Derivazione di un organoide cerebrale umano con sviluppo di microglia

Riepilogo

Presentiamo un protocollo per generare un organoide cerebrale umano con microglia residente incorporando cellule progenitrici ematopoietiche (HPC) derivate da cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC) nello sviluppo di organoidi.

Abstract

Le colture tridimensionali (3D) di organoidi cerebrali derivate da cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC) forniscono un importante strumento alternativo in vitro per lo studio dello sviluppo del cervello umano e della patogenesi delle malattie neurologiche. Tuttavia, la mancanza di incorporazione di microglia negli organoidi cerebrali umani è ancora un grosso ostacolo per i modelli 3D di neuroinfiammazione. Gli approcci attuali includono l'incorporazione di microglia completamente differenziate in organoidi cerebrali maturi o l'induzione della differenziazione microgliale fin dallo stadio iniziale di corpi embrioidi (EB) derivati da iPSC. Il primo approccio manca la fase in cui la differenziazione microgliale interagisce con l'ambiente neurale adiacente, mentre il successivo approccio è tecnicamente impegnativo, con conseguente incoerenza tra gli organoidi finali in termini di quantità e qualità della microglia. Per modellare gli organoidi cerebrali con la microglia per studiare le prime interazioni tra lo sviluppo microgliale e neuronale, le cellule progenitrici ematopoietiche (HPC) altamente pure differenziate dalle iPSC umane sono state incorporate nelle EB derivate da iPSC per produrre organoidi cerebrali. Utilizzando l'immunocolorazione e l'analisi del sequenziamento dell'RNA a singola cellula (sc-RNA-seq), abbiamo confermato che le HPC sono state incorporate negli organoidi 3D, che alla fine si sono sviluppati in organoidi cerebrali con microglia e neuroni. Rispetto agli organoidi cerebrali senza HPC, questo approccio produce una significativa incorporazione microgliale negli organoidi cerebrali. Questo nuovo modello 3D di organoidi, che consiste in proprietà di sviluppo sia microgliale che neurale, può essere utilizzato per studiare le prime interazioni tra lo sviluppo del sistema immunitario innato e del sistema nervoso e potenzialmente come modello per la neuroinfiammazione e i disturbi neuroinfettivi.

Introduzione

Le microglia sono cellule immunitarie residenziali nel cervello, che svolgono un ruolo critico sia nello sviluppo cerebrale che nell'omeostasi ^1,2. L'attivazione della microglia provoca la produzione di fattori proinfiammatori, fagocitosi elevata e stress ossidativo reattivo, che rimuove gli agenti patogeni invasori e le cellule compromesse. Tuttavia, l'iperattivazione o l'attivazione prolungata della microglia può, d'altra parte, causare neurodegenerazione come meccanismo di patogenesi in molti disturbi neurologici, tra cui il morbo di Parkinson ^3,4. È importante che le microglia siano incluse nei modelli pertinenti per lo studio dei disturbi neurologici umani. Negli ultimi anni, le cellule staminali umane sono state utilizzate per sviluppare organoidi 3D come modelli in vitro in alternativa ai modelli animali e agli studi su soggetti umani⁵. Idealmente, gli organoidi umani costituiscono più tipi di cellule e strutture tissutali simili ai corrispondenti organi umani, rappresentando meglio la fisiologia e la patogenesi umana rispetto ai modelli animali, ma senza le preoccupazioni etiche coinvolte direttamente negli studi sugli individui umani. Possono rappresentare il futuro della modellizzazione delle malattie umane per lo studio della patogenesi e dello sviluppo di farmaci e per la guida di terapie individualizzate⁶. Ad esempio, gli organoidi cerebrali umani 3D derivati da cellule staminali pluripotenti indotte umane (iPSC) hanno prevalso nel campo della ricerca neuroscientifica, modellando malattie infettive neurali tra cui ZIKA, SARS-CoV-2⁷ e malattie neurodegenerative tra cui la sclerosi laterale amiotrofica (SLA) e il morbo di Alzheimer ^8,9. Tuttavia, gli organoidi neurali 3D convenzionali che utilizzano l'inibizione dual-SMAD per indurre la differenziazione neuronale¹⁰ producono organoidi cerebrali privi di microglia, poiché derivano da progenitori reclutati dal sangue invece che dal lignaggio neuroectodermico da cui provengono i neuroni ^11,12. Senza la presenza di microglia, gli organoidi sono inadeguati per modellare le infezioni del SNC, l'infiammazione e la neurodegenerazione associata.

