ミクログリア発生によるヒト脳オルガノイドの導出

要約

私たちは、人工多能性幹細胞(iPSC)由来の造血前駆細胞(HPC)をオルガノイド開発に組み込むことにより、常在性ミクログリアを持つヒト脳オルガノイドを生成するプロトコルを提示します。

要約

人工多能性幹細胞(iPSC)に由来する三次元(3D)脳オルガノイド培養は、ヒトの脳の発達と神経疾患の病因を研究するための重要なin vitro ツールを提供します。しかし、ヒトの脳オルガノイドにミクログリアが組み込まれていないことは、神経炎症の3Dモデルにとって依然として大きなハードルとなっています。現在のアプローチには、成熟した脳オルガノイドへの完全分化ミクログリアの組み込み、またはiPS細胞由来の胚様体(EB)の初期段階からのミクログリア分化の誘導が含まれます。最初のアプローチは、ミクログリアの分化が隣接する神経環境と相互作用する段階を見逃し、後のアプローチは技術的に困難であり、その結果、ミクログリアの量と質の点で最終的なオルガノイド間で一貫性がなくなります。ミクログリアを用いた脳オルガノイドをモデル化し、ミクログリアと神経細胞の早期相互作用を研究するために、ヒトiPS細胞から分化した高純度造血前駆細胞(HPC)をiPS細胞由来EBに組み込んで脳オルガノイドを作製しました。免疫染色とシングルセルRNAシーケンシング(sc-RNA-seq)解析により、HPCが3Dオルガノイドに組み込まれ、最終的にミクログリアとニューロンの両方を持つ脳オルガノイドに発展することを確認しました。HPCを使用しない脳オルガノイドと比較して、このアプローチは脳オルガノイドに有意なミクログリアの取り込みをもたらします。この新しい3Dオルガノイドモデルは、ミクログリアと神経の発達特性の両方で構成されており、自然免疫と神経系の発達との間の初期の相互作用を研究するために使用でき、神経炎症や神経感染性疾患のモデルとして使用できる可能性があります。

概要

ミクログリアは脳内の居住免疫細胞であり、脳の発達と恒常性維持の両方に重要な役割を果たしています^1,2。ミクログリアの活性化は、炎症誘発性因子の産生、食作用の上昇、反応性酸化ストレスをもたらし、侵入した病原体や損傷した細胞を排除します。しかし、ミクログリアの過剰活性化や長期化は、パーキンソン病を含む多くの神経疾患の病因として神経変性を引き起こす可能性があります^3,4。ミクログリアがヒトの神経疾患を研究するための関連モデルに含まれることが重要です。近年、ヒト幹細胞は、動物モデルやヒト被験者研究の代替として、in vitroモデルとして3Dオルガノイドの開発に利用されています⁵。理想的には、ヒトオルガノイドは、対応するヒトの臓器に類似した複数の細胞タイプと組織構造を構成し、動物モデルよりもヒトの生理学と病因をよりよく表していますが、ヒトの個人を直接研究することに伴う倫理的な懸念はありません。これらは、病因と医薬品開発の研究、および個別化治療のガイダンスのためのヒト疾患モデリングの未来を象徴している可能性があります⁶。一例として、ヒト人工多能性幹細胞(iPSC)に由来する3Dヒト脳オルガノイドは、神経科学研究の分野で普及しており、ジカ熱、SARS-CoV-2などの神経感染症^7、筋萎縮性側索硬化症(ALS)やアルツハイマー病^8,9などの神経変性疾患をモデル化しています。しかし、ニューロン分化を誘導するためにデュアルSMAD阻害を用いる従来の3次元神経オルガノイド¹⁰は、ニューロンの起源である神経外胚葉系統ではなく、血液から動員された前駆細胞に由来するため、ミクログリアを欠く脳オルガノイドを作製する^11,12。ミクログリアが存在しないと、オルガノイドはCNS感染、炎症、および関連する神経変性をモデル化するには不十分です。

