Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

نقدم بروتوكولا لتوليد عضية في الدماغ البشري مع الخلايا الدبقية الصغيرة المقيمة من خلال دمج الخلايا السلفية المكونة للدم المستحثة (iPSC) المشتقة من الخلايا الجذعية (HPCs) في التطور العضوي.

Abstract

توفر الثقافات العضوية ثلاثية الأبعاد (3D) المشتقة من الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات (iPSC) بديلا مهما في المختبر لدراسة نمو الدماغ البشري والتسبب في الأمراض العصبية. ومع ذلك ، فإن عدم دمج الخلايا الدبقية الصغيرة في عضيات الدماغ البشري لا يزال يمثل عقبة رئيسية أمام النماذج ثلاثية الأبعاد للالتهاب العصبي. وتشمل الأساليب الحالية إما دمج الخلايا الدبقية الصغيرة المتمايزة تماما في العضيات الدماغ الناضجة أو تحريض تمايز الخلايا الدبقية الصغيرة من المرحلة المبكرة من الأجسام الجنينية المشتقة من iPSC (EBs). يفتقد النهج الأول المرحلة التي يتفاعل فيها تمايز الخلايا الدبقية الصغيرة مع البيئة العصبية المجاورة ، ويمثل النهج الأخير تحديا تقنيا ، مما يؤدي إلى عدم الاتساق بين العضيات النهائية من حيث كمية ونوعية الخلايا الدبقية الصغيرة. لنمذجة عضيات الدماغ مع الخلايا الدبقية الصغيرة لدراسة التفاعلات المبكرة بين التطور الدبقي الصغير والخلايا العصبية, تم دمج الخلايا السلفية المكونة للدم النقاء للغاية (HPC) المتمايزة عن iPSCs البشرية في EBs المشتقة من iPSC لصنع عضيات الدماغ. باستخدام تحليل التلوين المناعي وتسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية (sc-RNA-seq) ، أكدنا أن الحوسبة عالية الأداء قد تم دمجها في العضيات ثلاثية الأبعاد ، والتي تطورت في النهاية إلى عضيات دماغية مع كل من الخلايا الدبقية الصغيرة والخلايا العصبية. بالمقارنة مع عضيات الدماغ التي لا تحتوي على HPCs ، ينتج عن هذا النهج اندماج كبير في الخلايا الدبقية الصغيرة في عضيات الدماغ. يمكن استخدام هذا النموذج العضوي ثلاثي الأبعاد الجديد ، الذي يتكون من خصائص التطور الدبقي الصغير والعصبي ، لدراسة التفاعلات المبكرة بين تطور الجهاز المناعي الفطري والجهاز العصبي وربما كنموذج للالتهاب العصبي والاضطرابات المعدية العصبية.