Per affrontare questo problema critico, sono stati fatti tentativi di incorporare microglia differenziate negli organoidi cerebrali¹³ o di indurre la differenziazione microgliale all'interno degli organoidi fin dall'inizio utilizzando approcci alternativi invece dell'inibizione dual-SMAD¹³. Tuttavia, incorporando microglia differenziate negli organoidi cerebrali, le prime interazioni tra lo sviluppo neuronale e microgliale vengono perse. Ciò potrebbe essere importante nello sviluppo del SNC o nella patogenesi di disturbi neuroinfettivi che mirano allo sviluppo del cervello infantile, come nell'infezione da virus ZIKA¹⁴. D'altra parte, la differenziazione della microglia innata all'interno di organoidi cerebrali derivati da iPSC senza stadi intermittenti comporta un processo prolungato e ha una maggiore variabilità all'interno dei prodotti finali¹⁵. In questo protocollo, abbiamo incorporato le cellule progenitrici ematopoietiche (HPC) derivate da iPSC nelle iPSC per creare corpi embrioidi (EB), che sono stati ulteriormente differenziati in organoidi 3D che includono sia neuroni che microglia.

Il nostro protocollo fornisce un approccio semplice che può essere adottato per studiare il sistema nervoso centrale umano coinvolgendo le prime interazioni neurone-microglia e la patogenesi delle malattie infettive neurali e della neuroinfiammazione che coinvolge l'attivazione microgliale.

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Protocollo

I campioni di sangue originali di donatori adulti sani sono stati raccolti presso la Banca del sangue di medicina trasfusionale del NIH e sono stati ottenuti moduli di consenso informato firmati in conformità con il NIH Institutional Review Board.

1. Produzione di cellule progenitrici ematopoietiche (HPC) da iPSC umane

NOTA: Le cellule iPSC umane 510 e 507 sono state utilizzate per produrre i risultati rappresentativi. I metodi di generazione e manutenzione delle iPSC possono essere trovati in una precedente pubblicazione¹⁶.