この重要な問題に対処するために、分化したミクログリアを脳オルガノイド¹³ に組み込む試み、またはデュアルSMAD阻害¹³の代わりに代替アプローチを使用してオルガノイド内のミクログリア分化を最初から誘導する試みがなされてきた。しかし、分化したミクログリアを脳オルガノイドに組み込むと、ニューロンとミクログリアの発達との間の初期の相互作用が見逃されてしまいます。これは、中枢神経系の発達や、ジカウイルス感染などの乳児の脳の発達を標的とする神経感染性疾患の病因において重要である可能性があります¹⁴。一方、iPS細胞由来脳オルガノイド内で自然ミクログリアを断続的な病期を伴わずに分化することは、長期にわたるプロセスを伴い、最終生成物内でのばらつきが大きくなります¹⁵。本プロトコールでは、iPS細胞由来の造血前駆細胞(HPC)をiPS細胞に組み込んで胚様体(EB)を作製し、さらにニューロンとミクログリアの両方を含む3次元オルガノイドに分化させました。

私たちのプロトコルは、初期のニューロンとミクログリアの相互作用を含むヒトの中枢神経系と、ミクログリアの活性化に関与する神経感染性疾患および神経炎症の病因を研究するために採用できる簡単なアプローチを提供します。

プロトコル

健康な成人ドナーからの元の血液サンプルは、NIHの輸血医学血液バンクで収集され、NIH治験審査委員会に従って署名されたインフォームドコンセントフォームが取得されました。

1. ヒトiPS細胞からの造血前駆細胞(HPC)の作製

注:ヒトiPS細胞510および507を用いて、代表的な結果を出した。iPS細胞の作製方法と維持方法は、以前の論文¹⁶に記載されています。

1. 0日目:DMEM/F12培地で希釈した氷冷マトリゲル(基底膜マトリックス[BMM])溶液500μL /ウェルを加えて12ウェルセルプレートをコーティングし、室温(RT)で少なくとも30分間インキュベートします。
2. コーティング上清を完全に取り除き、ウェルあたり1 mLのE8 Flex培地と交換します。
3. 顕微鏡下で6ウェルプレートでiPS細胞の培養物をチェックし、iPS細胞が高品質で分化の兆候がないことを確認します。プレートの底の下にマーカーペンでマークを付けて、中型のコロニーを選択します。
4. iPS細胞培養液から培地を取り出し、500 μLのエチレンジアミン四酢酸(EDTA)iPS細胞解離バッファー(0.5 mM EDTA、0.45 g/L NaCl in DPBS)をウェルに加えます。
5. コロニーの端から3〜4列の細胞が縮小し始め、細胞間に空きスペースが現れたときに、細胞解離の兆候を顕微鏡で観察します。これには通常1〜3分かかります。
6. EDTAソリューションを完全に破棄します。標識されたiPS細胞コロニーを、1 mLのE8 Flex培地に直接ピペッティングして取り除きます。コロニーがピペッティングの1〜3回後に、それぞれ20〜50個の細胞を含む細胞パッチに完全に剥離することを確認します。
7. 細胞パッチを含む上清を収集し、12ウェルプレートのコーティングされたウェルの最初のウェルに加えます。
8. 1〜2回ピペッティングしてウェルを混合し、1 mLの細胞を1 mLの培地を含む2番目のウェルに移します。
9. ステップ1.8を2回繰り返して、合計4つのウェルで段階希釈したiPS細胞培養を行います。
10. プレートを37°C、5%CO2インキュベーターでインキュベートします。
11. 24時間後、1日目に、顕微鏡でコロニーをチェックし、井戸内のすべてのフィールドを連続して調べてコロニーの数を数えます。10-20個のiPSCコロニーを含むウェルを1つ選択してください。
12. 培地を造血キットの培地A1mLと交換します。プレートをインキュベーターに48時間戻します。
13. 3日目に、使用済み培地500μLを取り出し、新鮮な培地Aを500μL加えます。
14. 4日目に顕微鏡で観察し、iPS細胞コロニーからの有意な細胞増殖と分化を確認します。培地を1 mLの培地Bと交換します。
15. 顕微鏡下で細胞分化をモニターし、1日おきに500μLの培地Bで半培地交換を行います。HPC様細胞は6〜7日目に現れます。
16. 10日目に、顕微鏡下で、正常なHPCの形態が培地に浮かんでいるか、平らな細胞の単一の底層に緩く付着している明るい単一の丸い細胞を観察します。
    注:差別化されたHPCは、特性評価やさらなる実験のために収集する準備ができています。
17. 1 mLのピペットチップを使用してピペッティングを3回上下し、細胞凝集体を切断し、HPCをプレート表面から切り離すことにより、分化したすべてのHPCを回収します。
18. 細胞を15mLチューブに加え、細胞を300 x g で5分間遠心分離します。上清を取り除き、細胞ペレットを1 mLの培地Bに再懸濁します。
19. 細胞をカウントし、濃度を100万細胞/mLに調整します。この段階では、100万を超えるHPCが生成されます。フローサイトメトリーで確認する場合は、純度がCD34+/CD43+の細胞の85%を超えていることを確認してください。重大な死細胞(5%以上)が見つかっていないことを確認します。

