Derivación de un organoide cerebral humano con desarrollo de microglía

Resumen

Presentamos un protocolo para generar un organoide cerebral humano con microglía residente mediante la incorporación de células progenitoras hematopoyéticas (HPC) derivadas de células madre pluripotentes inducidas (iPSC) en el desarrollo de organoides.

Resumen

Los cultivos tridimensionales (3D) de organoides cerebrales derivados de células madre pluripotentes inducidas (iPSC) proporcionan una importante herramienta alternativa in vitro para estudiar el desarrollo del cerebro humano y la patogénesis de las enfermedades neurológicas. Sin embargo, la falta de incorporación de microglía en los organoides del cerebro humano sigue siendo un obstáculo importante para los modelos 3D de neuroinflamación. Los enfoques actuales incluyen la incorporación de microglía completamente diferenciada en organoides cerebrales maduros o la inducción de la diferenciación microglial desde la etapa temprana de cuerpos embrioides (EB) derivados de iPSC. El primer enfoque pasa por alto la etapa en la que la diferenciación microglial interactúa con el entorno neuronal adyacente, y el último enfoque es técnicamente desafiante, lo que resulta en inconsistencia entre los organoides finales en términos de la cantidad y calidad de la microglía. Para modelar organoides cerebrales con microglía para estudiar las interacciones tempranas entre el desarrollo microglial y neuronal, se incorporaron células progenitoras hematopoyéticas (HPC) de alta pureza diferenciadas de las iPSC humanas en EB derivadas de iPSC para producir organoides cerebrales. Mediante el uso de inmunotinción y secuenciación de ARN de una sola célula (sc-RNA-seq), confirmamos que las HPC se incorporaron a los organoides 3D, que finalmente se convirtieron en organoides cerebrales con microglía y neuronas. En comparación con los organoides cerebrales sin HPC, este enfoque produce una incorporación microglial significativa en los organoides cerebrales. Este novedoso modelo de organoide 3D, que consta de propiedades de desarrollo microglial y neuronal, se puede utilizar para estudiar las interacciones tempranas entre el desarrollo inmunitario innato y del sistema nervioso y, potencialmente, como modelo para la neuroinflamación y los trastornos neuroinfecciosos.

Introducción

Las microglías son células inmunitarias residenciales en el cerebro, que desempeñan un papel fundamental tanto en el desarrollo del cerebro como en la homeostasis ^1,2. La activación de la microglía da lugar a la producción de factores proinflamatorios, fagocitosis elevada y estrés oxidativo reactivo, que elimina los patógenos invasores y las células comprometidas. Sin embargo, la sobreactivación o la activación prolongada de la microglía puede, por otro lado, causar neurodegeneración como mecanismo de patogénesis en muchos trastornos neurológicos, incluida la enfermedad de Parkinson ^3,4. Es importante que la microglía se incluya en los modelos relevantes para el estudio de los trastornos neurológicos humanos. En los últimos años, las células madre humanas se han utilizado para desarrollar organoides 3D como modelos in vitro como alternativa a los modelos animales y a los estudios con sujetos humanos⁵. Idealmente, los organoides humanos constituyen múltiples tipos de células y estructuras de tejidos similares a los órganos humanos correspondientes, representando mejor la fisiología y la patogénesis humanas que los modelos animales, pero sin las preocupaciones éticas involucradas en los estudios de individuos humanos directamente. Pueden representar el futuro de la modelización de enfermedades humanas para el estudio de la patogénesis y el desarrollo de fármacos y para la orientación de terapias individualizadas⁶. Por ejemplo, los organoides cerebrales humanos en 3D derivados de células madre pluripotentes inducidas por humanos (iPSC) han prevalecido en el campo de la investigación en neurociencia, modelando enfermedades infecciosas neuronales como el ZIKA, el SARS-CoV-2⁷ y enfermedades neurodegenerativas como la esclerosis lateral amiotrófica (ELA) y la enfermedad de Alzheimer ^8,9. Sin embargo, los organoides neuronales 3D convencionales que utilizan la inhibición de SMAD dual para inducir la diferenciación neuronal¹⁰ producen organoides cerebrales que carecen de microglía, ya que se derivan de progenitores reclutados de la sangre en lugar del linaje del neuroectodermo del que provienen las neuronas ^11,12. Sin la presencia de microglía, los organoides son inadecuados para modelar las infecciones del SNC, la inflamación y la neurodegeneración asociada.