1. Giorno 0: Rivestire una piastra cellulare a 12 pozzetti aggiungendo 500 μL/pozzetto di soluzione ghiacciata di Matrigel (matrice di membrana basale [BMM]) diluita in terreno DMEM/F12 e incubarla per almeno 30 minuti a temperatura ambiente (RT).
2. Rimuovere completamente il surnatante di rivestimento e sostituirlo con 1 mL di terreno E8 Flex per pozzetto.
3. Controllare la coltura di iPSC in una piastra a 6 pozzetti al microscopio per verificare che le iPSC siano di alta qualità e senza segni di differenziazione. Scegli una colonia di medie dimensioni contrassegnandola con un pennarello sotto il fondo della piastra.
4. Rimuovere il terreno dalla coltura iPSC e aggiungere 500 μL di tampone di dissociazione iPSC dell'acido etilendiamminotetraacetico (EDTA) (0,5 mM EDTA, 0,45 g/L di NaCl in DPBS) al pozzetto.
5. Osservare al microscopio i segni di dissociazione cellulare quando tre o quattro file di cellule dai bordi della colonia iniziano a restringersi, con lo spazio vuoto che appare tra le cellule. Questo di solito richiede 1-3 minuti.
6. Eliminare completamente la soluzione di EDTA. Spostare la colonia di iPSC contrassegnata pipettando 1 mL di terreno E8 Flex con forza e direttamente su di essa. Assicurarsi che la colonia si stacchi completamente in chiazze cellulari contenenti 20-50 cellule ciascuna dopo 1-3 volte di pipettaggio.
7. Raccogliere il surnatante contenente cerotti cellulari e aggiungerlo al primo pozzetto dei pozzetti rivestiti nella piastra a 12 pozzetti.
8. Miscelare il pozzetto pipettandolo una o due volte e trasferire 1 mL di cellule nel secondo pozzetto che contiene 1 mL di terreno.
9. Ripetere il passaggio 1.8 due volte per ottenere colture di iPSC diluite in serie in un totale di quattro pozzetti.
10. Incubare la piastra in un incubatore a 37 °C con CO2 al 5%.
11. Dopo 24 ore, il giorno 1, controllare le colonie al microscopio e contare il numero di colonie passando attraverso tutti i campi in un pozzo continuamente. Scegli un pozzetto che contenga 10-20 colonie di iPSC.
12. Sostituire il terreno con 1 mL di terreno A del Kit ematopoietico. Rimettere la piastra nell'incubatrice per 48 ore.
13. Il giorno 3, rimuovere 500 μl di terreno esaurito e aggiungere 500 μl di terreno A fresco.
14. Il giorno 4, osservare al microscopio e notare una significativa crescita e differenziazione cellulare dalle colonie di iPSC. Sostituire il terreno con 1 ml di terreno B.
15. Monitorare la differenziazione cellulare al microscopio ed eseguire il cambio semi-terreno con 500 μL di terreno B a giorni alterni. Le cellule HPC-like compaiono nei giorni 6-7.
16. Il giorno 10, osservare al microscopio singole cellule rotonde luminose con la morfologia delle normali HPC che galleggiano nel terreno o debolmente attaccate al singolo strato inferiore di cellule piatte, con alcuni aggregati di cellule sciolte.
    NOTA: Le HPC differenziate sono pronte per la raccolta per la caratterizzazione o ulteriori esperimenti.
17. Raccogliere tutti gli HPC differenziati pipettandoli su e giù tre volte utilizzando un puntale per pipetta da 1 ml per rompere gli aggregati cellulari e staccare gli HPC dalla superficie della piastra.
18. Aggiungere le cellule in una provetta da 15 mL e centrifugare le cellule a 300 x g per 5 minuti. Rimuovere il surnatante e risospendere il pellet cellulare in 1 mL di terreno B.
19. Contare le cellule e regolare la concentrazione a 1 milione di cellule/mL. In questa fase, vengono generati più di 1 milione di HPC. Quando viene controllato con la citometria a flusso, assicurarsi che la purezza sia superiore all'85% delle cellule con CD34+/CD43+. Assicurarsi che non si notino cellule morte significative (più del 5%).

