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  • Résumé
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  • Introduction
  • Protocole
  • Résultats
  • Discussion
  • Déclarations de divulgation
  • Remerciements
  • matériels
  • Références
  • Réimpressions et Autorisations

Résumé

Ce protocole décrit comment l’injection intrasplénique de petits ARN en épingle à cheveux délivrés par AAV8 atteint la même efficacité d’inactivation génique dans le foie que l’injection dans la veine porte, représentant une procédure plus simple avec une mortalité et des complications périopératoires et postopératoires beaucoup plus faibles.

Résumé

Le foie est un organe majeur qui remplit des fonctions métaboliques essentielles. La mise au point d’une méthode efficace et sûre pour inhiber l’expression des gènes dans le foie constitue un outil important pour déterminer la fonction des gènes dans la physiopathologie hépatique. Dans cette étude, nous décrivons une méthode d’injection intrasplénique du virus adéno-associé de sérotype 8 (AAV8) conçue pour exprimer un petit ARN en épingle à cheveux (shRNA) contre un gène cible d’intérêt, la nucléostémine (NS). L’injection intrasplénique d’AAV8 exprimant un shRNA ciblant le NS (AAV8-shNS1) a permis d’obtenir la même efficacité d’inactivation du NS dans le foie que l’injection dans la veine porte, par rapport à l’injection d’AAV8 exprimant un shRNA à séquence brouillée (AAV8-shScr). De plus, l’injection du virus AAV8-shRNA a déclenché des réactions inflammatoires minimes dans le parenchyme hépatique. Plus important encore, ce protocole d’injection intrasplénique n’était pas techniquement exigeant et provoquait un saignement minimal au site d’injection, qui est la principale cause de mortalité périopératoire et postopératoire lors de l’injection de la veine porte. Cette étude fait état d’une méthode améliorée et relativement sûre pour obtenir une neutralisation efficace des gènes dans le foie.

Introduction

Le foie est un organe vital qui métabolise les nutriments et les produits chimiques, mais il est également constamment exposé à des agressions cytotoxiques et cancérigènes. Alors que le foie adulte est capable de repousser après une blessure, son pouvoir de régénération est gravement entravé à l’âgede 1 an. À ce jour, la seule option thérapeutique pour les patients atteints de maladies hépatiques chroniques en phase terminale ou de lésions hépatiques aiguës massives est la transplantation hépatique, qui pose de nombreux défis en soi2. Pour mieux comprendre la physiopathologie moléculaire du foie en interrogeant les fonctions des gènes d’intérêt, des manipulations génétiques ont été développées pour une application in vivo , y compris l’inactivation médiée par l’ARNi et la délétion ciblée par une recombinase Cre en présence de sites loxP3. La cassette d’expression créale et la construction shRNA peuvent être délivrées par des véhicules viraux.

Le virus adéno-associé de sérotype 8 (AAV8) est un vecteur robuste pour l’administration de gènes à des types de tissus sélectifs (par exemple, le foie, les muscles squelettiques, le cœur, le cerveau et le pancréas) avec une efficacité élevée et une faible réponse inflammatoire 4,5. Pour cibler les organes internes du corps, l’AAV8 est généralement introduit par injection dans la veine de la queue, dans laquelle les particules virales traversent d’abord les poumons avant d’atteindre la circulation systémique. En revanche, l’injection dans la veine porte leur permet d’atteindre le foie avant de circuler dans les poumons, une source potentielle de séquestration et de dilution. Cependant, l’injection dans la veine porte est techniquement difficile et souvent compliquée par des saignements induits par l’opération et un taux de mortalité élevé. Pour obtenir une inactivation génique (KD) efficace dans le foie tout en évitant le problème d’une mortalité péri/postopératoire élevée, nous avons testé une méthode d’injection intrasplénique d’AAV8 portant un shRNA modifié ciblant la nucléostémine (NS) (AAV8-shNS1) et comparé son efficacité KD à celle de l’AAV8-shNS1 injecté dans la veine porte.