Para abordar este problema crítico, se han realizado intentos de incorporar microglía diferenciada en los organoides cerebrales¹³ o inducir la diferenciación microglial dentro de los organoides desde el principio utilizando enfoques alternativos en lugar de la inhibición de SMAD dual¹³. Sin embargo, al incorporar microglía diferenciada en los organoides cerebrales, se pierden las interacciones tempranas entre el desarrollo neuronal y microglial. Esto podría ser importante en el desarrollo del SNC o en la patogénesis de trastornos neuroinfecciosos dirigidos al desarrollo del cerebro infantil, como en la infección por el virus ZIKA¹⁴. Por otro lado, la diferenciación de la microglía innata dentro de organoides cerebrales derivados de iPSC sin etapas intermitentes implica un proceso prolongado y tiene una mayor variabilidad dentro de los productos finales¹⁵. En este protocolo informado, incorporamos las células progenitoras hematopoyéticas (HPC) derivadas de iPSC en las iPSC para crear cuerpos embrioides (EB), que se diferenciaron aún más en organoides 3D que incluían neuronas y microglía.

Nuestro protocolo proporciona un enfoque fácil que se puede adoptar para estudiar el sistema nervioso central humano que involucra interacciones neuronas y microgliales tempranas y la patogénesis de trastornos infecciosos neuronales y neuroinflamación que involucran activación microglial.

Protocolo

Las muestras de sangre originales de donantes adultos sanos se recolectaron en el Banco de Sangre de Medicina Transfusional de los NIH, y se obtuvieron formularios de consentimiento informado firmados de acuerdo con la Junta de Revisión Institucional de los NIH.

1. Producción de células progenitoras hematopoyéticas (HPC) a partir de iPSC humanas

NOTA: Se utilizaron las células iPSC humanas 510 y 507 para producir los resultados representativos. Los métodos de generación y mantenimiento de las iPSCs se pueden encontrar en una publicación anterior¹⁶.

1. Día 0: Cubrir una placa de celdas de 12 pocillos añadiendo 500 μL/pocillo de solución helada de Matrigel (matriz de membrana basal [BMM]) diluida en medio DMEM/F12 e incubarla durante al menos 30 minutos a temperatura ambiente (RT).
2. Retire completamente el sobrenadante de recubrimiento y reemplácelo con 1 mL de medio E8 Flex por pocillo.
3. Verifique el cultivo de iPSC en una placa de 6 pocillos bajo el microscopio para confirmar que las iPSC son de alta calidad y sin signos de diferenciación. Elige una colonia de tamaño mediano marcándola con un rotulador debajo de la parte inferior del plato.
4. Retire el medio del cultivo de iPSC y añada 500 μL de tampón de disociación iPSC de ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) (0,5 mM de EDTA, 0,45 g/L de NaCl en DPBS) al pocillo.
5. Observe bajo un microscopio los signos de disociación celular cuando tres o cuatro filas de células de los bordes de la colonia comienzan a encogerse, con la aparición de espacio vacío entre las células. Esto suele tardar entre 1 y 3 minutos.
6. Deseche la solución de EDTA por completo. Desaloje la colonia de iPSC marcada pipeando 1 mL de medio E8 Flex con fuerza y directamente sobre ella. Asegúrese de que la colonia se desprenda completamente en parches celulares que contengan de 20 a 50 células cada uno después de 1 a 3 veces de pipeteo.
7. Recoja el sobrenadante que contiene parches celulares y agréguelo al primer pocillo de los pocillos recubiertos en la placa de 12 pocillos.
8. Mezcle el pocillo pipeteando una o dos veces y transfiera 1 mL de las células al segundo pocillo que contiene 1 mL de medio.
9. Repita el paso 1.8 dos veces para hacer cultivos de iPSC diluidos en serie en un total de cuatro pocillos.
10. Incubar la placa en una incubadora a 37 °C, 5% de CO2.
11. Pasadas las 24 h, el día 1, revisa las colonias bajo el microscopio y cuenta el número de colonias recorriendo todos los campos de un pozo de forma continua. Elija un pozo que contenga de 10 a 20 colonias de iPSC.
12. Reemplace el medio con 1 mL de medio A del kit hematopoyético. Vuelva a colocar la placa en la incubadora durante 48 h.
13. El día 3, retire 500 μL de medio gastado y agregue 500 μL de medio A fresco.
14. El día 4, observe bajo el microscopio y note un crecimiento celular significativo y una diferenciación de las colonias de iPSC. Reemplace el medio con 1 mL de medio B.
15. Controle la diferenciación celular bajo el microscopio y realice el cambio de medio medio con 500 μL de medio B cada dos días. Las células tipo HPC aparecen en los días 6-7.
16. En el día 10, observe bajo el microscopio células redondas brillantes con la morfología de las HPC normales flotando en el medio o débilmente unidas a la capa inferior única de células planas, con algunos agregados de células sueltas.
    NOTA: Las HPC diferenciadas están listas para su recolección para su caracterización o experimentación adicional.
17. Recoja todas las HPC diferenciadas pipeteando hacia arriba y hacia abajo tres veces con una punta de pipeta de 1 ml para romper los agregados de células y separar las HPC de la superficie de la placa.
18. Agregue las células en un tubo de 15 ml y centrifugue las células a 300 x g durante 5 minutos. Retire el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet celular en 1 mL de medio B.
19. Cuente las células y ajuste la concentración a 1 millón de células/mL. En esta etapa, se generan más de 1 millón de HPC. Cuando se comprueba con citometría de flujo, asegúrese de que la pureza sea superior al 85% de las células con CD34+/CD43+. Asegúrese de que no se detecten células muertas significativas (más del 5%).