2. Sviluppo di corpi embrioidi da iPSCs e HPCs miste

1. Lo stesso giorno della raccolta degli HPC, assicurarsi che una coltura iPSC raggiunga anche l'80% di confluenza in un pozzetto in una piastra a 6 pozzetti (o due pozzetti in una piastra a 12 pozzetti).
2. Trattare un pozzetto della piastra di coltura a micropozzetti per la formazione di EB con 500 μl di soluzione di risciacquo antiaderente aggiungendola per ridurre al minimo le bolle.
3. Centrifugare la piastra a 2000 x g per 5 min in un rotore a secchiello oscillante dotato di portapiastre per rimuovere eventuali bolle.
4. Rimuovere completamente la soluzione di risciacquo mediante pipettaggio e lavare i pozzetti due volte con 1 mL di DPBS e poi 1 mL di DMEM/F12 senza generare bolle.
5. Dissociare le iPSC dalla piastra trattando le cellule con 1 mL di soluzione di Accutasio.
6. Osservare al microscopio fino a quando le cellule mostrano segni di separazione ma sono ancora attaccate al fondo. Questo di solito accade entro 1-3 minuti dal trattamento con Accutase. Non digerire eccessivamente le iPSC.
7. Rimuovere completamente la soluzione di Accutase senza disturbare le cellule e aggiungere 1 mL di terreno DMEM/F12 ai pozzetti. Inoltre, dissociare le cellule in singole cellule pipettando su e giù un paio di volte utilizzando un puntale da 1 ml.
8. Raccogliere le cellule in una provetta da 15 mL e riempirla fino a 5 mL con terreno DMEM/F12. Centrifugare le celle a 300 x g per 5 min.
9. Rimuovere il surnatante mediante pipettaggio e risospendere le cellule in 1 mL di terreno E8 Flex. Contare le cellule e regolare la concentrazione delle cellule a 1 milione di cellule per mL nel terreno E8 Flex.
10. Mescola iPSC con HPC in un rapporto di 2:1 aggiungendo 1 milione di iPSC (1 mL) e mezzo milione di HPC (500 μL) insieme. Aggiungere tutte le cellule miscelate nel pozzetto precedentemente trattato della piastra di coltura a micropozzetti.
11. Aggiungere 1 μL di soluzione madre Y27632 dell'inibitore di Rock (1 mM) per 1 mL di terreno nel surnatante. Agitare la piastra da un lato all'altro alcune volte per distribuire uniformemente le cellule.
12. Centrifugare la piastra di coltura per micropozzetti a 300 x g per 5 minuti in un rotore a secchio oscillante dotato di portapiastre. Osservare al microscopio per vedere se le cellule si sono depositate nei micropozzetti. (Figura supplementare 1A).
13. Senza disturbare le cellule, mettere la piastra in un incubatore cellulare a 37 °C, 5% CO₂ .
14. Il giorno 2, 48 ore dopo, osservare le cellule al microscopio per la formazione di EB. Quando gli EB sono chiaramente formati, continuare con il passaggio successivo (Figura 1B supplementare).
15. Trattare una piastra per colture cellulari a 24 pozzetti con tampone di risciacquo antiaderente (500 μl) per 15 minuti per ottenere una piastra di fissaggio bassa.
16. Rimuovere completamente il tampone di risciacquo e lavare i pozzetti due volte con 1 mL di DPBS, quindi aggiungere 1 mL di terreno E8 Flex nei pozzetti.
17. Risospendere gli EB nella piastra di coltura a micropozzetti pipettandoli per alcune volte con un puntale per pipetta con orifizio largo 1 ml.
18. Per ogni pozzetto delle piastre da 24 pozzetti trattate a bassa aderenza, raccogliere e aggiungere 100 μl di terreno contenente EB. Ciò si tradurrà in 10-20 EB per pozzo. Aggiungere il mezzo E8 Flex al vecchio pozzo contenente gli EB rimanenti come backup.
19. Incubare la piastra in un incubatore cellulare a 37 °C, 5% CO₂ per 48 ore.

3. 3D induzione, proliferazione e maturazione degli organoidi neurali

1. Il giorno 2 dopo la formazione di EB, scongelare aliquote di BMM su ghiaccio per almeno 30 minuti.
2. Utilizzare un puntale da 20 μl pre-raffreddato e aggiungere 15 μl di goccia di BMM ghiacciata saggiamente sopra il terreno per ricoprire gli EB. Questo crea una pellicola di BMM su cui gli EB si attaccheranno e su cui cresceranno.
3. Mettere la piastra in un incubatore cellulare a 37 °C, 5% CO₂ .
4. Il giorno 4, dopo la formazione di EB, rimuovere con cura 500 μl di terreno senza scartare gli EB e ripetere il rivestimento BMM seguendo il passaggio 3.2.
5. Avviare immediatamente l'induzione neurale aggiungendo 500 μl di PSC Neural Induction Medium sulla parte superiore delle cellule.
6. Nei giorni 6 e 8, eseguire il cambio del mezzo terreno rimuovendo con cura 500 μl di terreno senza toccare le cellule e aggiungendo 500 μl di terreno di induzione neurale.
7. Nei giorni 10, 12 e 14, eseguire il mezzo di cambio del terreno con cellule staminali neurali (NSC): Knockout DMEM/F12 + 1x integratore di Glutamax + 1x integratore neurale + bFGF + EGF.
8. Il giorno 15, trasferire l'intero pozzetto di sfere con terreno in una nuova piastra a 12 pozzetti trattata con soluzione di risciacquo antiaderente come descritto in precedenza. Aggiungere 500 μl di terreno di maturazione neuronale (DMEM/F12 + 1x integratore di N2 + 1x integratore di B27 + 1x antibiotici-antimicotici) sopra la coltura.
9. Eseguire il cambio semi-medio con il mezzo di maturazione neuronale a giorni alterni.
10. Durante la fase di maturazione, se ci sono segni di esaurimento della nutrizione, come il cambiamento di colore del terreno, spostare l'organoide su piastre a 6 pozzetti, che contengono fino a 3 ml di terreno per pozzetto.
11. Opzionalmente, 17 giorni dopo la formazione di EB, integrare il terreno di maturazione con citochine (IL-34, M-CSF, TGF-β1, CD200, CX3CL1) per 6 giorni per facilitare la maturazione microgliale.
12. Il giorno 23, raccogli gli organoidi neurali risultanti per la caratterizzazione o ulteriori esperimenti.