Introduction

الخلايا الدبقية الصغيرة هي خلايا مناعية سكنية في الدماغ ، تلعب أدوارا حاسمة في كل من نمو الدماغ والتوازن1،2. يؤدي تنشيط الخلايا الدبقية الصغيرة إلى إنتاج عوامل مسببة للالتهابات ، وارتفاع البلعمة ، والإجهاد التأكسدي التفاعلي ، مما يزيل مسببات الأمراض الغازية والخلايا المخترقة. ومع ذلك ، فإن التنشيط المفرط أو التنشيط المطول للخلايا الدبقية الصغيرة قد يتسبب ، من ناحية أخرى ، في حدوث تنكس عصبي كآلية للتسبب في العديد من الاضطرابات العصبية ، بما في ذلك مرض باركنسون3،4. من المهم تضمين الخلايا الدبقية الصغيرة في النماذج ذات الصلة لدراسة الاضطرابات العصبية البشرية. في السنوات الأخيرة ، تم استخدام الخلايا الجذعية البشرية لتطوير عضيات ثلاثية الأبعاد كما هو الحال في النماذج المختبرية كبديل للنماذج الحيوانية ودراسات الموضوعات البشرية5. من الناحية المثالية ، تشكل العضيات البشرية أنواعا متعددة من الخلايا وهياكل الأنسجة المشابهة للأعضاء البشرية المقابلة ، وتمثل علم وظائف الأعضاء البشرية والتسبب في المرض بشكل أفضل من النماذج الحيوانية ولكن بدون المخاوف الأخلاقية التي تنطوي عليها دراسات الأفراد البشريين مباشرة. قد تمثل مستقبل نمذجة الأمراض البشرية لدراسة التسبب في المرض وتطوير الأدوية ولتوجيه العلاجات الفردية6. على سبيل المثال ، سادت عضيات الدماغ البشري ثلاثية الأبعاد المشتقة من الخلايا الجذعية متعددة القدرات التي يسببها الإنسان (iPSCs) في مجال أبحاث علم الأعصاب ، ونمذجة الأمراض المعدية العصبية بما في ذلك زيكا و SARS-CoV-27 والأمراض التنكسية العصبية بما في ذلك التصلب الجانبي الضموري (ALS) ومرض الزهايمر8،9. ومع ذلك ، فإن العضيات العصبية ثلاثية الأبعاد التقليدية التي تستخدم تثبيط SMAD المزدوج للحث على التمايز العصبي10 تنتج عضيات دماغية تفتقر إلى الخلايا الدبقية الصغيرة ، لأنها مشتقة من أسلاف تم تجنيدها من الدم بدلا من سلالة الأديم الظاهر العصبي التي تكون الخلايا العصبية من11،12. بدون وجود الخلايا الدبقية الصغيرة ، تكون العضيات غير كافية لنمذجة التهابات الجهاز العصبي المركزي والالتهابات والتنكس العصبي المرتبط بها.

لمعالجة هذه المشكلة الحرجة ، بذلت محاولات لدمج الخلايا الدبقية الصغيرة المتمايزة في عضيات الدماغ13 أو إحداث تمايز الخلايا الدبقية الدقيقة داخل العضيات من البداية باستخدام مناهج بديلة بدلا من تثبيط SMAD المزدوج13. ومع ذلك ، من خلال دمج الخلايا الدبقية الصغيرة المتمايزة في عضيات الدماغ ، يتم تفويت التفاعلات المبكرة بين تطور الخلايا العصبية والخلايا الدبقية الصغيرة. قد يكون هذا مهما في تطور الجهاز العصبي المركزي أو التسبب في الاضطرابات المعدية العصبية التي تستهدف نمو دماغ الرضيع ، كما هو الحال في عدوى فيروس ZIKA14. من ناحية أخرى, التفريق بين الخلايا الدبقية الصغيرة الفطرية داخل عضيات الدماغ المشتقة من iPSC دون مراحل متقطعة ينطوي على عملية طويلة ولها تباين أعلى داخل المنتجات النهائية15. في هذا البروتوكول المبلغ عنه, قمنا بدمج الخلايا السلفية المكونة للدم المشتقة من iPSC (HPCs) في iPSCs لصنع الأجسام الجنينية (EBs), التي تم تمييزها بشكل أكبر إلى عضيات ثلاثية الأبعاد بما في ذلك كل من الخلايا العصبية والخلايا الدبقية الصغيرة.

يوفر بروتوكولنا نهجا سهلا يمكن اعتماده لدراسة الجهاز العصبي المركزي البشري الذي يتضمن التفاعلات المبكرة بين الخلايا العصبية والخلايا الدبقية الدقيقة والتسبب في الاضطرابات المعدية العصبية والالتهابات العصبية التي تنطوي على تنشيط الخلايا الدبقية الدقيقة.

Protocol

تم جمع عينات الدم الأصلية من المتبرعين البالغين الأصحاء في بنك الدم لطب نقل الدم التابع للمعاهد الوطنية للصحة ، وتم الحصول على نماذج الموافقة المستنيرة الموقعة وفقا لمجلس المراجعة المؤسسية للمعاهد الوطنية للصحة.

1. إنتاج الخلايا السلفية المكونة للدم (HPCs) من الخلايا السلفية البشرية

ملاحظة: خلايا iPSC البشرية 510 و 507 تم استخدامها لإنتاج النتائج التمثيلية. يمكن العثور على طرق توليد وصيانة iPSCs في منشور سابق16.