2. iPS細胞とHPCの混合体からの胚様体の開発

1. HPCを採取した当日に、iPS細胞培養物が6ウェルプレートの1ウェル(または12ウェルプレートの2ウェル)で80%のコンフルエンスに達することを確認してください。
2. EB形成のためのマイクロウェル培養プレートの1ウェルを500 μLの抗付着リンス液で処理し、気泡を最小限に抑えるためにそれを追加します。
3. プレートホルダーが取り付けられたスイングバケットローターでプレートを2000 x g で5分間回転させ、気泡を取り除きます。
4. ピペッティングでリンス液を完全に取り除き、1 mLのDPBSでウェルを2回洗浄し、次に1 mLのDMEM/F12で気泡を発生させずに洗浄します。
5. iPSCをプレートから解離するには、細胞を1 mLのAccutase溶液で処理します。
6. 細胞が分離の兆候を示すが、まだ底に付着しているまで顕微鏡で観察します。これは通常、アキュターゼ治療後1〜3分以内に起こります。iPS細胞を過剰に消化しないでください。
7. 細胞を乱さずにアキュターゼ溶液を完全に取り除き、1 mLのDMEM/F12培地をウェルに加えます。さらに、1 mLチップを使用して数回ピペッティングして、細胞を単一細胞に解離します。
8. 細胞を15 mLのチューブに集め、DMEM/F12培地で5 mLまで充填します。細胞を300 x g で5分間回転させます。
9. ピペッティングで上清を除去し、細胞を1 mLのE8 Flex培地に再懸濁します。細胞をカウントし、E8 Flex 培地中の細胞濃度を 100 万細胞/mL に調整します。
10. 100万個のiPS細胞(1mL)と50万個のHPC細胞(500μL)を一緒に加えることにより、iPS細胞とHPCを2:1の比率で混合します。すべての混合細胞を、以前に処理したマイクロウェル培養プレートのウェルに加えます。
11. 1 mL培地あたり1 μLのRock阻害剤Y27632ストック溶液(1 mM)を上清に加えます。プレートを左右に数回振って、細胞を均等に分散させます。
12. マイクロウェル培養プレートを300 x g で5分間、プレートホルダーを取り付けたスイングバケットローターで回転させます。顕微鏡で観察して、細胞がマイクロウェルに落ち着いたかどうかを確認します。(補足図1A)。
13. 細胞を乱さずに、プレートを37°C、5%_CO2 細胞インキュベーターに入れます。
14. 2日目の48時間後、顕微鏡で細胞を観察してEBの形成を確認します。EBが明確に形成されたら、次のステップに進みます(補足図1B)。
15. 24ウェル細胞培養プレートを抗付着リンスバッファー(500 μL)で15分間処理し、低接着プレートを作製します。
16. リンスバッファーを完全に取り外し、1 mLのDPBSでウェルを2回洗浄し、1 mLのE8 Flex培地をウェルに加えます。
17. EBをマイクロウェル培養プレートに再懸濁するには、幅1 mLのオリフィスピペットチップで数回ピペッティングします。
18. 低接着処理した24ウェルプレートの各ウェルについて、EBを含む培地100μLを回収して添加します。これにより、ウェルあたり10〜20 EBになります。E8 Flex Mediumを、バックアップとして残ったEBを含む古いウェルに追加します。
19. プレートを37°C、5%CO₂ 細胞インキュベーターで48時間インキュベートします。

