小胶质细胞发育的人脑类器官的衍生

摘要

我们提出了一种方案，通过将诱导多能干细胞 （iPSC） 衍生的造血祖细胞 （HPC） 整合到类器官发育中来生成具有驻留小胶质细胞的人脑类器官。

摘要

源自诱导多能干细胞 （iPSC） 的三维 （3D） 脑类器官培养物为研究人脑发育和神经系统疾病的发病机制提供了一种 重要的体外替代 工具。然而，人脑类器官中缺乏小胶质细胞的掺入仍然是神经炎症 3D 模型的主要障碍。目前的方法包括将完全分化的小胶质细胞掺入成熟的脑类器官中，或从 iPSC 衍生的拟胚体 （EB） 的早期阶段诱导小胶质细胞分化。第一种方法错过了小胶质细胞分化与相邻神经环境相互作用的阶段，而后一种方法在技术上具有挑战性，导致最终类器官在小胶质细胞的数量和质量方面不一致。为了模拟具有小胶质细胞的脑类器官以研究小胶质细胞和神经元发育之间的早期相互作用，将从人类 iPSC 分化的高纯度造血祖细胞 （HPC） 掺入 iPSC 衍生的 EB 中以制造脑类器官。使用免疫染色和单细胞 RNA 测序 （sc-RNA-seq） 分析，我们证实 HPC 被整合到 3D 类器官中，最终发育成具有小胶质细胞和神经元的脑类器官。与没有 HPC 的脑类器官相比，这种方法在脑类器官中产生显着的小胶质细胞掺入。这种新颖的 3D 类器官模型由小胶质细胞和神经发育特性组成，可用于研究先天免疫和神经系统发育之间的早期相互作用，并有可能作为神经炎症和神经感染性疾病的模型。

引言

小胶质细胞是大脑中的寄宿免疫细胞，在大脑发育和体内平衡中起关键作用 ^1,2。小胶质细胞的激活导致促炎因子的产生、吞噬作用升高和反应性氧化应激，从而清除入侵的病原体和受损细胞。然而，另一方面，小胶质细胞的过度激活或长期激活可能导致神经退行性变，这是许多神经系统疾病（包括帕金森病）的发病机制 ^3,4。将小胶质细胞包含在研究人类神经系统疾病的相关模型中非常重要。近年来，人类干细胞已被用于开发 3D 类器官作为体外模型，作为动物模型和人类受试者研究的替代方案⁵。理想情况下，人类类器官由多种细胞类型和组织结构组成，类似于相应的人体器官，比动物模型更能代表人类生理学和发病机制，但没有直接研究人类个体所涉及的伦理问题。它们可能代表人类疾病建模的未来，用于发病机制和药物开发的研究以及个体化治疗的指导⁶。例如，源自人类诱导多能干细胞 （iPSC） 的 3D 人脑类器官在神经科学研究领域占主导地位，对神经传染病（包括 ZIKA、SARS-CoV-2⁷）和神经退行性疾病（包括肌萎缩侧索硬化症 （ALS） 和阿尔茨海默病）进行建模 ^8,9。然而，使用双重 SMAD 抑制诱导神经元分化¹⁰ 的常规 3D 神经类器官会产生缺乏小胶质细胞的脑类器官，因为它们来自从血液中募集的祖细胞，而不是神经元来自神经外胚层谱系^11,12。如果没有小胶质细胞的存在，类器官不足以模拟 CNS 感染、炎症和相关的神经退行性变。

为了解决这一关键问题，已经尝试将分化的小胶质细胞整合到大脑类器官中¹³ 或从一开始就使用替代方法而不是双重 SMAD 抑制在类器官内诱导小胶质细胞分化¹³。然而，通过将分化的小胶质细胞整合到大脑类器官中，神经元和小胶质细胞发育之间的早期相互作用被错过了。这在 CNS 发育或针对婴儿大脑发育的神经感染性疾病的发病机制中可能很重要，例如寨卡病毒感染¹⁴。另一方面，在没有间歇阶段的情况下，在 iPSC 衍生的脑类器官中区分先天性小胶质细胞涉及一个漫长的过程，并且在最终产物中具有更高的可变性¹⁵。在这个报道的方案中，我们将 iPSC 衍生的造血祖细胞 （HPC） 掺入 iPSC 中以制造拟胚体 （EB），其进一步分化为包括神经元和小胶质细胞在内的 3D 类器官。