  1. اليوم 0: قم بتغطية صفيحة خلية مكونة من 12 بئرا بإضافة 500 ميكرولتر / بئر من محلول Matrigel المثلج (مصفوفة الغشاء القاعدي [BMM]) المخفف في وسط DMEM / F12 واحتضانه لمدة 30 دقيقة على الأقل في درجة حرارة الغرفة (RT).
  2. قم بإزالة المادة الطافية للطلاء تماما واستبدلها ب 1 مل من وسط E8 Flex لكل بئر.
  3. تحقق من ثقافة iPSC في 6 لوحة بئر تحت المجهر للتأكد من أن iPSCs ذات جودة عالية وبدون علامات تمايز. اختر مستعمرة متوسطة الحجم عن طريق وضع علامة عليها بقلم تحديد أسفل الجزء السفلي من اللوحة.
  4. إزالة الوسط من ثقافة iPSC وإضافة 500 ميكرولتر من حمض الإيثيلين ديامين تترا أسيتيك (EDTA) iPSC المخزن المؤقت تفكك (0.5 ملي EDTA, 0.45 جم / لتر كلوريد الصوديوم في DPBS) إلى البئر.
  5. راقب تحت المجهر علامات تفكك الخلايا عندما تبدأ ثلاثة إلى أربعة صفوف من الخلايا من حواف المستعمرة في الانكماش ، مع ظهور مساحة فارغة بين الخلايا. يستغرق هذا عادة 1-3 دقائق.
  6. تجاهل محلول EDTA تماما. قم بإخراج مستعمرة iPSC المميزة عن طريق سحب 1 مل من E8 Flex المتوسطة بقوة ومباشرة عليها. تأكد من أن المستعمرة تنفصل تماما إلى بقع خلوية تحتوي على 20-50 خلية لكل منها بعد 1-3 مرات من سحب العينات.
  7. اجمع المادة الطافية التي تحتوي على بقع خلوية وأضفها إلى البئر الأول من الآبار المطلية في الصفيحة المكونة من 12 بئرا.
  8. امزج البئر عن طريق سحب العينات مرة أو مرتين ونقل 1 مل من الخلايا إلى البئر الثاني الذي يحتوي على 1 مل من المتوسط.
  9. كرر الخطوة 1.8 مرتين لعمل ثقافات iPSC مخففة متسلسلة في ما مجموعه أربعة آبار.
  10. احتضان اللوحة في حاضنة 37 درجة مئوية ، 5٪ CO2.
  11. بعد 24 ساعة ، في اليوم الأول ، تحقق من المستعمرات تحت المجهر واحسب أعداد المستعمرات من خلال المرور عبر جميع الحقول في بئر باستمرار. اختيار بئر واحد يحتوي على 10-20 مستعمرات iPSC.
  12. استبدل الوسط ب 1 مل من المتوسط A من مجموعة المكونة للدم. ضع اللوحة مرة أخرى في الحاضنة لمدة 48 ساعة.
  13. في اليوم 3 ، قم بإزالة 500 ميكرولتر من الوسط المستهلك وأضف 500 ميكرولتر من الوسط الطازج أ.
  14. في اليوم 4,لاحظ تحت المجهر ولاحظ نمو الخلايا الكبيرة والتمايز من مستعمرات iPSC. استبدل الوسط ب 1 مل من متوسط B.
  15. راقب تمايز الخلايا تحت المجهر وقم بتغيير نصف متوسط باستخدام 500 ميكرولتر من متوسط B كل يومين. تظهر الخلايا الشبيهة بالحوسبة عالية الأداء في الأيام 6-7.
  16. في اليوم 10 ، لاحظ تحت المجهر خلايا مستديرة واحدة ساطعة مع مورفولوجيا الحوسبة عالية الأداء الطبيعية التي تطفو في الوسط أو متصلة بشكل فضفاض بالطبقة السفلية المفردة من الخلايا المسطحة ، مع بعض مجاميع الخلايا السائبة.
    ملاحظة: الحوسبة عالية الأداء المتمايزة جاهزة للتجميع للتوصيف أو لمزيد من التجربة.
  17. اجمع كل الحوسبة عالية الأداء المتمايزة عن طريق سحب العينات لأعلى ولأسفل ثلاث مرات باستخدام طرف ماصة سعة 1 مل لكسر مجاميع الخلايا وفصل الحوسبة عالية الأداء عن سطح اللوحة.
  18. أضف الخلايا إلى أنبوب سعة 15 مل وقم بالطرد المركزي للخلايا عند 300 × جم لمدة 5 دقائق. قم بإزالة المادة الطافية وأعد تعليق حبيبات الخلية إلى 1 مل من متوسط B.
  19. عد الخلايا واضبط التركيز على 1 مليون خلية / مل. في هذه المرحلة ، يتم إنشاء أكثر من 1 مليون من الحوسبة عالية الأداء. عند فحصها باستخدام قياس التدفق الخلوي ، تأكد من أن النقاء أكثر من 85٪ من الخلايا التي تحتوي على CD34 + / CD43 +. تأكد من عدم ملاحظة خلايا ميتة كبيرة (أكثر من 5٪).