2. Desarrollo de cuerpos embrioides a partir de iPSCs y HPCs mixtas

1. El mismo día de la recolección de las HPC, asegúrese de que un cultivo de iPSC también alcance el 80 % de confluencia en un pocillo en una placa de 6 pocillos (o dos pocillos en una placa de 12 pocillos).
2. Trate un pocillo de la placa de cultivo de micropocillos para la formación de EB con 500 μL de solución de enjuague antiadherente agregándola para minimizar las burbujas.
3. Girar la placa a 2000 x g durante 5 min en un rotor de cubo oscilante equipado con soportes de placa para eliminar posibles burbujas.
4. Retire completamente la solución de enjuague pipeteando y lave los pocillos dos veces con 1 mL de DPBS y luego 1 mL de DMEM/F12 sin generar burbujas.
5. Disocie las iPSC de la placa tratando las células con 1 mL de solución de Accutasa.
6. Observe bajo el microscopio hasta que las células muestren signos de separación, pero aún estén unidas al fondo. Esto suele ocurrir entre 1 y 3 minutos después del tratamiento con Accutase. No digiera en exceso las iPSC.
7. Retire completamente la solución de Accutase sin alterar las células y agregue 1 mL de medio DMEM/F12 a los pocillos. Además, disocie las células en células individuales pipeteando hacia arriba y hacia abajo un par de veces con una punta de 1 mL.
8. Recoja las células en un tubo de 15 mL y llénelo hasta 5 mL con medio DMEM/F12. Girar las celdas a 300 x g durante 5 min.
9. Retire el sobrenadante pipeteando y vuelva a suspender las células en 1 ml de medio E8 Flex. Cuente las células y ajuste la concentración de células a 1 millón de células por ml en el medio E8 Flex.
10. Mezcle iPSC con HPC en una proporción de 2:1 añadiendo 1 millón de iPSC (1 mL) y medio millón de HPC (500 μL) juntos. Agregue todas las células mezcladas en el pocillo previamente tratado de la placa de cultivo de micropocillos.
11. Añada 1 μL de solución madre del inhibidor de rocas Y27632 (1 mM) por 1 mL de medio en el sobrenadante. Agite el plato de lado a lado varias veces para distribuir las células de manera uniforme.
12. Gire la placa de cultivo de micropocillos a 300 x g durante 5 min en un rotor de cangilón oscilante equipado con soportes para placas. Observe bajo el microscopio para ver si las células se han asentado en los micropocillos. (Figura complementaria 1A).
13. Sin alterar las células, coloque la placa en una incubadora de células a 37 °C, 5% de CO₂ .
14. El día 2, 48 h después, observe las células bajo el microscopio para detectar la formación de EB. Cuando los EB estén claramente formados, continúe con el siguiente paso (Figura complementaria 1B).
15. Trate una placa de cultivo celular de 24 pocillos con tampón de enjuague antiadherente (500 μL) durante 15 min para hacer una placa de fijación baja.
16. Retire el tampón de enjuague por completo y lave los pocillos dos veces con 1 mL de DPBS, luego agregue 1 mL de medio E8 Flex en los pocillos.
17. Vuelva a suspender los EB en la placa de cultivo de micropocillos pipeteándolos con una punta de pipeta de orificio de 1 ml de ancho varias veces.
18. Para cada pocillo de las placas de 24 pocillos tratados con baja adherencia, recoja y agregue 100 μL de medio que contenga EB. Esto dará como resultado de 10 a 20 EB por pozo. Agregue el medio E8 Flex al pozo antiguo que contiene los EB sobrantes como respaldo.
19. Incubar la placa en una incubadora de células de_CO2 al 5% de 37 °C durante 48 h.