我们的方案提供了一种简单的方法，可用于研究涉及早期神经元-小胶质细胞相互作用的人类中枢神经系统以及涉及小胶质细胞激活的神经感染性疾病和神经炎症的发病机制。

研究方案

在 NIH 的输血医学血库收集健康成年捐献者的原始血样，并根据 NIH 机构审查委员会获得签署的知情同意书。

1. 从人 iPSC 产生造血祖细胞 （HPC）

注：人 iPSC 细胞 510 和 507 用于产生代表性结果。iPSC 的产生和维持方法可在以前的出版物中找到¹⁶。

1. 第 0 天：加入 500 μL/孔在 DMEM/F12 培养基中稀释的冰冷基质胶（基底膜基质 [BMM]）溶液，包被 12 孔细胞板，并在室温 （RT） 下孵育至少 30 分钟。
2. 完全去除涂层上清液，并用每孔 1 mL 的 E8 Flex 培养基替换。
3. 在显微镜下检查 6 孔板中的 iPSC 培养物，以确认 iPSC 质量高且无分化迹象。通过在板底部下方用记号笔标记来选择一个中等大小的菌落。
4. 从 iPSC 培养物中取出培养基，并向孔中加入 500 μL 乙二胺四乙酸 （EDTA） iPSC 解离缓冲液（0.5 mM EDTA，0.45 g/L NaCl 的 DPBS 溶液）。
5. 当来自集落边缘的 3 到 4 行细胞开始收缩，细胞之间出现空隙时，在显微镜下观察细胞解离的迹象。这通常需要 1-3 分钟。
6. 完全丢弃 EDTA 溶液。将 1 mL E8 Flex 培养基用力直接移液到标记的 iPSC 集落上，以去除标记的 iPSC 集落。确保菌落在移液 1-3 次后完全分离成含有 20-50 个细胞的细胞斑块。
7. 收集含有细胞贴剂的上清液，并将其添加到 12 孔板中包被孔的第一个孔中。
8. 通过移液 1 或 2 次混合孔，然后将 1 mL 细胞转移到含有 1 mL 培养基的第二个孔中。
9. 重复步骤 1.8 两次，在总共四个孔中制备连续稀释的 iPSC 培养物。
10. 将板在 37 °C、5% CO2 培养箱中孵育。
11. 24 小时后，在第 1 天，在显微镜下检查菌落，并通过连续穿过井中的所有田来计算菌落的数量。选择一个包含 10-20 个 iPSC 集落的孔。
12. 用造血试剂盒中的 1 mL 培养基 A 替换培养基。将板放回培养箱中 48 小时。
13. 第 3 天，去除 500 μL 用过的培养基，并加入 500 μL 新鲜培养基 A。
14. 第 4 天，在显微镜下观察，注意到 iPSC 集落的显着细胞生长和分化。用 1 mL 培养基 B 替换培养基。
15. 在显微镜下监测细胞分化，并每隔一天用 500 μL 培养基 B 更换一半培养基。HPC 样细胞出现在第 6-7 天。
16. 第 10 天，在显微镜下观察明亮的单圆形细胞，其形态与正常 HPCs 的形态漂浮在培养基中或松散地附着在扁平细胞的单底层上，带有一些松散的细胞聚集体。
    注：差异化的 HPC 已准备好用于表征或进一步实验。
17. 通过使用 1 mL 移液器吸头上下吹打 3 次来收集所有分化的 HPC，以打破细胞聚集体并将 HPC 从板表面分离。
18. 将细胞加入 15 mL 试管中，并以 300 x g 离心细胞 5 分钟。去除上清液，将细胞沉淀重悬于 1 mL 培养基 B 中。
19. 对细胞进行计数，并将浓度调节至 100 万个细胞/mL。在这个阶段，生成了超过 100 万个 HPC。使用流式细胞术检查时，确保 CD34+/CD43+ 细胞的纯度超过 85%。确保没有发现明显的死细胞（超过 5%）。