La NS est une protéine enrichie en cellules souches/progénitrices découverte d’abord dans les cellules souches neurales, puis dans plusieurs autres types de cellules souches et de cancers 6,7. L’importance biologique de la NS est démontrée par le phénotype létal embryonnaire précoce des souris germinales NS-knockout (NSKO) in vivo 3,8 et par la perturbation de l’auto-renouvellement induite par la NSKD in vitro 9,10. Chez les animaux adultes, des niveaux élevés d’expression de NS sont trouvés dans le testicule et plusieurs tissus en cours de régénération, y compris les cellules épithéliales dédifférenciantes pigmentées de triton après lentiectomie et les cellules musculaires après amputationd’un membre 11, ainsi que les tissus mammifères en régénération, tels que les cardiomyocytes de souris après une lésion cardiaque12 et les hépatocytes après une lésion hépatique (par exemple, CCl4) ou une résection chirurgicale (par exemple, hépatectomie partielle)13,14. De plus, il a été démontré que le NS joue un rôle important dans le développement des tumeurs mammaires, hépatiques et buccales 15,16,17. D’un point de vue mécanistique, il a été démontré que le NS favorise l’auto-renouvellement en protégeant le génome réplicatif des dommages à l’ADN18,19. Cependant, en raison du phénotype létal embryonnaire précoce de la lignée germinale NSKO, une méthode expérimentale pour introduire temporellement la NSKD après la fin du développement tissulaire est nécessaire pour déterminer davantage ses activités biologiques dans les organes adultes.

Dans cet article, nous utilisons la SN comme exemple pour illustrer l’établissement et la mise à l’essai d’une méthode KD in vivo du gène hépatique qui est efficace et dont la mortalité induite par la procédure est faible.

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Protocole

Toutes les expériences sur les animaux réalisées dans le cadre de cette étude ont été examinées et approuvées par l’Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) du Texas A&M University Health Science Center à Houston (numéro d’approbation : 2021-0264-IBT) et réalisées conformément à toutes les directives réglementaires et institutionnelles pertinentes. Des souris femelles C57BL/6J (âgées de 4 à 5 mois, poids corporel de 23 à 30 g) ont été utilisées. Les détails des réactifs et de l’équipement utilisés sont répertoriés dans le tableau des matériaux.

1. Conception et production d’AAV8- shRNA

REMARQUE : Veuillez consulter Sands et al.4 pour les détails de la procédure.

  1. Concevez des oligonucléotides shRNA sens et anti-sens qui ciblent une longue séquence de 21 nucléotides dans la région codante du gène d’intérêt. Dans ce cas, on a utilisé du NS de souris (shNS1) et une séquence brouillée de 21 nucléotides comme contrôle négatif (shScr) (Figure 1A, panneau du bas).
  2. Inclure dans la structure en épingle à cheveux une séquence tige-boucle de TTCAAGAGA, une extrémité émoussée de 5', une extrémité cohésive compatible avec le XhoI de 3' et une séquence de détection ciblée spécifique au gène de 5'-GAA CTA AAA CAG CAG CAG AAA-3' (shNS1) ou une séquence brouillée de 5'-TCT CGC TTG GGC GAG AGT AAG-3' (shScr).
  3. Phosphoryler et recuire chaque paire d’oligonucléotides.
  4. Digest Le vecteur de transfert de gène AAV, AV5-siRNA-GFP (Figure 1A, panneau supérieur), avec HpaI et XhoI, déphosphoryle et gélifie le fragment de vecteur.
  5. Ligate des oligonucléotides recuits dans le vecteur purifié en gel.
  6. Transformez les produits d’ADN ligaturé en bactéries DH5α compétentes avec une efficacité de sous-clonage.
  7. Choisissez des clones uniques en fonction de leur résistance à l’ampicilline et cultivez une culture bactérienne de 100 ml pour le miniprep plasmidique. Confirmez le clonage correct par séquençage et préparez les plasmides à l’aide du kit sans endotoxines disponible dans le commerce (en suivant les instructions du fabricant).
  8. Emballez les virus AAV8 en transfectant le vecteur de transfert AV5, le sérotype 8 Rep/Cap et les plasmides auxiliaires AdF6 dans des cellules 293T à l’aide du réactif de transfection iMFectin. Au total, 40 plats de × 15 cm ont été transfectés et récoltés/digérés 3 jours après la transfection.
  9. Récupérer l’AAV8 associé à la cellule par lyse cellulaire et précipiter l’AAV8 sécrété dans le milieu avec 40 % de PEG. Après la digestion, combiner les virus AAV8 dans le lysat cellulaire et le milieu, purifier sur un gradient d’iodixanol discontinu et se concentrer dans des unités de centrifugation de coupure de poids moléculaire (1,00,000 MW).
  10. Quantifiez les titres d’AAV8 par qPCR avec les amorces : WPRE-172 (5'- TTTATGAGGAGTTGTGGCCC-3') et WPRE-392 (5'- CAACACCACGGAATTGTCAG-3').

