detalles de los reactivos y equipos utilizados se enumeran en la Tabla de Materiales.

1. AAV8- Diseño y producción de shRNA

NOTA: Consulte Sands et al.4 para obtener detalles sobre el procedimiento.

  1. Diseñar oligonucleótidos de shRNA sentido y antisentido que se dirijan a una secuencia larga de 21 nucleótidos dentro de la región codificante del gen de interés. En este caso, se utilizó NS de ratón (shNS1) y una secuencia codificada de 21 nucleótidos como control negativo (shScr) (Figura 1A, panel inferior).
  2. Incluya en la estructura de horquilla una secuencia de bucle de tallo de TTCAAGAGA, un extremo romo de 5', un extremo cohesivo compatible con XhoI de 3' y una secuencia de detección dirigida específica del gen de 5'-GAA CTA AAA CAG CAG CAG AAA-3' (shNS1) o una secuencia codificada de 5'-TCT CGC TTG GGC GAG AGT AAG-3' (shScr).
  3. Fosforilar y recocer cada par de oligonucleótidos.
  4. Digiera el vector de transferencia de genes AAV, AV5-siRNA-GFP (Figura 1A, panel superior), con HpaI y XhoI, desfosforilado y purificado en gel el fragmento de vector.
  5. Ligate oligonucleótidos recocidos en el vector purificado en gel.
  6. Transforme los productos de ADN ligados en bacterias DH5α competentes con eficiencia de subclonación.
  7. Elija clones individuales por resistencia a la ampicilina y cultive 100 ml de cultivo bacteriano para la minipreparación de plásmidos. Confirme la clonación correcta mediante secuenciación y prepare plásmidos utilizando el kit libre de endotoxinas disponible en el mercado (siguiendo las instrucciones del fabricante).
  8. Empaque los virus AAV8 transfectando el vector de transferencia AV5, el serotipo Rep/Cap 8 y los plásmidos auxiliares AdF6 en células 293T mediante el reactivo de transfección iMFectin. Un total de 40 platos × 15 cm fueron transfectados y cosechados/digeridos a los 3 días después de la transfección.
  9. Recupere el AAV8 asociado a las células mediante lisis celular y precipite el AAV8 secretado por los medios con un 40% de PEG. Después de la digestión, combine los virus AAV8 en el lisado celular y el medio, purifique en un gradiente discontinuo de yodixanol y concéntrelo en unidades de centrifugación de corte de peso molecular (1,00,000 MW).
  10. Cuantificar los títulos de AAV8 mediante qPCR de punto final absoluto con cebadores: WPRE-172 (5'- TTTATGAGGAGGTGTGGCCC-3') y WPRE-392 (5'- CAACACCACGGAATTGTCAG-3').

2. Inyección intraesplénica de AAV8 (Figura 1B, 1C) 

  1. Coloque los ratones C57BL6/J en una cámara de anestesia llena de isoflurano al 2% y oxígeno (siguiendo los protocolos aprobados institucionalmente). Después de la pérdida del conocimiento, transfiera los ratones al área quirúrgica aséptica en decúbito lateral derecho. Mantener la anestesia con isoflurano al 2% con oxígeno suministrado a través de un cono nasal.
  2. Esterilizar el sitio de la incisión con clorhexidina al 2% seguido de etanol al 80%. Use un par de tijeras médicas de 6.3 pulgadas para hacer una incisión de 15 mm en la pared abdominal superior izquierda, seguida de una incisión de 10 mm en el peritoneo.
  3. Exponga suavemente el bazo con pinzas y manténgalo en su lugar con una gasa húmeda colocada debajo del órgano.
  4. Mezcle e inyecte suavemente los virus AAV8 (50 μL) durante un período de 30 s en el bazo con una aguja de 30 G con la punta colocada a una profundidad de 3 mm por debajo de la superficie (Figura 1B). Cubra el lugar de la inyección con un bastoncillo de algodón y comprima durante 1 min.
  5. Sutura el peritoneo con una sutura cómica intestinal reabsorbible 4-0.
  6. Cierre la pared abdominal y la piel con una sutura de seda 4-0.
  7. Coloque a los ratones en una jaula limpia encima de una almohadilla térmica eléctrica y vigílelos hasta que se recuperen.