2. 从混合的 iPSC 和 HPC 发育胚状体

1. 在收集 HPC 的同一天，确保 iPSC 培养物在 6 孔板中的一个孔（或 12 孔板中的两个孔）中也达到 80% 汇合。
2. 用 500 μL 抗粘附冲洗溶液处理微孔培养板的一个孔以形成 EB，以尽量减少气泡。
3. 在装有板支架的摆动桶转子中以 2000 x g 的速度旋转板 5 分钟，以去除可能的气泡。
4. 通过移液完全去除冲洗溶液，然后用 1 mL DPBS 和 1 mL DMEM/F12 洗涤孔两次，而不会产生气泡。
5. 通过用 1 mL Accutase 溶液处理细胞，将 iPSC 从板中解离。
6. 在显微镜下观察，直到细胞出现分离迹象但仍附着在底部。这通常发生在 Accutase 治疗后 1-3 分钟内。不要过度消化 iPSC。
7. 在不干扰细胞的情况下完全去除 Accutase 溶液，并向孔中加入 1 mL DMEM/F12 培养基。此外，使用 1 mL 吸头上下吹打几次，将细胞解离成单个细胞。
8. 将细胞收集到 15 mL 试管中，并用 DMEM/F12 培养基填充至 5 mL。将细胞以 300 x g 旋转 5 分钟。
9. 通过移液去除上清液，并将细胞重悬于 1 mL E8 Flex 培养基中。对细胞进行计数，并在 E8 Flex 培养基中将细胞浓度调节至 100 万个细胞/mL。
10. 通过同时添加 100 万个 iPSC （1 mL） 和五十万个 HPC （500 μL），以 2：1 的比例混合 iPSC 和 HPC。将所有混合细胞添加到微孔培养板的先前处理的孔中。
11. 将每 1 mL 培养基中加入 1 μL Rock 抑制剂 Y27632 储备溶液 （1 mM） 到上清液中。左右摇动板几次，使细胞均匀分布。
12. 在装有板架的摆动桶转子中以 300 x g 旋转微孔培养板 5 分钟。在显微镜下观察，看细胞是否已经沉降到微孔中。（补充图 1A）。
13. 在不干扰细胞的情况下，将板放入 37 °C、5% CO₂ 细胞培养箱中。
14. 第 2 天，48 小时后，在显微镜下观察细胞是否形成 EB。当 EB 清晰形成后，继续下一步（补充图 1B）。
15. 用抗粘附冲洗缓冲液 （500 μL） 处理 24 孔细胞培养板 15 分钟，以制成低附着板。
16. 完全去除冲洗缓冲液，用 1 mL DPBS 洗涤孔两次，然后向孔中加入 1 mL E8 Flex 培养基。
17. 用 1 mL 宽口移液器吸头移液几次，将 EB 重悬于微孔培养板中。
18. 对于低粘附处理的 24 孔板的每个孔，收集并添加 100 μL 含有 EB 的培养基。这将导致每孔 10-20 个 EB。将 E8 Flex 培养基添加到包含剩余 EB 作为备份的旧孔中。
19. 将板在 37 °C、5% CO₂ 细胞培养箱中孵育 48 小时。