2. Injection intrasplénique d’AAV8 (Figure 1B, 1C) 

  1. Placez les souris C57BL6/J dans une chambre d’anesthésie remplie d’isoflurane à 2 % et d’oxygène (conformément aux protocoles approuvés par l’établissement). Après la perte de conscience, transférez les souris dans la zone chirurgicale aseptique en position couchée latérale droite. Maintenez l’anesthésie par 2 % d’isoflurane avec de l’oxygène délivré par un cône nasal.
  2. Stérilisez le site d’incision avec de la chlorhexidine à 2 % suivie de 80 % d’éthanol. Utilisez une paire de ciseaux médicaux de 6,3 pouces pour faire une incision de 15 mm sur la paroi abdominale supérieure gauche, suivie d’une incision de 10 mm sur le péritoine.
  3. Exposez doucement la rate à l’aide d’une pince et maintenez-la en place avec une gaze humide placée sous l’organe.
  4. Mélanger délicatement et injecter les virus AAV8 (50 μL) sur une période de 30 s dans la rate à l’aide d’une aiguille de 30 G dont l’extrémité est placée à une profondeur de 3 mm sous la surface (figure 1B). Couvrez le site d’injection avec un coton-tige et compressez pendant 1 min.
  5. Suturez le péritoine avec une suture intestinale chromique résorbable 4-0.
  6. Fermez la paroi abdominale et la peau avec une suture en soie 4-0.
  7. Placez les souris dans une cage propre sur un coussin chauffant électrique et surveillez-les jusqu’à ce qu’elles se rétablissent.

3. Injection d’AAV8 dans la veine porte

  1. Anesthésie les souris C57BL6/J par inhalation d’isoflurane (2 %) mélangé à de l’oxygène (selon les protocoles approuvés par l’établissement).
  2. Effectuez une laparotomie 4,13 à travers une incision médiane (~ 1 pouce) sur la peau, puis dans le péritoine.
  3. Placez un tampon de gaze stérile imbibé de solution saline stérile sur le côté gauche de la souris et utilisez un coton-tige stérile pour retirer doucement le gros et le petit intestin. Placez l’intestin sur une gaze mouillée et couvrez-le d’un tampon pour éviter d’entrer en contact avec la peau ou de le dessécher.
  4. Injecter le virus AAV dans la veine porte à l’aide d’une aiguille stérile de 32 G dans un volume de 50 μL. Insérez l’aiguille de 3 à 5 mm dans la veine du port à un angle inférieur à 5 degrés. Laissez le sang circuler au-delà de l’aiguille pendant 5 secondes pour éviter le reflux.
  5. Placez un coton-tige stérile sur le site d’injection avec une légère pression jusqu’à la fermeture complète de la veine et aucun saignement (environ 5 min) pour éviter les saignements.
  6. Remettez doucement les organes internes dans la cavité abdominale.
  7. Fermez la paroi abdominale et la peau avec une suture en soie 4-0.

4. Analyse qRT-PCR

  1. Extraire les ARN de 50 à 100 mg de tissu hépatique 4,13 à l’aide d’un réactif d’isolement d’ARN disponible dans le commerce en suivant les instructions du fabricant (voir le tableau des matières).
  2. Synthétisez des ADNc 1er brin à partir d’ARN totaux avec des hexamères aléatoires et la transcriptase inverse M-MLV20,21.
  3. Déterminez les valeurs ΔC(t) entre le gène cible et les gènes de référence à l’aide du système de détection PCR en temps réel monochrome et du réactif vert supermix SYBR conformément aux rapports précédemment publiés22,23.
  4. Mesurer les valeurs ΔΔC(t) à partir de quatre répétitions biologiques et de trois répétitions techniques (n = 12). Réglez Tm à 60 °C pour toutes les réactions. Confirmez les résultats à l’aide de deux gènes de référence, Rps3 et Rplp0.
  5. Concevoir les séquences d’amorces comme suit : Ns, 5'-gtc tga tct agt acc aaa gg-3' et 5'-ggg aaa cca atc act cca ac-3' ; Rps3, 5'-atg gcg gtg cag att tcc aa-3' et 5'-cat tct gtg tcc tgg c-3' ; Rplp0, 5'-ctg aag tgc tcg aca tca ca-3' et 5'-agt ctc cac aga caa tgc ca-3'.