4. Clearance e immunocolorazione di organoidi neurali 3D

1. Fissare fino a 10 organoidi mediante immersione in 1 mL di paraformaldeide (PFA) al 4% a 4 °C per 24 ore.
2. Trasferire gli organoidi per pozzetto in una piastra inferiore trasparente a 96 pozzetti e lavare con 200 μl di DPBS 2 volte per 1 ora ogni volta agitando delicatamente.
3. Permeabilizzare gli organoidi lavandoli una volta in metanolo al 50% in DPBS, metanolo all'80% in acqua a doppia distillazione (dd) e metanolo secco al 100% per 10 minuti ciascuno, a 4 °C agitando delicatamente.
4. Lavare gli organoidi in serie in 20% DMSO/metanolo, 80% metanolo in dd acqua, 50% metanolo in DPBS, in 100% DPBS, quindi in DPBS con Triton X-100 allo 0,2%, per 10 minuti ciascuno a 4 °C agitando delicatamente. Sforzarsi di rimuovere completamente il tampone residuo dopo ogni lavaggio.
5. Incubare in tampone permeabilizzante (DPBS con Triton X100 allo 0,2%, glicina 0,3 M e DMSO al 20%) agitando delicatamente per 40 minuti a RT.
6. Bloccare nel tampone bloccante (DPBS con 0,2% Triton X100, 6% siero di capra e 10% DMSO) per 1 ora a 37 °C agitando delicatamente su uno shaker a 80 giri/min.
7. Incubare con anticorpi in tampone di diluizione anticorpale (IBA1 1:100, TREM2 1:100, βIII-tubulina, 1:1000, 100 μL/pozzetto in DPBS con 0,2% Tween 20, 100 μg/mL di eparina, 3% di siero di capra e 5% DMSO) a 37 °C per 2 ore o in cella frigorifera con agitazione delicata a 80 giri/min per 3 giorni.
8. Lavare con DPBS con 0,2% Tween 20, 100 μg/mL di eparina 5 volte, 10 min ciascuna a RT con agitazione delicata su uno shaker a 80 giri/min.
9. Incubare con anticorpo secondario (1:200 capra anti-topo Alexa488) a 37 °C per 1 ora seguito da RT per una notte con agitazione delicata su un agitatore a 80 giri/min.
10. Per la colorazione con mezzo di contrasto nucleare, eseguire la colorazione DAPI insieme all'incubazione degli anticorpi o in un tampone di lavaggio.
11. Lavare gli organoidi 10 volte in tampone di lavaggio, 10 minuti ogni volta a 37 °C, agitando delicatamente.
12. Osservare al microscopio. Se lo sfondo è ancora alto, continua a lavarlo 5 volte.
13. Scartare il surnatante il più possibile. Aggiungere 200 μL di soluzione per la chiarificazione degli organoidi e incubare per 5 minuti prima dell'osservazione e scattare immagini utilizzando un microscopio confocale.