3. 3D神経オルガノイドの誘導、増殖、成熟

1. EB形成後2日目に、BMMのアリコートを氷上で少なくとも30分間解凍します。
2. あらかじめ冷やした20μLのチップを使用し、15μLの氷冷したBMMドロップを培地の上に賢く加えてEBをコーティングします。これにより、EBが付着して成長するBMMの膜が作成されます。
3. プレートを37°C、5%CO₂ 細胞インキュベーターに入れます。
4. 4日目に、EB形成後、EBを捨てずに500μLの培地を慎重に取り除き、手順3.2に従ってBMMコーティングを繰り返します。
5. 細胞の上に500μLのPSC神経誘導培地を添加して、すぐに神経誘導を開始します。
6. 6日目と8日目に、細胞に触れずに500μLの培地を慎重に取り除き、500μLの神経誘導培地を追加して、半量交換を行います。
7. 10日目、12日目、14日目に、神経幹細胞(NSC)培地で半量交換を行います:ノックアウトDMEM/F12 + 1x Glutamaxサプリメント + 1x Neural supplement + bFGF + EGF。
8. 15日目に、培地を含む球体のウェル全体を、前述のように付着防止リンス溶液で処理した新しい12ウェルプレートに移します。500 μLの神経細胞成熟培地(DMEM/F12 + 1x N2 Supplement + 1x B27 supplement + 1x antimincotictic)を培養液の上に加えます。
9. 神経細胞成熟培地を用いて半媒体交換を1日おきに行う。
10. 成熟期に培地の色が変わるなど、栄養の枯渇の兆候が見られる場合は、オルガノイドをウェルあたり最大3 mLの培地を保持できる6ウェルプレートに移動します。
11. 必要に応じて、EB形成の17日後に、ミクログリアの成熟を促進するために、成熟培地にサイトカイン(IL-34、M-CSF、TGF-β1、CD200、CX3CL1)を6日間補給します。
12. 23日目に、得られた神経オルガノイドを収集して、特性評価またはさらなる実験を行います。

4. 3D神経オルガノイドのクリアランスと免疫染色

1. 4%パラホルムアルデヒド(PFA)1 mLに4°Cで24時間浸漬することにより、最大10個のオルガノイドを固定します。
2. ウェルごとのオルガノイドを96ウェルの透明な底板に移し、200μLのDPBSで1時間ごとに2回、穏やかに振とうしながら洗浄します。
3. オルガノイドをDPBSで50%メタノールで1回、80%メタノールで二重蒸留水(dd)で1回、100%乾燥メタノールで各10分間、4°Cで穏やかに振とうしながらオルガノイドを洗浄して透過化します。
4. オルガノイドを20% DMSO/メタノール、80%メタノールをdd水、50%メタノールをDPBSに浸し、100% DPBSで順次洗浄し、次に0.2% Triton X-100を含むDPBSで、それぞれ4°Cで10分間、穏やかに振とうしながら洗浄します。洗浄のたびに、残留バッファーを完全に除去する努力をしてください。
5. 透過化バッファー(DPBS、0.2% Triton X100、0.3 M グリシン、20% DMSO)で室温で40分間穏やかに振とうしながらインキュベートします。
6. ブロッキングバッファー(DPBS、0.2% Triton X100、6% Goat serum、10% DMSO)で37°Cで1時間、80 rpmのシェーカーで穏やかに振とうしながらブロックします。
7. 抗体希釈バッファー(IBA1 1:100、TREM2 1:100、βIII-tubulin、1:1000、100 μL /ウェル、0.2% Tween 20、100 μg/mL Heparin、3% Goat Serum、5% DMSO)のDPBS溶液中で抗体とインキュベートし、37°Cで2時間、または冷蔵室で80 rpmで3日間穏やかに振とうします。
8. 0.2% Tween 20、100 μg/mL ヘパリンを 5 回、各 10 分間 RT で DPBS で洗浄し、80 rpm のシェーカーで穏やかに振とうします。
9. 二次抗体(1:200ヤギ抗マウスAlexa488)と37°Cで1時間インキュベートした後、80rpmのシェーカーで穏やかに振とうしながら一晩RTします。
10. 核造影剤染色では、抗体インキュベーションと併用して、または洗浄バッファー中でDAPI染色を行います。
11. オルガノイドを洗浄バッファーで10回、毎回37°Cで10分間、穏やかに振とうしながら洗浄します。
12. 顕微鏡で観察します。それでも背景が高い場合は、5回洗い続けます。
13. 上澄みはできるだけ捨ててください。オルガノイドクリアリング溶液200μLを加え、5分間インキュベートしてから観察し、共焦点顕微鏡で画像を撮影します。

結果

私たちのプロトコルは、HPCとiPS細胞を区別し、HPCとiPS細胞を混合してEBを作り、その後、神経誘導、分化、成熟を行うというスキームに従っています(図1)。HPCの分化の高品質は、EB形成とその後のオルガノイド分化の成功にとって重要です。段階希釈培養技術を使用して、HPCの分化を開始するための適切な数とサイズのiP...