3. 3D 神经类器官诱导、增殖和成熟

1. 在 EB 形成后的第 2 天，在冰上解冻 BMM 等分试样至少 30 分钟。
2. 使用预冷的 20 μL 吸头，并在培养基上明智地加入 15 μL 冰冷的 BMM 滴剂以包被 EB。这会形成一层 BMM 薄膜，EB 将附着并生长在上面。
3. 将板放入 37 °C、5% CO₂ 细胞培养箱中。
4. 第 4 天，在 EB 形成后，小心去除 500 μL 培养基，不要丢弃 EB，并按照步骤 3.2 重复 BMM 涂层。
5. 通过在细胞顶部添加 500 μL PSC 神经诱导培养基立即开始神经诱导。
6. 在第 6 天和第 8 天，通过小心去除 500 μL 培养基而不接触细胞并添加 500 μL 神经诱导培养基来进行半培养基更换。
7. 在第 10 天、第 12 天和第 14 天，用神经干细胞 （NSC） 培养基进行半培养基更换：敲除 DMEM/F12 + 1x Glutamax 补充剂 + 1x 神经补充剂 + bFGF + EGF。
8. 第 15 天，将含有培养基的整个球体孔转移到新的12孔板中，如前所述，用防粘附冲洗溶液处理。在培养物上加入 500 μL 神经元成熟培养基（DMEM/F12 + 1x N2 补充剂 + 1x B27 补充剂 + 1x 抗生素-抗真菌剂）。
9. 每隔一天用神经元成熟培养基进行半培养基更换。
10. 在成熟阶段，如果有营养耗尽的迹象，例如培养基的颜色变化，请将类器官移至 6 孔板中，每孔最多可容纳 3 mL 培养基。
11. 或者，在 EB 形成后 17 天，在成熟培养基中补充细胞因子（IL-34、M-CSF、TGF-β1、CD200、CX3CL1）6 天，以促进小胶质细胞成熟。
12. 在第 23 天，收集所得神经类器官用于表征或进一步实验。

4. 3D 神经类器官的清除和免疫染色

1. 通过在 4 °C 下浸入 1 mL 的 4% 多聚甲醛 （PFA） 中 24 小时，固定多达 10 个类器官。
2. 将每孔的类器官转移到 96 孔透明底板中，用 200 μL DPBS 洗涤 2 次，每次轻轻摇动 1 小时。
3. 通过在 50% 甲醇的 DPBS 溶液中洗涤一次，在 80% 甲醇的双蒸 （dd） 水中洗涤一次，并在 4 °C 下轻轻摇动，分别洗涤 10 分钟，使类器官透化。
4. 在 20% DMSO/甲醇、80% 甲醇的 dd 水溶液、50% 甲醇的 DPBS 溶液、100% DPBS 中连续洗涤类器官，然后在含有 0.2% Triton X-100 的 DPBS 中连续洗涤类器官，每次在 4 °C 下轻轻摇动。每次洗涤后努力完全去除残留的缓冲液。
5. 在透化缓冲液（含 0.2% Triton X100、0.3 M 甘氨酸和 20% DMSO 的 DPBS）中孵育，在 RT 下轻轻摇动 40 分钟。
6. 在 37 °C 下封闭缓冲液（含 0.2% Triton X100、6% 山羊血清和 10% DMSO 的 DPBS）中封闭 1 小时，同时在振荡器上以 80 rpm 轻轻摇动。
7. 在抗体稀释缓冲液（IBA1 1：100、TREM2 1：100、βIII-微管蛋白、1：1000、100 μL/孔的 DPBS 中，含 0.2% 吐温 20、100 μg/mL 肝素、3% 山羊血清和 5% DMSO）中与抗体一起在 37 °C 下孵育 2 小时，或在冷藏室中以 80 rpm 轻轻摇动孵育 3 天。
8. 用含 0.2% 吐温 20、100 μg/mL 肝素的 DPBS 洗涤 5 次，每次 10 分钟，在 RT 下在摇床上以 80 rpm 的速度轻轻摇动。
9. 与 2 抗（1：200 山羊抗小鼠 Alexa488）在 37 °C 下孵育 1 小时，然后在摇床上以 80 rpm 的速度轻轻摇动 RT 过夜。
10. 对于核对比染色，在抗体孵育的同时或在洗涤缓冲液中进行 DAPI 染色。
11. 在洗涤缓冲液中洗涤类器官 10 次，每次在 37 °C 下洗涤 10 分钟，轻轻摇动。
12. 在显微镜下观察。如果背景仍然很高，请继续洗涤 5 次。
13. 尽可能丢弃上清液。加入 200 μL 类器官透明化溶液，孵育 5 分钟后观察，并使用共聚焦显微镜拍摄图像。

结果

我们的方案遵循一种方案，将 HPC 与 iPSC 区分开来，然后将 HPC 与 iPSC 混合以制造 EB，然后进行神经诱导、分化和成熟（图 1）。高质量的 HPC 分化对于 EB 形成和随后的类器官分化的成功至关重要。使用连续稀释培养技术产生适当数量和大小的 iPSC 集落以开始 HPC 分化（图 2A）。正常情况下，iPSC 集落在?...