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Risultati

Il nostro protocollo segue uno schema per differenziare le HPC dalle iPSC e quindi mescolare le HPC con le iPSC per produrre EB, seguite dall'induzione, differenziazione e maturazione neurale (Figura 1). L'alta qualità della differenziazione HPC è fondamentale per il successo della formazione di EB e della successiva differenziazione degli organoidi. Viene utilizzata una tecnica di coltura di diluizione seriale per produrre...

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Discussione

Qui viene presentato un protocollo dettagliato per la realizzazione di organoidi neurali 3D contenenti microglia innate da EB derivati da iPSC miste e HPC differenziate da iPSC. Si tratta di un approccio relativamente breve e semplice che coinvolge solo le tecniche e le attrezzature di coltura cellulare generalmente disponibili nella maggior parte dei laboratori.

Il fattore più critico per il successo di questo protocollo è la qualità della differenziazione...

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Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
12 well cell culture plates	Corning	#3512
24 well cell culture plate	SARSTEDT	#83.3922
Accutase	Thermo	A1110501
Aggrewell 400 plate	Stemcell technologies	#34411	Referred to as microwell culture plate
Alexa Fluor 488 goat anti-mouse antibody	Life techniologies	A11001	1:400 dilution
Alexa Fluor 594 goat anti-rabbit antibody	Life techniologies	A11012	1:400 dilution
Allegra X-30R Centrifuge with rotor S6069	Beckman Couler
Anti- Adherence  Rinsing solution	Stem Cell Technologies	#07010
anti-CD34 antibody	Stem Cell Technologies	#60013	1:100 dilution
anti-Human CD43 antibody	Stem Cell Technologies	#60085	1:100 dilution
anti-IBA1 rabbbit antibody	Fujifilm	019-19741	2.5 µg/mL
anti-TREM2  rat pAb	RD Systems	mab17291	2.5 µg/mL
Antibiotic-antimycotic	Gibco	15240-062	1x
B27 supplement	Life technologies	17504-044	1x
bFGF	Peprotech	100-18B	20 ng/mL
CD200	Novoprotein	C311	100 ng/mL
CryoTube vials	Thermo	#368632
CX3CL1	Peprotech	300-31	100 ng/mL
DAPI	Sigma	D9542	1 µg/mL
DMEM/F12	Life technologies	12400-024	1x
DMSO	Sigma	D2650
DPBS	Gibco	#4190136	1x
E8 Flex medium kit	Thermo	A2858501
EDTA	Mediatech	46-034-Cl	0.5 mM
EGF	Peprotech	AF-100-15	20 ng/mL
EVOS FL Auto Microscope	Thermo		Fluorescence microscope
FastStart Universal SYBR Green PCR master mix	Roche	#4913850001
Glutamax	Gibco	#35050079
Goat serum	Sigma	G9023	4%
IL-34	Peprotech	200-34	100 ng/mL
ImageXpress Micro Confocal	Molecular Devices
Knockout DMEM/F12	Gibco	#10829018
M-CSF	Peprotech	300-25	25 ng/mL
Matrigel	Corning	#354277	Basement membrane matrix (BMM)
Mouse anti-βIII-tubulin antibody	Promega	G712A	1:1000 dilution
Mr. Frosty container	Thermo	5100-0001
N2 supplement	Life technologies	17502-048	1x
Paraformadehyde	Sigma	P6148	4%
PSC Neural Induction Medium	Gibco	A1647801
Rock inhibitor Y27632	Stemcell technologies	#72304	1 mM stock
RT LTS 1000 ul pipette tips	RAININ	#30389218	for transferring organoids
STEMdiff Cerebral Organoid Kit	Stem Cell Technologies	#08570
STEMdiff Hematopoietic Kit	StemCell Technologies	#5310	Referred to as hematopoietic Kit
StemPro Neural Supplement	Gibco	A1050801	Referred to as neural supplement
TGF-β1	Peprotech	100-21	50 ng/mL
Total RNA Purification Plus Kit	Norgen	#48400
TritonX-100	Sigma	T9284	0.10%
Visikol Histo-Starter Kit	Visikol	HSK-1	Contains organoid clearing solution HISTO-M, washing buffer
Zeiss LSM 510-META Confocal Microscope	Zeiss