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Résultats

Efficacité du gène KD dans le foie par intrasplénique vs. injection dans la veine porte d’AAV8-shRNA
Les stocks viraux d’AAV8 ont été dilués à une concentration de travail de 2E+12 copies du génome (gc) par millilitre (gc/mL). Des souris individuelles ont reçu une injection de 1E+11 gc d’AAV8-shNS1 ou d’AAV8-shScr (50 μL) par injection intrasplénique ou dans la veine porte. Deux semaines après l’injection, des tissus hépatiques...

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Discussion

Le gène KD par livraison virale d’une construction exprimant soit un shRNA dans un fond de type sauvage24,25, soit une construction exprimant la recombinase Cre dans un fond floxé26 est un moyen puissant d’interroger la fonction du gène in vivo d’une manière inductible et contrôlée dans le temps. Une méthode d’administration idéale pour les études in vivo de KO/KD de gèn...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.

Remerciements

Ce travail a été soutenu par le Cancer Prevention Research Institute of Texas (CPRIT) Individual Investigator Research Award (RP200081) à RYT.

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matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
Amicon filter centrifugation unitsMilliporeSigmaUFC9100Fast ultrafiltration
AV5-siRNA-GFP Addgene #124972Plasmid
Competent DH5α bacteria Invitrogen#18265-017Chemically competent strain for cloning 
HpaI New England BiolabsR0105Restriction enzyme
iMFectin transfection reagent GenDepotI7100-101
M-MLV reverse transcriptase PromegaM1708RNA-dependent DNA polymerase 
MyiQ single-color real-time PCR detection system Bio-RadBUN9740RADqRT-PCR
Omega endotoxin-free kit BioteckD6915-03Plasmid DNA midi prep 
Random hexamers Invitrogen48190-011
Supermix SYBR green reagent Bio-Rad1708882Real-time PCR applications
T4 DNA LigasePromegaM1801
TRIzol Reagent Life Technologies15596-018Isolation of high-quality total RNA
XhoINew England BiolabsR0146Restriction enzyme