3. 3D inducción, proliferación y maduración de organoides neuronales

1. El día 2 después de la formación de EB, descongele las alícuotas de BMM en el hielo durante al menos 30 minutos.
2. Use una punta preenfriada de 20 μL y agregue 15 μL de gota de BMM helada sabiamente sobre el medio para cubrir los EB. Esto crea una película de BMM a la que los EB se adherirán y crecerán.
3. Coloque la placa en una incubadora de células de CO₂ al 5% a 37 °C.
4. El día 4, después de la formación de EB, retire 500 μL de medio con cuidado sin descartar EB y repita el recubrimiento BMM siguiendo el paso 3.2.
5. Inicie inmediatamente la inducción neuronal agregando 500 μL de medio de inducción neuronal PSC sobre las células.
6. En los días 6 y 8, realice el medio cambio de medio retirando cuidadosamente 500 μL de medio sin tocar las células y agregando 500 μL de medio de inducción neural.
7. En los días 10, 12 y 14, realice un medio cambio de medio con medio de células madre neurales (NSC): Knockout DMEM/F12 + 1x suplemento Glutamax + 1x suplemento neural + bFGF + EGF.
8. El día 15, transfiera todo el pocillo de esferas con medio a una nueva placa de 12 pocillos tratada con una solución de enjuague antiadherente como se describió anteriormente. Añadir 500 μL de medio de maduración neuronal (DMEM/F12 + 1x suplemento de N2 + 1x suplemento de B27 + 1x antibióticos-antimicóticos) sobre el cultivo.
9. Realizar un cambio de medio medio con medio de maduración neuronal cada dos días.
10. Durante la etapa de maduración, si hay signos de agotamiento de la nutrición, como el cambio de color del medio, mueva el organoide a placas de 6 pocillos, que contienen hasta 3 ml de medio por pocillo.
11. Opcionalmente, 17 días después de la formación de EB, suplementar el medio de maduración con citocinas (IL-34, M-CSF, TGF-β1, CD200, CX3CL1) durante 6 días para facilitar la maduración microglial.
12. El día 23, recoja los organoides neuronales resultantes para su caracterización o experimentos adicionales.

4. Aclaramiento e inmunotinción de organoides neuronales 3D

1. Fijar hasta 10 organoides por inmersión en 1 mL de paraformaldehído (PFA) al 4% a 4 °C durante 24 h.
2. Transfiera los organoides por pocillo a una placa inferior transparente de 96 pocillos y lave con 200 μL de DPBS 2 veces durante 1 h cada vez con una agitación suave.
3. Permeabilizar los organoides lavándolos una vez con metanol al 50% en DPBS, al 80% de metanol en agua bidestilada (dd) y al 100% de metanol seco durante 10 minutos cada uno, a 4 °C con una agitación suave.
4. Lavar los organoides en serie con 20% de DMSO/metanol, 80% de metanol en agua dd, 50% de metanol en DPBS, en 100% de DPBS, luego en DPBS con 0,2% Triton X-100, durante 10 min cada uno a 4 °C con una agitación suave. Haga un esfuerzo por eliminar completamente el tampón residual después de cada lavado.
5. Incubar en tampón permeable (DPBS con 0,2% de Triton X100, 0,3 M de glicina y 20% de DMSO) con una agitación suave durante 40 min en RT.
6. Bloquear en tampón de bloqueo (DPBS con 0,2% Triton X100, 6% suero de cabra y 10% DMSO) durante 1 h a 37 °C con una suave agitación en un agitador a 80 rpm.
7. Incubar con anticuerpos en tampón de dilución de anticuerpos (IBA1 1:100, TREM2 1:100, βIII-tubulina, 1:1000, 100 μL /pocillo en DPBS con 0,2% Tween 20, 100 μg/mL de heparina, 3% de suero de cabra y 5% de DMSO) a 37 °C durante 2 h o en cámara frigorífica con agitación suave a 80 rpm durante 3 días.
8. Lavar con DPBS con 0,2% Tween 20, 100 μg/mL de heparina 5 veces, 10 min cada una a RT con agitación suave en un agitador a 80 rpm.
9. Incubar con anticuerpo secundario (Alexa488 anti-ratón de cabra 1:200) a 37 °C durante 1 h, seguido de RT durante la noche con agitación suave en un agitador a 80 rpm.
10. Para la tinción con contraste nuclear, realice la tinción DAPI junto con la incubación de anticuerpos o en un tampón de lavado.
11. Lavar los organoides 10 veces en tampón de lavado, 10 min cada vez a 37 °C, agitando suavemente.
12. Observa bajo un microscopio. Si el fondo sigue siendo alto, sigue lavándolo 5 veces.
13. Deseche el sobrenadante tanto como sea posible. Añadir 200 μL de solución de aclarado de organoides e incubar durante 5 minutos antes de la observación y tomar imágenes con un microscopio confocal.