2. تطوير الأجسام الجنينية من iPSCs و HPCs المختلطة

  1. في نفس اليوم لجمع الحوسبة عالية الأداء, تأكد من أن ثقافة iPSC تصل أيضا إلى 80٪ التقاء في بئر واحد في لوحة 6 آبار (أو بئرين في 12 بئر صفيحة).
  2. عالج بئر واحد من لوحة زراعة الميكروويل لتكوين EB ب 500 ميكرولتر من محلول الشطف المضاد للالتصاق عن طريق إضافته لتقليل الفقاعات.
  3. قم بتدوير اللوحة بحجم 2000 × جم لمدة 5 دقائق في دوار دلو متأرجح مزود بحاملات ألواح لإزالة الفقاعات المحتملة.
  4. قم بإزالة محلول الشطف تماما عن طريق سحب العينات وغسل الآبار مرتين باستخدام 1 مل من DPBS ثم 1 مل من DMEM / F12 دون توليد فقاعات.
  5. فصل iPSCs من لوحة عن طريق معالجة الخلايا مع 1 مل من محلول Accutase.
  6. راقب تحت المجهر حتى تظهر على الخلايا علامات الانفصال ولكنها لا تزال متصلة بالأسفل. يحدث هذا عادة في غضون 1-3 دقائق من علاج Accutase. لا تفرط في هضم iPSCs.
  7. قم بإزالة محلول Accutase تماما دون إزعاج الخلايا وأضف 1 مل من وسط DMEM / F12 إلى الآبار. علاوة على ذلك ، قم بفصل الخلايا إلى خلايا مفردة عن طريق سحب العينة لأعلى ولأسفل عدة مرات باستخدام طرف 1 مل.
  8. اجمع الخلايا في أنبوب سعة 15 مل واملأها حتى 5 مل بوسط DMEM / F12. قم بتدوير الخلايا عند 300 × جم لمدة 5 دقائق.
  9. قم بإزالة المادة الطافية عن طريق سحب العينة وإعادة تعليق الخلايا في 1 مل من وسط E8 Flex. عد الخلايا واضبط تركيز الخلية على 1 مليون خلية لكل مل في وسط E8 Flex.
  10. امزج iPSCs مع الحوسبة عالية الأداء بنسبة 2:1 بإضافة 1 مليون من iPSCs (1 مل) ونصف مليون من الحوسبة عالية الأداء (500 ميكرولتر) معا. أضف جميع الخلايا المختلطة إلى البئر المعالج مسبقا للوحة زراعة الميكروويل.
  11. أضف 1 ميكرولتر من محلول مخزون مثبط الصخور Y27632 (1 مل) لكل 1 مل وسط في المادة الطافية. رج الطبق من جانب إلى آخر عدة مرات لتوزيع الخلايا بالتساوي.
  12. قم بتدوير لوحة زراعة الميكروويل بحجم 300 × جم لمدة 5 دقائق في دوار دلو متأرجح مزود بحاملات ألواح. راقب تحت المجهر لمعرفة ما إذا كانت الخلايا قد استقرت في الآبار الصغيرة. (الشكل التكميلي 1 أ).
  13. دون إزعاج الخلايا ، ضع اللوحة في حاضنة خلية 37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 .
  14. في اليوم 2, 48 ساعة في وقت لاحق, مراقبة الخلايا تحت المجهر لتشكيل EBs. عندما يتم تشكيل EBs بوضوح ، تابع إلى الخطوة التالية (الشكل التكميلي 1 ب).
  15. عالج صفيحة زراعة الخلايا المكونة من 24 بئرا بمحلول شطف مضاد للالتصاق (500 ميكرولتر) لمدة 15 دقيقة لعمل لوحة تثبيت منخفضة.
  16. قم بإزالة عازلة الشطف تماما واغسل الآبار مرتين باستخدام 1 مل من DPBS ، ثم أضف 1 مل من وسط E8 Flex في الآبار.
  17. أعد تعليق EBs في لوحة استزراع الآبار الصغيرة عن طريق ماصتها بطرف ماصة فتحة بعرض 1 مل لعدة مرات.
  18. لكل بئر من التصاق المنخفض المعالجة 24 لوحة بئر ، اجمع وأضف 100 ميكرولتر من الوسط الذي يحتوي على EBs. سينتج عن ذلك 10-20 EBs لكل بئر. أضف وسيط E8 Flex إلى البئر القديم الذي يحتوي على بقايا EBs كنسخ احتياطية.
  19. احتضان اللوحة في حاضنة خلية 37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 لمدة 48 ساعة.