Références

  1. Wang, J., et al. Epigenome-wide analysis of aging effects on liver regeneration. BMC Biol. 21 (1), 30(2023).
  2. Jindal, A., Jagdish, R. K., Kumar, A. Hepatic regeneration in cirrhosis. J Clin Exp Hepatol. 12 (2), 603-616 (2022).
  3. Meng, L., et al. Nucleostemin deletion reveals an essential mechanism that maintains the genomic stability of stem and progenitor cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (28), 11415-11420 (2013).
  4. Sands, M. S. Aav-mediated liver-directed gene therapy. Methods Mol Biol. 807, 141-157 (2011).
  5. Tenney, R. M., Bell, C. L., Wilson, J. M. AAV8 capsid variable regions at the two-fold symmetry axis contribute to high liver transduction by mediating nuclear entry and capsid uncoating. Virology. 454-455, 227-236 (2014).
  6. Tsai, R. Y., Mckay, R. D. A nucleolar mechanism controlling cell proliferation in stem cells and cancer cells. Genes Dev. 16 (23), 2991-3003 (2002).
  7. Tsai, R. Y., Meng, L. Nucleostemin: A latecomer with new tricks. Int J Biochem Cell Biol. 41 (11), 2122-2124 (2009).
  8. Zhu, Q., Yasumoto, H., Tsai, R. Y. Nucleostemin delays cellular senescence and negatively regulates trf1 protein stability. Mol Cell Biol. 26 (24), 9279-9290 (2006).
  9. Qu, J., Bishop, J. M. Nucleostemin maintains self-renewal of embryonic stem cells and promotes reprogramming of somatic cells to pluripotency. J Cell Biol. 197 (6), 731-745 (2012).
  10. Lin, T., Meng, L., Li, Y., Tsai, R. Y. Tumor-initiating function of nucleostemin-enriched mammary tumor cells. Cancer Res. 70 (22), 9444-9452 (2010).
  11. Maki, N., et al. Rapid accumulation of nucleostemin in nucleolus during newt regeneration. Dev Dyn. 236 (4), 941-950 (2007).
  12. Siddiqi, S., et al. Myocardial induction of nucleostemin in response to postnatal growth and pathological challenge. Circ Res. 103 (1), 89-97 (2008).
  13. Lin, T., Ibrahim, W., Peng, C. -Y., Finegold, M. J., Tsai, R. Y. A novel role of nucleostemin in maintaining the genome integrity of dividing hepatocytes during mouse liver development and regeneration. Hepatology. 58 (6), 2176-2187 (2013).
  14. Shugo, H., et al. Nucleostemin in injury-induced liver regeneration. Stem Cells Dev. 21 (16), 3044-3054 (2012).
  15. Lin, T., et al. Nucleostemin reveals a dichotomous nature of genome maintenance in mammary tumor progression. Oncogene. 38 (20), 3919-3931 (2019).
  16. Wang, J., et al. Nucleostemin modulates outcomes of hepatocellular carcinoma via a tumor adaptive mechanism to genomic stress. Mol Cancer Res. 18 (5), 723-734 (2020).
  17. Crawford, M., Liu, X., Cheng, Y. L., Tsai, R. Y. Nucleostemin upregulation and stat3 activation as early events in oral epithelial dysplasia progression to squamous cell carcinoma. Neoplasia. 23 (12), 1289-1299 (2021).
  18. Lin, T., Meng, L., Wu, L. J., Pederson, T., Tsai, R. Y. Nucleostemin and gnl3l exercise distinct functions in genome protection and ribosome synthesis, respectively. J Cell Sci. 127 (10), 2302-2312 (2014).
  19. Tsai, R. Y. Balancing self-renewal against genome preservation in stem cells: How do they manage to have the cake and eat it too. Cell Mol Life Sci. 73 (9), 1803-1823 (2016).
  20. Meng, L., Hsu, J. K., Tsai, R. Y. Gnl3l depletion destabilizes mdm2 and induces p53-dependent G2/m arrest. Oncogene. 30 (14), 1716-1726 (2011).
  21. Huang, G., Meng, L., Tsai, R. Y. P53 configures the G2/m arrest response of nucleostemin-deficient cells. Cell Death Discov. 1, e15060(2015).
  22. Liu, X., Wang, J., Wu, L. J., Trinh, B., Tsai, R. Y. L. IMPDH inhibition decreases TERT expression and synergizes the cytotoxic effect of chemotherapeutic agents in glioblastoma cells. Int J Mol Sci. 25 (11), 5992(2024).
  23. Liu, X., Wang, J., Li, F., Timchenko, N., Tsai, R. Y. L. Transcriptional control of a stem cell factor nucleostemin in liver regeneration and aging. PLoS One. 19 (9), e0310219(2024).
  24. Mayra, A., et al. Intraperitoneal AAV9-shRNA inhibits target expression in neonatal skeletal and cardiac muscles. Biochem Biophys Res Commun. 405 (2), 204-209 (2011).
  25. Cohen, A., et al. Virus-mediated shRNA knockdown of prodynorphin in the rat nucleus accumbens attenuates depression-like behavior and cocaine locomotor sensitization. PLoS One. 9 (5), e97216(2014).
  26. Jeon, Y., et al. Topbp1 deficiency causes early embryonic lethality and induces cellular senescence in primary cells. J Biol Chem. 286 (7), 5414-5422 (2011).
  27. Smith, T. A., et al. Adenovirus-mediated expression of therapeutic plasma levels of human factor IX in mice. Nat Genet. 5 (4), 397-402 (1993).
  28. Nakai, H., Iwaki, Y., Kay, M. A., Couto, L. B. Isolation of recombinant adeno-associated virus vector-cellular DNA junctions from mouse liver. J Virol. 73 (7), 5438-5447 (1999).
  29. Jung, S. C., et al. Adeno-associated viral vector-mediated gene transfer results in long-term enzymatic and functional correction in multiple organs of Fabry mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 98 (5), 2676-2681 (2001).
  30. Hurford, R. K., Dranoff, G., Mulligan, R. C., Tepper, R. I. Gene therapy of metastatic cancer by in vivo retroviral gene targeting. Nat Genet. 10 (4), 430-435 (1995).
  31. Sarkar, R., Xiao, W., Kazazian, H. H. Jr A single adeno-associated virus (AAV)-murine factor viii vector partially corrects the hemophilia a phenotype. J Thromb Haemost. 1 (2), 220-226 (2003).
  32. Czekaj, P., et al. Optimization of methods for intrasplenic administration of human amniotic epithelial cells in order to perform safe and effective cell-based therapy for liver diseases. Stem Cell Rev Rep. 20 (6), 1599-1617 (2024).

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