3. Inyección de AAV8 en la vena porta

  1. Anestesiar ratones C57BL6/J por inhalación de isoflurano (2%) mezclado con oxígeno (siguiendo protocolos aprobados institucionalmente).
  2. Realice la laparotomía 4,13 a través de una incisión en la línea media (~ 1 pulgada) en la piel y luego en el peritoneo.
  3. Coloque una gasa estéril empapada en solución salina estéril en el lado izquierdo del ratón y use un hisopo de algodón estéril para extraer suavemente el intestino grueso y el intestino delgado. Coloque el intestino encima de una gasa mojada y cúbralo con una almohadilla para evitar que entre en contacto con la piel o se reseque.
  4. Inyecte el virus AAV en la vena porta con una aguja estéril de 32 G en un volumen de 50 μL. Inserte la aguja 3-5 mm en la vena del puerto en un ángulo inferior a 5 grados. Deje que la sangre fluya más allá de la aguja durante 5 segundos para evitar el reflujo.
  5. Coloque una punta de hisopo de algodón estéril en la parte superior del sitio de inyección con una presión suave hasta que se cierre completamente la vena y sin sangrado (aproximadamente 5 minutos) para evitar el sangrado.
  6. Vuelva a colocar suavemente los órganos internos en la cavidad abdominal.
  7. Cierre la pared abdominal y la piel con sutura de seda 4-0.

4. Análisis qRT-PCR

  1. Extraiga ARN de 50-100 mg de tejido hepático 4,13 utilizando un reactivo de aislamiento de ARN disponible en el mercado siguiendo las instrucciones del fabricante (ver Tabla de Materiales).
  2. Sintetizar ADNc de1ª cadena a partir de ARN totales con hexámeros aleatorios y transcriptasa inversa M-MLV20,21.
  3. Determinar los valores de ΔC(t) entre el gen diana y los genes de referencia utilizando el sistema de detección de PCR en tiempo real de un solo color y el reactivo verde supermix SYBR siguiendo los informes publicados anteriormente22,23.
  4. Mida los valores de ΔΔC(t) a partir de cuatro réplicas biológicas y tres repeticiones técnicas (n = 12). Ajuste Tm a 60 °C para todas las reacciones. Confirme los resultados utilizando dos genes de referencia, Rps3 y Rplp0.
  5. Diseñar las secuencias de cebadores de la siguiente manera: Ns, 5'-gtc tga tct agt acc aaa gg-3' y 5'-ggg aaa cca atc act cca ac-3'; Rps3, 5'-atg, gcg, gtg, cag, att, tcc, aa-3' y 5'-cat, tct, gtg, tcc, tgg, c-3'; Rplp0, 5'-ctg aag tgc tcg aca tca ca-3' y 5'-agt ctc cac aga caa tgc ca-3'.

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Resultados

Eficiencias del gen KD en el hígado por intensoplénico/ a. inyección de AAV8-shRNA en la vena porta
Las existencias virales de AAV8 se diluyeron a una concentración de trabajo de 2E+12 copias del genoma (gc) por mililitro (gc/mL). A los ratones individuales se les inyectó 1E+11 gc de AAV8-shNS1 o AAV8-shScr (50 μL) mediante inyección intraesplénica o de vena porta. Dos semanas después de la inyección, se recolectaron tejidos hepáticos para...

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Discusión

El gen KD por administración viral de un constructo que expresa shRNA en un fondo de tipo salvaje24,25 o un constructo que expresa recombinasa Cre en un fondo floxado26 es una forma poderosa de interrogar la función génica in vivo de una manera inducible y controlada en el tiempo. Un método de administración ideal para los estudios in vivo del gen KO/KD debe lograr una alta eficienci...

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Divulgaciones

Los autores declaran no tener ningún conflicto de intereses.

Agradecimientos

Este trabajo fue apoyado por el Premio de Investigación para Investigadores Individuales (RP200081) del Instituto de Investigación para la Prevención del Cáncer de Texas (CPRIT) a RYT.

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Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
Amicon filter centrifugation unitsMilliporeSigmaUFC9100Fast ultrafiltration
AV5-siRNA-GFP Addgene #124972Plasmid
Competent DH5α bacteria Invitrogen#18265-017Chemically competent strain for cloning 
HpaI New England BiolabsR0105Restriction enzyme
iMFectin transfection reagent GenDepotI7100-101
M-MLV reverse transcriptase PromegaM1708RNA-dependent DNA polymerase 
MyiQ single-color real-time PCR detection system Bio-RadBUN9740RADqRT-PCR
Omega endotoxin-free kit BioteckD6915-03Plasmid DNA midi prep 
Random hexamers Invitrogen48190-011
Supermix SYBR green reagent Bio-Rad1708882Real-time PCR applications
T4 DNA LigasePromegaM1801
TRIzol Reagent Life Technologies15596-018Isolation of high-quality total RNA
XhoINew England BiolabsR0146Restriction enzyme

Referencias

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