3. 3D الحث العضوي العصبي والانتشار والنضج

  1. في اليوم 2 بعد تكوين EB ، قم بإذابة كميات BMM على الجليد لمدة 30 دقيقة على الأقل.
  2. استخدم طرفا مبردا مسبقا سعة 20 ميكرولتر ، وأضف 15 ميكرولتر من كتلة الجسم المثلجة بحكمة فوق الوسط لتغطية EBs. هذا يجعل فيلما من BMM سوف يعلق عليه EBs وينمو عليه.
  3. ضع اللوحة في حاضنة خلية 37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 .
  4. في اليوم 4 ، بعد تكوين EB ، قم بإزالة 500 ميكرولتر من الوسط بعناية دون التخلص من EBs وكرر طلاء BMM باتباع الخطوة 3.2.
  5. ابدأ على الفور في الحث العصبي عن طريق إضافة 500 ميكرولتر من وسيط الحث العصبي PSC فوق الخلايا.
  6. في اليومين 6 و 8 ، قم بإجراء تغيير نصف متوسط عن طريق إزالة 500 ميكرولتر من الوسط بعناية دون لمس الخلايا وإضافة 500 ميكرولتر من وسط الحث العصبي.
  7. في الأيام 10 و 12 و 14 ، قم بإجراء تغيير نصف متوسط باستخدام وسيط الخلايا الجذعية العصبية (NSC): Knockout DMEM / F12 + 1x مكمل Glutamax + 1x مكمل عصبي + bFGF + EGF.
  8. في اليوم 15 ، انقل بئر الكرات بالكامل ذات المتوسط إلى صفيحة جديدة مكونة من 12 بئرا معالجة بمحلول شطف مضاد للالتصاق كما هو موضح سابقا. أضف 500 ميكرولتر من وسط نضج الخلايا العصبية (DMEM / F12 + 1x N2 + 1x B27 + 1x مضادات حيوية مضادة للفطريات) فوق المزرعة.
  9. قم بإجراء تغيير نصف متوسط باستخدام وسيط النضج العصبي كل يومين.
  10. خلال مرحلة النضج ، إذا كانت هناك علامات على استنفاد التغذية ، مثل تغيير لون الوسط ، فقم بنقل العضوي إلى 6 ألواح بئر ، والتي تحتوي على ما يصل إلى 3 مل من الوسط لكل بئر.
  11. اختياريا ، بعد 17 يوما من تكوين EB ، استكمل وسط النضج بالسيتوكينات (IL-34 ، M-CSF ، TGF-β1 ، CD200 ، CX3CL1) لمدة 6 أيام لتسهيل نضوج الخلايا الدبقية الدقيقة.
  12. في اليوم 23 ، اجمع العضيات العصبية الناتجة للتوصيف أو لمزيد من التجارب.