ディスカッション

ここでは、混合iPS細胞とiPS細胞分化HPCに由来するEBから自然ミクログリアを含む3D神経オルガノイドを作製するための詳細なプロトコルを紹介します。これは、ほとんどのラボで一般的に入手可能な細胞培養技術と機器のみを使用する、比較的短くて簡単なアプローチです。

このプロトコルを成功させるための最も重要な要素は、HPCの差別化の品...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
12 well cell culture plates	Corning	#3512
24 well cell culture plate	SARSTEDT	#83.3922
Accutase	Thermo	A1110501
Aggrewell 400 plate	Stemcell technologies	#34411	Referred to as microwell culture plate
Alexa Fluor 488 goat anti-mouse antibody	Life techniologies	A11001	1:400 dilution
Alexa Fluor 594 goat anti-rabbit antibody	Life techniologies	A11012	1:400 dilution
Allegra X-30R Centrifuge with rotor S6069	Beckman Couler
Anti- Adherence  Rinsing solution	Stem Cell Technologies	#07010
anti-CD34 antibody	Stem Cell Technologies	#60013	1:100 dilution
anti-Human CD43 antibody	Stem Cell Technologies	#60085	1:100 dilution
anti-IBA1 rabbbit antibody	Fujifilm	019-19741	2.5 µg/mL
anti-TREM2  rat pAb	RD Systems	mab17291	2.5 µg/mL
Antibiotic-antimycotic	Gibco	15240-062	1x
B27 supplement	Life technologies	17504-044	1x
bFGF	Peprotech	100-18B	20 ng/mL
CD200	Novoprotein	C311	100 ng/mL
CryoTube vials	Thermo	#368632
CX3CL1	Peprotech	300-31	100 ng/mL
DAPI	Sigma	D9542	1 µg/mL
DMEM/F12	Life technologies	12400-024	1x
DMSO	Sigma	D2650
DPBS	Gibco	#4190136	1x
E8 Flex medium kit	Thermo	A2858501
EDTA	Mediatech	46-034-Cl	0.5 mM
EGF	Peprotech	AF-100-15	20 ng/mL
EVOS FL Auto Microscope	Thermo		Fluorescence microscope
FastStart Universal SYBR Green PCR master mix	Roche	#4913850001
Glutamax	Gibco	#35050079
Goat serum	Sigma	G9023	4%
IL-34	Peprotech	200-34	100 ng/mL
ImageXpress Micro Confocal	Molecular Devices
Knockout DMEM/F12	Gibco	#10829018
M-CSF	Peprotech	300-25	25 ng/mL
Matrigel	Corning	#354277	Basement membrane matrix (BMM)
Mouse anti-βIII-tubulin antibody	Promega	G712A	1:1000 dilution
Mr. Frosty container	Thermo	5100-0001
N2 supplement	Life technologies	17502-048	1x
Paraformadehyde	Sigma	P6148	4%
PSC Neural Induction Medium	Gibco	A1647801
Rock inhibitor Y27632	Stemcell technologies	#72304	1 mM stock
RT LTS 1000 ul pipette tips	RAININ	#30389218	for transferring organoids
STEMdiff Cerebral Organoid Kit	Stem Cell Technologies	#08570
STEMdiff Hematopoietic Kit	StemCell Technologies	#5310	Referred to as hematopoietic Kit
StemPro Neural Supplement	Gibco	A1050801	Referred to as neural supplement
TGF-β1	Peprotech	100-21	50 ng/mL
Total RNA Purification Plus Kit	Norgen	#48400
TritonX-100	Sigma	T9284	0.10%
Visikol Histo-Starter Kit	Visikol	HSK-1	Contains organoid clearing solution HISTO-M, washing buffer
Zeiss LSM 510-META Confocal Microscope	Zeiss