Resultados

Nuestro protocolo sigue un esquema para diferenciar las HPC de las iPSC y luego mezclar las HPC con las iPSC para hacer EB, seguido de inducción, diferenciación y maduración neuronal (Figura 1). La alta calidad de la diferenciación de HPC es fundamental para el éxito de la formación de EB y la posterior diferenciación de organoides. Se utiliza una técnica de cultivo de dilución en serie para producir el número y el ...

Discusión

Aquí, se presenta un protocolo detallado para hacer organoides neuronales 3D que contienen microglía innata a partir de EB derivadas de iPSC mixtas y HPC diferenciadas por iPSC. Es un enfoque relativamente corto y fácil que involucra solo técnicas y equipos de cultivo celular generalmente disponibles en la mayoría de los laboratorios.

El factor más crítico para el éxito de este protocolo es la calidad de la diferenciación de HPC. Adoptamos el método ...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
12 well cell culture plates	Corning	#3512
24 well cell culture plate	SARSTEDT	#83.3922
Accutase	Thermo	A1110501
Aggrewell 400 plate	Stemcell technologies	#34411	Referred to as microwell culture plate
Alexa Fluor 488 goat anti-mouse antibody	Life techniologies	A11001	1:400 dilution
Alexa Fluor 594 goat anti-rabbit antibody	Life techniologies	A11012	1:400 dilution
Allegra X-30R Centrifuge with rotor S6069	Beckman Couler
Anti- Adherence  Rinsing solution	Stem Cell Technologies	#07010
anti-CD34 antibody	Stem Cell Technologies	#60013	1:100 dilution
anti-Human CD43 antibody	Stem Cell Technologies	#60085	1:100 dilution
anti-IBA1 rabbbit antibody	Fujifilm	019-19741	2.5 µg/mL
anti-TREM2  rat pAb	RD Systems	mab17291	2.5 µg/mL
Antibiotic-antimycotic	Gibco	15240-062	1x
B27 supplement	Life technologies	17504-044	1x
bFGF	Peprotech	100-18B	20 ng/mL
CD200	Novoprotein	C311	100 ng/mL
CryoTube vials	Thermo	#368632
CX3CL1	Peprotech	300-31	100 ng/mL
DAPI	Sigma	D9542	1 µg/mL
DMEM/F12	Life technologies	12400-024	1x
DMSO	Sigma	D2650
DPBS	Gibco	#4190136	1x
E8 Flex medium kit	Thermo	A2858501
EDTA	Mediatech	46-034-Cl	0.5 mM
EGF	Peprotech	AF-100-15	20 ng/mL
EVOS FL Auto Microscope	Thermo		Fluorescence microscope
FastStart Universal SYBR Green PCR master mix	Roche	#4913850001
Glutamax	Gibco	#35050079
Goat serum	Sigma	G9023	4%
IL-34	Peprotech	200-34	100 ng/mL
ImageXpress Micro Confocal	Molecular Devices
Knockout DMEM/F12	Gibco	#10829018
M-CSF	Peprotech	300-25	25 ng/mL
Matrigel	Corning	#354277	Basement membrane matrix (BMM)
Mouse anti-βIII-tubulin antibody	Promega	G712A	1:1000 dilution
Mr. Frosty container	Thermo	5100-0001
N2 supplement	Life technologies	17502-048	1x
Paraformadehyde	Sigma	P6148	4%
PSC Neural Induction Medium	Gibco	A1647801
Rock inhibitor Y27632	Stemcell technologies	#72304	1 mM stock
RT LTS 1000 ul pipette tips	RAININ	#30389218	for transferring organoids
STEMdiff Cerebral Organoid Kit	Stem Cell Technologies	#08570
STEMdiff Hematopoietic Kit	StemCell Technologies	#5310	Referred to as hematopoietic Kit
StemPro Neural Supplement	Gibco	A1050801	Referred to as neural supplement
TGF-β1	Peprotech	100-21	50 ng/mL
Total RNA Purification Plus Kit	Norgen	#48400
TritonX-100	Sigma	T9284	0.10%
Visikol Histo-Starter Kit	Visikol	HSK-1	Contains organoid clearing solution HISTO-M, washing buffer
Zeiss LSM 510-META Confocal Microscope	Zeiss