4. إزالة وإزالة بقع مناعية للعضيات العصبية ثلاثية الأبعاد

  1. قم بإصلاح ما يصل إلى 10 عضيات عن طريق الغمر في 1 مل من 4٪ بارافورمالدهيد (PFA) عند 4 درجات مئوية لمدة 24 ساعة.
  2. انقل العضيات لكل بئر إلى صفيحة سفلية شفافة 96 بئر ، واغسلها ب 200 ميكرولتر من DPBS مرتين لمدة ساعة واحدة في كل مرة مع رج لطيف.
  3. قم باختراق العضيات عن طريق غسلها مرة واحدة في 50٪ ميثانول في DPBS ، و 80٪ ميثانول في ماء مقطر مزدوج (dd) ، و 100٪ ميثانول جاف لمدة 10 دقائق لكل منهما ، عند 4 درجات مئوية مع رج لطيف.
  4. اغسل العضيات بشكل متسلسل في 20٪ DMSO / الميثانول ، 80٪ ميثانول في ماء dd ، 50٪ ميثانول في DPBS ، في 100٪ DPBS ، ثم في DPBS مع 0.2٪ Triton X-100 ، لمدة 10 دقائق لكل منها عند 4 درجات مئوية مع رج لطيف. ابذل جهدا لإزالة المخزن المؤقت المتبقي تماما بعد كل غسيل.
  5. احتضن في المخزن المؤقت المتنفذ (DPBS مع 0.2٪ Triton X100 و 0.3 M glycine و 20٪ DMSO) مع اهتزاز لطيف لمدة 40 دقيقة في RT.
  6. قم بالحجب في المخزن المؤقت (DPBS مع 0.2٪ Triton X100 ، و 6٪ مصل الماعز ، و 10٪ DMSO) لمدة ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية مع اهتزاز لطيف على شاكر عند 80 دورة في الدقيقة.
  7. احتضان بالأجسام المضادة في المخزن المؤقت لتخفيف الأجسام المضادة (IBA1 1: 100 ، TREM2 1: 100 ، βIII-tubulin ، 1: 1000 ، 100 ميكرولتر / بئر في DPBS مع 0.2٪ Tween 20 ، 100 ميكروغرام / مل من الهيبارين ، 3٪ مصل الماعز و 5٪ DMSO) عند 37 درجة مئوية لمدة ساعتين أو في غرفة باردة مع رج لطيف عند 80 دورة في الدقيقة لمدة 3 أيام.
  8. يغسل باستخدام DPBS مع 0.2٪ توين 20 ، 100 ميكروغرام / مل من الهيبارين 5 مرات ، 10 دقائق لكل منهما في RT مع رج لطيف على شاكر عند 80 دورة في الدقيقة.
  9. احتضان بجسم مضاد ثانوي (1: 200 ماعز مضاد للفأر Alexa488) عند 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة متبوعا ب RT بين عشية وضحاها مع اهتزاز لطيف على شاكر عند 80 دورة في الدقيقة.
  10. بالنسبة لتلوين التباين النووي ، قم بإجراء تلطيخ DAPI مع حضانة الأجسام المضادة أو في مخزن مؤقت للغسيل.
  11. اغسل العضيات 10 مرات في محلول الغسيل ، 10 دقائق في كل مرة عند 37 درجة مئوية ، مع رج لطيف.
  12. راقب تحت المجهر. إذا كانت الخلفية لا تزال عالية ، فاستمر في غسلها 5 مرات.
  13. تخلص من المادة الطافية قدر الإمكان. أضف 200 ميكرولتر من محلول المقاصة العضوي واحتضنه لمدة 5 دقائق قبل الملاحظة والتقط صورا باستخدام مجهر متحد البؤر.