讨论

在这里，提出了一种详细的方案，用于制造含有来自混合 iPSC 和 iPSC 分化 HPC 的 EB 的先天性小胶质细胞的 3D 神经类器官。这是一种相对较短且简单的方法，仅涉及大多数实验室中通常可用的细胞培养技术和设备。

该协议成功的最关键因素是 HPC 差异化的质量。我们采用了已发表的方法¹⁷ ，使用商业试剂盒将 HPC 与 iPSC 区分开来，并?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
12 well cell culture plates	Corning	#3512
24 well cell culture plate	SARSTEDT	#83.3922
Accutase	Thermo	A1110501
Aggrewell 400 plate	Stemcell technologies	#34411	Referred to as microwell culture plate
Alexa Fluor 488 goat anti-mouse antibody	Life techniologies	A11001	1:400 dilution
Alexa Fluor 594 goat anti-rabbit antibody	Life techniologies	A11012	1:400 dilution
Allegra X-30R Centrifuge with rotor S6069	Beckman Couler
Anti- Adherence  Rinsing solution	Stem Cell Technologies	#07010
anti-CD34 antibody	Stem Cell Technologies	#60013	1:100 dilution
anti-Human CD43 antibody	Stem Cell Technologies	#60085	1:100 dilution
anti-IBA1 rabbbit antibody	Fujifilm	019-19741	2.5 µg/mL
anti-TREM2  rat pAb	RD Systems	mab17291	2.5 µg/mL
Antibiotic-antimycotic	Gibco	15240-062	1x
B27 supplement	Life technologies	17504-044	1x
bFGF	Peprotech	100-18B	20 ng/mL
CD200	Novoprotein	C311	100 ng/mL
CryoTube vials	Thermo	#368632
CX3CL1	Peprotech	300-31	100 ng/mL
DAPI	Sigma	D9542	1 µg/mL
DMEM/F12	Life technologies	12400-024	1x
DMSO	Sigma	D2650
DPBS	Gibco	#4190136	1x
E8 Flex medium kit	Thermo	A2858501
EDTA	Mediatech	46-034-Cl	0.5 mM
EGF	Peprotech	AF-100-15	20 ng/mL
EVOS FL Auto Microscope	Thermo		Fluorescence microscope
FastStart Universal SYBR Green PCR master mix	Roche	#4913850001
Glutamax	Gibco	#35050079
Goat serum	Sigma	G9023	4%
IL-34	Peprotech	200-34	100 ng/mL
ImageXpress Micro Confocal	Molecular Devices
Knockout DMEM/F12	Gibco	#10829018
M-CSF	Peprotech	300-25	25 ng/mL
Matrigel	Corning	#354277	Basement membrane matrix (BMM)
Mouse anti-βIII-tubulin antibody	Promega	G712A	1:1000 dilution
Mr. Frosty container	Thermo	5100-0001
N2 supplement	Life technologies	17502-048	1x
Paraformadehyde	Sigma	P6148	4%
PSC Neural Induction Medium	Gibco	A1647801
Rock inhibitor Y27632	Stemcell technologies	#72304	1 mM stock
RT LTS 1000 ul pipette tips	RAININ	#30389218	for transferring organoids
STEMdiff Cerebral Organoid Kit	Stem Cell Technologies	#08570
STEMdiff Hematopoietic Kit	StemCell Technologies	#5310	Referred to as hematopoietic Kit
StemPro Neural Supplement	Gibco	A1050801	Referred to as neural supplement
TGF-β1	Peprotech	100-21	50 ng/mL
Total RNA Purification Plus Kit	Norgen	#48400
TritonX-100	Sigma	T9284	0.10%
Visikol Histo-Starter Kit	Visikol	HSK-1	Contains organoid clearing solution HISTO-M, washing buffer
Zeiss LSM 510-META Confocal Microscope	Zeiss