النتائج

يتبع بروتوكولنا مخططا للتمييز بين الحوسبة عالية الأداء من iPSCs ثم خلط الحوسبة عالية الأداء مع iPSCs لصنع EBs, تليها الحث العصبي, التمايز, والنضج (الشكل 1). تعد الجودة العالية لتمايز الحوسبة عالية الأداء أمرا بالغ الأهمية لنجاح تكوين EB والتمايز...

Discussion

هنا, يتم تقديم بروتوكول مفصل لصنع العضيات العصبية ثلاثية الأبعاد التي تحتوي على الخلايا الدبقية الصغيرة الفطرية من EBs المشتقة من iPSCs المختلطة والحوسبة عالية الأداء المتمايزة iPSC. إنه نهج قصير وسهل نسبيا يتضمن تقنيات ومعدات زراعة الخلايا المتوفرة بشكل عام في معظم المختبر?...

Disclosures

المؤلفون ليس لديهم ما يكشفون عنه.

Acknowledgements

هذه الدراسة مدعومة من قبل صناديق البحوث الداخلية NINDS.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
12 well cell culture platesCorning #3512
24 well cell culture plateSARSTEDT#83.3922
AccutaseThermoA1110501
Aggrewell 400 plateStemcell technologies#34411Referred to as microwell culture plate 
Alexa Fluor 488 goat anti-mouse antibodyLife techniologiesA110011:400 dilution
Alexa Fluor 594 goat anti-rabbit antibodyLife techniologiesA110121:400 dilution
Allegra X-30R Centrifuge with rotor S6069Beckman Couler
Anti- Adherence  Rinsing solutionStem Cell Technologies#07010
anti-CD34 antibodyStem Cell Technologies#600131:100 dilution
anti-Human CD43 antibodyStem Cell Technologies#600851:100 dilution
anti-IBA1 rabbbit antibodyFujifilm019-197412.5 µg/mL
anti-TREM2  rat pAbRD Systemsmab172912.5 µg/mL
Antibiotic-antimycoticGibco15240-0621x
B27 supplementLife technologies17504-0441x
bFGFPeprotech100-18B20 ng/mL
CD200NovoproteinC311 100 ng/mL
CryoTube vialsThermo#368632
CX3CL1Peprotech300-31 100 ng/mL
DAPISigmaD95421 µg/mL
DMEM/F12Life technologies12400-0241x
DMSOSigmaD2650
DPBSGibco#41901361x
E8 Flex medium kitThermoA2858501
EDTAMediatech46-034-Cl 0.5 mM
EGFPeprotechAF-100-1520 ng/mL
EVOS FL Auto MicroscopeThermoFluorescence microscope 
FastStart Universal SYBR Green PCR master mixRoche#4913850001
GlutamaxGibco#35050079
Goat serumSigmaG90234%
IL-34Peprotech200-34 100 ng/mL
ImageXpress Micro ConfocalMolecular Devices
Knockout DMEM/F12Gibco#10829018
M-CSFPeprotech300-25 25 ng/mL
MatrigelCorning#354277Basement membrane matrix (BMM)
Mouse anti-βIII-tubulin antibodyPromegaG712A1:1000 dilution
Mr. Frosty containerThermo5100-0001
N2 supplementLife technologies17502-0481x
ParaformadehydeSigmaP61484%
PSC Neural Induction MediumGibcoA1647801
Rock inhibitor Y27632Stemcell technologies#723041 mM stock
RT LTS 1000 ul pipette tipsRAININ#30389218 for transferring organoids
STEMdiff Cerebral Organoid KitStem Cell Technologies#08570
STEMdiff Hematopoietic KitStemCell Technologies#5310Referred to as hematopoietic Kit
StemPro Neural SupplementGibcoA1050801Referred to as neural supplement
TGF-β1Peprotech100-2150 ng/mL
Total RNA Purification Plus KitNorgen#48400
TritonX-100SigmaT92840.10%
Visikol Histo-Starter KitVisikolHSK-1Contains organoid clearing solution HISTO-M, washing buffer
Zeiss LSM 510-META Confocal MicroscopeZeiss

References

  1. Sabate-Soler, S., et al. Microglia integration into human midbrain organoids leads to increased neuronal maturation and functionality. Glia. 70 (7), 1267-1288 (2022).
  2. Lazarov, T., Juarez-Carreño, S., Cox, N., Geissmann, F. Physiology and diseases of tissue-resident macrophages. Nature. 618 (7966), 698-707 (2023).
  3. Wang, T., Liu, B., Zhang, W., Wilson, B., Hong, J. S. Andrographolide reduces inflammation-mediated dopaminergic neurodegeneration in mesencephalic neuron-glia cultures by inhibiting microglial activation. J Pharmacol Exp Ther. 308 (3), 975-983 (2004).
  4. Qian, L., Flood, P. M., Hong, J. S. Neuroinflammation is a key player in Parkinson's disease and a prime target for therapy. J Neural Transm (Vienna). 117 (8), 971-979 (2010).
  5. Clevers, H. Modeling development and disease with organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
  6. Fakıoğlu, D. M., Altun, B. New therapeutic approaches in cystic fibrosis. Turk J Pharm Sci. 17 (6), 686-697 (2020).
  7. Mcmillan, R. E., Wang, E., Carlin, A. F., Coufal, N. G. Human microglial models to study host-virus interactions. Exp Neurol. 363, 114375 (2023).
  8. Scopa, C., et al. Jun upregulation drives aberrant transposable element mobilization, associated innate immune response, and impaired neurogenesis in Alzheimer's disease. Nat Commun. 14 (1), 8021 (2023).
  9. Tamaki, Y., et al. Spinal cord extracts of amyotrophic lateral sclerosis spread TDP-43 pathology in cerebral organoids. PLoS Genet. 19 (2), e1010606 (2023).
  10. Chambers, S. M., et al. Highly efficient neural conversion of human es and IPS cells by dual inhibition of smad signaling. Nat Biotechnol. 27 (3), 275-280 (2009).
  11. Kim, S. H., Chang, M. Y. Application of human brain organoids-opportunities and challenges in modeling human brain development and neurodevelopmental diseases. Int J Mol Sci. 24 (15), 12528 (2023).
  12. Ginhoux, F., et al. Fate mapping analysis reveals that adult microglia derive from primitive macrophages. Science. 330 (6005), 841-845 (2010).
  13. Ormel, P. R., et al. Microglia innately develop within cerebral organoids. Nat Commun. 9 (1), 4167 (2018).
  14. Abdelmalek, C. M., et al. Building a growing genomic data repository for maternal and fetal health through the ping consortium. medRxiv. , (2024).
  15. Wei, Z., et al. Human IPSC-derived brain organoids: A 3D mini-brain model for studying HIV infection. Exp Neurol. 364, 114386 (2023).
  16. Wang, T., et al. Regulation of stem cell function and neuronal differentiation by HERV-K via mTOR pathway. Proc Natl Acad Sci U S A. 117 (30), 17842-17853 (2020).
  17. Mcquade, A., et al. Development and validation of a simplified method to generate human microglia from pluripotent stem cells. Mol Neurodegener. 13 (1), 67 (2018).
  18. Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Generation of cerebral organoids from human pluripotent stem cells. Nat Protoc. 9 (10), 2329-2340 (2014).
  19. Fiorenzano, A., et al. Single-cell transcriptomics captures features of human midbrain development and dopamine neuron diversity in brain organoids. Nat Commun. 12 (1), 7302 (2021).
  20. Qian, X., et al. Brain-region-specific organoids using mini-bioreactors for modeling ZIKV exposure. Cell. 165 (5), 1238-1254 (2016).
  21. Park, D. S., et al. IPS-cell-derived microglia promote brain organoid maturation via cholesterol transfer. Nature. 623 (7986), 397-405 (2023).
  22. Schafer, S. T., et al. An in vivo neuroimmune organoid model to study human microglia phenotypes. Cell. 186 (10), 2111-2126.e20 (2023).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

215 IPSC

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved