JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

يحدد هذا البروتوكول إجراء مفصلا لتوليد الخلايا التائية لمستقبلات المستضد الخيمري العابرة (CAR) باستخدام mRNA غير المتكامل للعلاج المناعي للسرطان ويوفر طرقا موثوقة لتقييم خلايا مستقبلات المستضد الخيمري (CAR-T وظيفتها السامة للخلايا).

Abstract

برز العلاج بالخلايا التائية لمستقبلات المستضد الخيمري (CAR) كعلاج رائد للسرطان ، حيث حقق نجاحا غير مسبوق في علاج بعض الأورام الخبيثة الدموية مثل الأورام اللمفاوية وسرطان الدم. ومع ذلك ، مع تلقي المزيد من مرضى السرطان علاجات الخلايا التائية ذات مستقبلات المستضدات الخيمرية ، يتم الإبلاغ بشكل متزايد عن الأورام الخبيثة الأولية الثانوية المرتبطة بالعلاج جزئيا بسبب إدخال الجينات المعدلة والمستمرة غير المتوقعة لمستقبلات المستضدات المستضدة المستضدة المستضدة ، مما يثير مخاوف خطيرة تتعلق بالسلامة. لمعالجة هذه المشكلة ، نصف هنا نهجا غير فيروسي وغير متكامل لتوليد خلايا CAR-T عابرة باستخدام mRNA. قمنا بالكهرباء للخلايا التائية باستخدام mRNA معدل لتشفير مستقبلات عامل نمو البشرة البشري 2 (HER2) الخاصة ب CAR وأنتجنا خلايا CAR-T عابرة مستهدفة HER2. تم التعبير عن CAR بكفاءة على سطح الخلية التائية بعد يوم واحد من التثقيب الكهربائي ، وزاد باليوم 2 ، وانخفض بشكل كبير بحلول اليوم الخامس. أظهرت خلايا CAR-T العابرة سمية خلوية قوية ضد خلايا سرطان المبيض SKOV-3 الإيجابية HER2 وأفرزت مستويات عالية من IFN-Υ. يوفر هذا البروتوكول دليلا تفصيليا لتطوير خلايا CAR-T عابرة صغيرة الحجم دون تكامل دائم للجينات المعدلة وراثيا ل CAR ، ويصف الإجراءات التفصيلية لإعداد CAR mRNA ، وتنشيط الخلايا التائية وتعداء الخلايا التائية ، وتقييم تعبير CAR ، والتحليل المختبري لوظيفة الخلايا التائية CAR. هذه الطريقة مناسبة لتوليد الخلايا التائية المستضدة المستضدة المستضدة المستضدة في كل من الدراسات قبل السريرية والسريرية.

Introduction

يعد السرطان تهديدا متزايد الأهمية لصحة الإنسان ، حيث يقدر عدد الحالات المشخصة حديثا سنويا ب 23.6 مليون حالة وفاة على مستوى العالم1. يظل العلاج الجراحي جنبا إلى جنب مع الإشعاع والعلاج الكيميائي هو المعيار الذهبي للرعاية لأنواع مختلفة من السرطانات الموضعية غير الغازية والغازية2،3،4. على الرغم من أن العلاج المنهجي التقليدي قد حقق نجاحا هائلا في إدارة السرطانات في مراحله المبكرة ، إلا أنه شديد السمية وله تأثير محدود على السرطانات النقيليةوالدموية 5. يخضع المرضى المصابون بهذه السرطانات لعلاجات متكررة ويتحملون سمية كبيرة على أمل استقرار وتأخير تطور المرض. ظهر العلاج بالخلايا التائية لمستقبلات المستضد الخيمري (CAR) مؤخرا كعلاج ثوري موجه يوضح فعالية قوية لسرطانات الدم في الخلايا البائية ويوفر الأمل لهؤلاءالمرضى اليائسين.

خلايا CAR-T عبارة عن خلايا ليمفاوية تائية مصممة هندسيا تعبر عن CAR على سطح الخلية يتعرف على وجه التحديد على المستضدات المرتبطة بالورم (TAAs) وينشط الخلايا دون الحاجة إلى عرض مستضد من البروتينات المعقدة الرئيسية ذات التوافق النسيجي (MHCs) 7. عند التنشيط ، تفرز خلايا CAR-T لوحة من السيتوكينات والخلايا السرطانية بشكل مستقل عن معقد التوافق النسيجي الكبير ، وبالتالي تعزيز تدمير الأورام حتى عندما يتم تقليل تنظيم معقد التوافق النسيجي الكبير أو فقدانه بسبب البيئة المكروية للورم المثبطللمناعة 8،9. تتكون CARs من ثلاثة مجالات متميزة على الأقل - متغير شظية أحادية السلسلة خارج الخلية (scFv) يحتوي على المناطق المتغيرة التي تتعرف على المستضد لجسم مضاد خاص ب TAA ، ومجال عبر الغشاء يثبت CAR على سطح الخلية ، ومجال داخل الخلايا الذي يتوسط في تجنيد بروتين المحول والإشارات النهائية10. بناء على الاختلافات في المجالات داخل الخلايا ، تطورت هياكل CAR عبر خمسة أجيال حتى الآن ، حيث يحتوي الجيل الأول فقط على مجال تنشيط CD3ζ والأجيال اللاحقة تمتلك واحدا أو أكثر من مجالات التكلفة الإضافية من جزيئات مثل 4-1BB و CD2811. تؤثر هذه المجالات داخل الخلايا على آليات إشارات الخلايا التائية ذات مستقبلات المستضدات المستضدة ، والانتشار ، والبقاء على قيد الحياة ، والسمية ، والتي تحدد معا الفعالية السريرية المضادة للأورام. يأتي النجاح السريري للعلاج بالخلايا التائية ذات مستقبلات المستضدات الخيمرية من الجيل الثاني من خلايا CAR-T التي تستهدف على وجه التحديد CD19 ، وهو مؤشر حيوي يتم التعبير عنه بشكل كبير في خلايا النسب B ، لعلاج ابيضاض الدم في الخلايا البائية والأورام اللمفاوية12،13. حتى الآن ، وافقت إدارة الغذاء والدواء الأمريكية (FDA) على ستة علاجات من الجيل الثاني للخلايا التائية ذات مستقبلات مستقبلات معينة تستهدف إما CD-19 أو مستضد نضج الخلايا البائية (BCMA) للأورام الخبيثة الدموية الانتكاسية أو المقاومة للعلاج ، بما في ذلك سرطان الغدد الليمفاوية للخلايا البائية الكبيرة ، وسرطان الغدد الليمفاوية لخلايا الوشاح ، والورم النقوي المتعدد 6. تخضع الأجيال الجديدة من خلايا CAR-T حاليا لدراسات مكثفة قبل السريرية والسريرية14،15.

يعد الإنتاج السريري لخلايا CAR-T عملية معقدة ومكلفة وتستغرق وقتا طويلا. حاليا ، تأتي الكريات البيض المستخدمة في تحضير الخلايا التائية ذات مستقبلات المستضدات المستضدة من المرضى أنفسهم لتجنب التفاعلات الخيفية ، على الرغم من أن خلايا CAR-T العالمية المشتقة من المتبرع (أو الجاهزة) تخضع للتطوير النشط والتقييم السريري16. بعد عزل الكريات البيض عن الدم المحيطي للمريض عن طريق فصادة البيضاء، يتم إدخال جزء جيني غريب يشفر CAR في الخلايا التائية المنشطة باستخدام نهج فيروسية أو غير فيروسى17،18،19. الفيروسات القهقرية والفيروسات العدسية هي أكثر النواقل الفيروسية شيوعا لتوصيل جين CAR ، مما يؤدي إلى التكامل العشوائي والدائم للحمض النووي المشفر ل CAR في جينوم الخليةالتائية 20. الأساليب غير الفيروسية ، بما في ذلك الجسيمات النانوية الدهنية mRNA ، وأنظمة الينقولات ، وتحرير الجينوم CRISPR / Cas9 ، أقل شيوعا21. بعد ذلك ، يتم توسيع الخلايا التائية التي تعبر عن CAR خارج الجسم الحي على نطاق واسع ثم يتم جمعها وإعادة ضخها مرة أخرى في المرضى22،23. يعد تصنيع النواقل الفيروسية التي تفي بمعايير ممارسات التصنيع الجيدة الصارمة (GMP) أمرا صعبا للغاية ومعقدا ومكلفا ، مما يضع عبئا كبيرا على المصنعين والوكالات التنظيمية والمرضى ، مما يحد من تطبيقها السريري على نطاق واسع.

على الرغم من النجاح المثير للعلاج ب CAR-T ، إلا أن هناك قلقا متزايدا بشأن سلامته. نظرا للطبيعة العشوائية لتكامل الجينات المعدلة والمستحولة CAR في جينوم الخلايا التائية أثناء نقل الفيروس أو الينقولات ، قد يحدث اضطراب في الجينات المثبطة للورم أو تنشيط الجينات المسرطنة ، مما يؤدي إلى تحول خبيث للخلايا التائية24،25. منذ موافقة إدارة الغذاء والدواء الأمريكية على أول منتج للعلاج بالخلايا التائية ذات مستقبلات المستضدات الخيمرية في عام 2017 ، تظهر دراسات المتابعة أن ما يصل إلى 15٪ من المرضى الذين يتلقون العلاج يصابون بأورام خبيثة أولية ثانوية (SPMs) مثل سرطان الغدد الليمفاوية للخلايا التائية (TCL) وسرطان الرئة ذو الخلايا غير الصغيرة (NSCLC) وسرطان الجلد26،27،28،29. ومن اللافت للنظر أن الجينات المعدلة وراثيا لمستقبلات مستقبلات الكربون (CAR) تم اكتشافها بشكل كبير في بعض ملخصات SPM30،31 ، وكانت بعض حالات TCL ناتجة بشكل مباشر عن التوسع غير الطبيعي لخلايا CAR-T24،32،33 ، مما يشير إلى دور مباشر لمنتجات CAR-T في إحداث بعض SPMs. حددت دراسات أخرى أيضا إدخالات الجينات المعدلة والمستعملة في الجينات الحرجة مثل TET234 و JAK135 و PBX236 في الخلايا السرطانية SPM. في ضوء الأدلة المتراكمة على الأورام الخبيثة للخلايا التائية بعد العلاج بالخلايا التائية ذات مستقبلات المستضدات الخيمرية ، خلصت إدارة الغذاء والدواء الأمريكية مؤخرا إلى أن التحذير المعبأ الذي يسلط الضوء على خطر جسيم للإصابة بسرطان الخلايا التائية المعتمد حاليا لجميع علاجات الخلايا التائية الموجهة ب CD19 والمستهدفة ل BCMA37. ومع ذلك ، تشير الدراسات الجماعية الكبيرة التي تتبع الآثار طويلة المدى لعلاج CAR-T إلى حدوث SPMs يتراوح من 3.8٪ إلى 15٪ بين المرضى المعالجين26،27،28،38،39. معدل الإصابة ليس أعلى بكثير من ذلك الذي لوحظ في مرضى سرطان الدم الذين يتلقون العلاج المنهجي التقليدي40،41 ، مما يشير إلى ملف تعريف آمن نسبيا للعلاج بالخلايا التائية ذات مستقبلات المستضدات الوهمية. ومع ذلك، هناك حاجة ملحة لتطوير خلايا مستقبلات الكربون التائية الآمنة والفعالة التي تقلل من مخاطر ملخص القذائف المضادة للتحقق من خلال مناهج أكثر فعالية من حيث التكلفة.

هنا ، نصف بروتوكولا مفصلا لنهج غير فيروسي وغير متكامل لتوليد خلايا CAR-T. الهدف هو توفير دليل مباشر خطوة بخطوة لتوليد خلايا CAR-T صغيرة الحجم وفعالة مع تعبير CAR عابر ، وبالتالي تجنب الطفرات الإدخالية وتقليل مخاطر SPMs. نظهر أن التثقيب الكهربائي للخلايا التائية مع mRNA المعدل الذي يشفر CAR الخاص ب TAA HER2 أدى إلى تعبير قوي وعابر عن مضاد HER2 CAR على سطح الخلية التائية. أثناء التعبير عن CAR ، قتلت الخلايا التائية بقوة الخلايا السرطانية الإيجابية HER2 وأفرزت مستوى عال من IFN-Υ. تم وصف البروتوكول في أربعة أقسام منفصلة ولكنها مستمرة تشمل تحضير CAR mRNA ، وتنشيط الخلية التائية وفتحها الكهربائي ، وتقييم تعبير CAR ، وتحليل وظيفة الخلية التائية CAR. هذا النهج مناسب لتطوير وإنتاج خلايا CAR-T العابرة لكل من البحث الأكاديمي وعلاجات الخلايا السريرية.

Protocol

تم عزل PBMCs المستخدمة هنا سابقا من الدم الكامل من مركز الدم بمستشفى ستانفورد وفقا للبروتوكول المعتمد من مجلس المراجعة المؤسسية (IRB) (13942) باستخدام تدرج كثافة Ficoll-Paque الموصوف قبل42. لم تكن الموافقة المستنيرة للمشاركين قابلة للتطبيق لأن الدم الذي استخدمناه لجمع PBMCs تم الحصول عليه تجاريا من مركز الدم بمستشفى ستانفورد.

1. تحضير CAR mRNA

  1. إعداد القالب
    ملاحظة: يمكن أن يكون إما البلازميد الخطي أو جزء PCR بمثابة قالب لتصنيع CAR mRNA في المختبر ، بشرط أن تحتوي على محفز مناسب 5 'SP6 أو T7 ، ومنطقة 5 'غير مترجمة (UTR) ، وجين معدل CAR ، و 3'UTR مع ذيل بولي (A) مناسب. في هذه الدراسة ، استخدمنا بنية الحمض النووي البلازميد CAR التي تحتوي على محفز SP6 ، وبيتا جلوبين بشري قصير 5'UTR ، وجين معدل CAR ، و 3'UTR يتكون من اثنين من بيتا جلوبين ترادفيين 3'UTRs متبوعا بذيل بولي (A) 112 نقطة أساس43. تؤثر UTRs وتسلسل الترميز وذيل poly (A) على استقرار الحمض النووي الريبي وكفاءة الترجمة43،44،45. ثبت أن ذيل بولي (أ) البالغ 120 نقطة أساس يزيد من إنتاجية البروتين في زراعة الخلايا مقارنة بذيول بولي (أ) الأقصر43.
    1. قم بإعداد الحمض النووي البلازميد CAR باستخدام مجموعة إعداد البلازميد وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. يعد الحمض النووي البلازميدي عالي الجودة ضروريا لتوليد إنتاجية عالية من CAR mRNA.
    2. خطي الحمض النووي لبلازميد CAR باستخدام إنزيم التقييد BglII. اختر إنزيم تقييد يقطع بعد ذيل بولي (أ) ، ويفضل أن يكون قريبا من نهاية ذيل بولي (أ). هضم 10 ميكروغرام (أو 10,000 نانوغرام) من البلازميد المحدد كميا بواسطة مقياس الطيف الضوئي في مزيج تفاعل 100 ميكرولتر يحتوي على 10 وحدة من الإنزيم ، و 10 ميكرولتر من محلول الهضم ، والماء الخالي من النوكلياز طوال الليل عند 37 درجة مئوية.
      ملاحظة: تأكد من أن إنزيم التقييد لا يقطع داخل الجين المعدل CAR وتسلسلات الذيل المعززة المحيطة به و UTR و poly (A). يعد الخطية الكاملة لبلازميد CAR ضروريا لنسخ CAR mRNA بكفاءة.
    3. أضف 200 ميكروغرام / مل من البروتياز K و 0.5٪ وزن / حجم SDS في مزيج الهضم واحتضانه عند 50 درجة مئوية لمدة ساعة.
    4. تنقية الحمض النووي لبلازميد CAR الخطي. أضف حجما متساويا من الفينول: الكلوروفورم: كحول الأيزواميل (25:24: 1 ، الخامس / الحجم) إلى تفاعل الهضم. دوامة بقوة لمدة 15 ثانية تقريبا. قم بتدوير العينة في جهاز طرد مركزي أعلى الطاولة بأقصى سرعة لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة (RT).
    5. نقل الطبقة المائية العليا ، التي تحتوي على الحمض النووي ، إلى أنبوب طرد مركزي دقيق جديد. تجنب نقل أي من الطبقات الوسطى والسفلية التي تحتوي على شوائب البروتين والفينول. قم بإجراء جولة ثانية من الاستخراج باستخدام الكلوروفورم لتقليل الشوائب.
    6. أضف 1/10من حجم 7.5 M من أسيتات الأمونيوم أو 3 M من أسيتات الصوديوم واخلطها برفق. أضف 2.5 حجم من الإيثانول لترسيب الحمض النووي. قم بتخزين العينة في درجة حرارة -20 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة على الأقل.
    7. قم بتدوير العينة بأقصى سرعة لمدة 15 دقيقة عند 4 درجات مئوية لتكسير الحمض النووي. قم بإزالة المادة الطافية بعناية. أضف 500 ميكرولتر من 70٪ إيثانول لغسل حبيبات الحمض النووي.
    8. قم بتدوير العينة مرة أخرى لمدة دقيقتين عند 4 درجات مئوية. قم بإزالة المادة الطافية بعناية. اترك كمية صغيرة من المحلول في الأنبوب.
    9. كرر الدوران لمدة دقيقتين عند 4 درجات مئوية. قم بإزالة المادة الطاففية المتبقية بعناية. جفف حبيبات الحمض النووي بالهواء في RT لمدة 10 دقائق في غطاء معقم حتى لا يظهر محلول الإيثانول في قاع الأنبوب.
      ملاحظة: تجنب الإفراط في تجفيف حبيبات الحمض النووي ، حيث قد يكون من الصعب إذابتها.
    10. أضف 20 ميكرولتر من الماء الخالي من النوكلياز وقم بسحب الماصات لأعلى ولأسفل برفق لإذابة الحمض النووي. الطرد المركزي العينة لفترة وجيزة بأقصى سرعة. قياس تركيز الحمض النووي باستخدام مقياس الطيف الضوئي.
    11. قم بتخزين العينة على الثلج للاستخدام الفوري أو عند -20 درجة مئوية للاستخدام في المستقبل. قم بتحميل 100 نانوغرام من الحمض النووي المنقى على هلام الاغاروز وتحقق من الحجم والسلامة. يجب أن يظهر الحمض النووي كشريط واحد متميز بالحجم المتوقع. لا ينبغي ملاحظة أي عصابات إضافية أو ملطخة.
      ملاحظة: تعد جودة الحمض النووي للقالب أمرا بالغ الأهمية لنسخ الحمض النووي الريبي المرسال بكفاءة. تجنب استخدام الحمض النووي النقي والمجزأ والمتحلل كقالب لنسخ الرنا المرسال.
  2. النسخ في المختبر (IVT)
    1. قم بتجميع CAR mRNA في المختبر. تأكد من استخدام الكواشف والأنابيب وأطراف الماصة الخالية من النوكلياز طوال الإجراءات.
    2. قم بإذابة الكواشف المدرجة في الجدول 1 إلى RT ، باستثناء مزيج بوليميراز SP6 RNA ، والذي يجب تخزينه عند -20 درجة مئوية حتى الاستخدام. قم بإعداد تفاعل النسخ بالترتيب الموضح في الجدول 1 في RT. تخلط برفق وتحتضن عند 37 درجة مئوية لمدة ساعتين على الأقل.
      ملاحظة: يمكن توسيع نطاق التفاعل أو تقليله بناء على كمية الرنا المرسال المطلوبة. ينتج عن التفاعل الموضح أعلاه عادة ما لا يقل عن 100 ميكروغرام (أو 100,000 نانوغرام) من الحمض النووي الريبي المرسال المغطى عند استخدام الحمض النووي للقالب عالي الجودة. قد تؤدي الحضانة الأطول ، أي بين عشية وضحاها ، إلى زيادة غلة الرنا المرسال.
    3. أضف 2 ميكرولتر من DNase I الخالي من RNase إلى التفاعل ، واخلطه برفق ، واحتضنه لمدة 15 دقيقة عند 37 درجة مئوية لتحلل الحمض النووي للقالب.
    4. قم بتنقية الحمض النووي الريبي المرسال للسيارات المكتوب باستخدام مجموعة تنظيف الحمض النووي الريبي (انظر جدول المواد). اتبع تعليمات الشركة المصنعة للمجموعة للتنقية. قم بتخطيب mRNA في ماء خال من النوكلياز.
      ملاحظة: يمكن أيضا تنقية الرنا المرسال باستخدام طريقة استخراج الفينول كلوروفورم الموضحة أعلاه (الخطوة 1.1.4).
    5. قم بقياس تركيز الرنا المرسال باستخدام مقياس الطيف الضوئي. قم بتحميل ما لا يقل عن 200 نانوغرام من mRNA على هلام الاغاروز وتحقق من حجمه وسلامته. يجب أن يظهر الرنا المرسال كنطاق مهيمن بالحجم المتوقع ، دون أي نطاقات إضافية أو ملطخة. قم بتخزين الرنا المرسال عند -80 درجة مئوية حتى الاستخدام.

2. تنشيط الخلية التائية وفتحها الكهربائي

  1. قم بتعليق 1 × 106 خلايا أحادية النواة للدم المحيطي البشري (PBMCs) في 1 مل من وسط CAR-T (وسط AIM-V مكمل بنسبة 10٪ من مصل بقري الجنين (FBS) ، والبنسلين / الستربتومايسين ، و 10 نانوغرام / مل من IL-2 المؤتلف البشري). قم بتنشيط الخلايا التائية بعدد متساو من حبات T-Activator CD3 / CD28 البشرية المغسولة مسبقا (انظر جدول المواد). زراعة الخلايا وتوسيعها عند 37 درجة مئوية في حاضنة رطبة مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 لعدة أيام.
    ملاحظة: يمكن زيادة مقدار PBMCs أو تقليلها بناء على كمية الخلايا التائية المطلوبة للتجارب اللاحقة.
  2. قم بإذابة الجليد CAR mRNA المحضر على الجليد. أضف 1 مل من وسط CAR-T لكل بئر إلى بئرين من صفيحة 12 بئرا وقم بموازنة الوسط عن طريق وضع اللوحة في الحاضنة عند 37 درجة مئوية.
  3. انقل 5 × 10 6 خلايا T إلى أنبوب معقم وقم بإزالة الخرزات عن طريق وضع الأنبوب على حامل مغناطيسي وسحب تعليق الخلية بعناية إلى أنبوب جديد.
  4. قم بالطرد المركزي للأنبوب عند 300 × جم لمدة 5 دقائق في RT. تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق حبيبات الخلية في 1 مل من PBS المعقم.
  5. الطرد المركزي الأنبوب مرة أخرى. تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق الخلايا في 200 ميكرولتر من عازلة النيون T (انظر جدول المواد).
  6. Pipet 100 ميكرولتر من الخلايا إلى أنبوب جديد وإضافة 5 ميكروغرام (أو 5,000 نانوغرام) من CAR mRNA إلى الخلايا46. قم بتكملة عازلة النيون T بإجمالي 125 ميكرولتر واخلطها عن طريق سحب العينات لأعلى ولأسفل.
    ملاحظة: يمكن زيادة كمية الرنا المرسال CAR المراد نقلها عن طريق التثقيب الكهربائي حتى 8 ميكروغرام (أو 8,000 نانوغرام) لكل 1 × 106 خلايا T دون التأثير سلبا على بقاء الخلية ، وقد تؤدي كمية أعلى من mRNA إلى زيادة تعبير CAR46.
  7. أضف 25 ميكرولتر من المخزن المؤقت النيون T إلى الخلايا المتبقية سعة 100 ميكرولتر. هذا بمثابة التحكم السلبي.
  8. التثقيب الكهربائي للخلايا التائية. استخدم ماصة النيون لشفط خليط الخلايا التائية / CAR mRNA أو الخلايا التائية السلبية في طرف نيون 100 ميكرولتر وقم بالكهرباء للخلايا بنبضة 10 مللي ثانية تبلغ 1800 فولت.
  9. انقل الخلايا على الفور إلى وسط الثقافة المتوازن في اللوحة المكونة من 12 بئرا (المحضرة في الخطوة 2.2) بعد التثقيب الكهربائي.
  10. أعد اللوحة مرة أخرى إلى الحاضنة وقم بتوسيع الخلايا حتى تصبح جاهزة للاستخدام. لضمان نمو صحي وسريع للخلايا التائية المستضدة للمستقبلات الخيمرية ، حافظ على كثافة الخلايا بين 1-3 × 106 خلايا / مل مع وسط جديد لحين الحاجة.

3. تقييم تعبير CAR

  1. امزج الخلايا التائية CAR عن طريق سحب العينة لأعلى ولأسفل برفق عدة مرات في كل بئر ، وانقل ما لا يقل عن 1 × 105 خلايا إلى أنبوب FACS سعة 5 مل.
  2. أضف 3 مل من مخزن الغسيل البارد (PBS يحتوي على 2 ملي مولار EDTA و 0.5٪ وزن / حجم BSA) إلى الأنبوب. قم بالطرد المركزي للأنبوب عند 500 × جم لمدة 5 دقائق في RT. قم بإزالة المادة الطافية بعناية.
  3. أعد تعليق حبيبات الخلية في 100 ميكرولتر من محلول الغسيل. أضف 2 ميكرولتر من كاشف الكشف عن CAR allophycocyanin (APC) الماعز المترافق المضاد للإنسان IgG F (ab') 2 (انظر جدول المواد) و 2 ميكرولتر من صبغة البقاء 7-AAD في الخلايا العالقة.
    ملاحظة: يمكن أيضا اكتشاف CAR باستخدام مستضد مستهدف مسمى بشكل مناسب أو جسم مضاد مضاد للعلامات إذا كان CAR يحتوي على علامة (أي FLAG). إذا تم استخدام جسم مضاد غير مصنف للكشف عن CAR ، فيلزم الحضانة بجسم مضاد ثانوي مناسب يحمل علامة التألق بعد الخطوة 3.4.
  4. امزج العينة عن طريق هز الأنبوب برفق واحتضانه على الثلج لمدة 30 دقيقة. تجنب الضوء أثناء الحضانة. اغسل الخلايا ب 3 مل من محلول الغسيل البارد ، وقم بالطرد المركزي للأنبوب عند 500 × جم لمدة 5 دقائق في RT.
  5. تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق الخلايا في 100 ميكرولتر من محلول الغسيل. قم بتحليل الخلايا باستخدام مقياس التدفق الخلوي على الفور. تأكد من تعويض ملصق الفلورسنت الخاص بكاشف الكشف وصبغة الجدوى بشكل صحيح باستخدام عناصر التحكم الإيجابية والسلبية المناسبة.
  6. قم بتقييم تعبير CAR باستخدام استراتيجية البوابات التالية: بوابة على الخلايا باستخدام مخطط FSC-A مقابل SSC-A ؛ بوابة على الخلايا المفردة باستخدام مخطط FSC-A مقابل FSC-H ؛ بوابة على الخلايا الحية باستخدام تلطيخ 7-AAD.
  7. احسب النسبة المئوية للخلايا التائية الحية التي تم تلطيخها بواسطة الجسم المضاد IgG F (ab') 2 المضاد للإنسان. قارن خلايا CAR-T بالخلايا التائية ذات التحكم السلبي ، والتي يجب أن تحتوي على الحد الأدنى من التلوين.

4. تحليل وظيفة الخلية التائية CAR-T

  1. تحليل السمية الخلوية
    1. تأكد من أن الخلايا السرطانية المستهدفة تعبر عن المستضد في شكل يمكن التعرف عليه بواسطة CAR لتأكيد تعبير المستضد ، قم بتحليل الخلايا السرطانية عن طريق قياس التدفق الخلوي باستخدام الجسم المضاد الأصلي الذي اشتق منه CAR . إذا لم تتمكن CAR من التعرف على الخلايا السرطانية ، فستفشل خلايا CAR-T في قتل الخلايا السرطانية.
    2. تحضير الخلايا السرطانية المستهدفة التي تعبر عن مستضد CAR على سطح الخلية. قم بتربسين الخلايا السرطانية الملتصقة بمحلول 0.05٪ تريبسين-EDTA لمدة دقيقة واحدة عند 37 درجة مئوية وإعداد معلق خلية واحدة مع وسط زراعة مناسب عند 1-4 × 105 خلايا / مل.
      ملاحظة: يجب أن تكون الخلايا السرطانية ملتصقة جيدا لضمان التحليل الدقيق في الخطوات اللاحقة. إذا كانت الخلايا السرطانية تلتصق بشكل سيئ ، أو تنفصل بسهولة أو تنمو في معلقة ، فقم بتغطية آبار الصفيحة المستخدمة في الخطوة التالية بجسم مضاد مناسب أو بوليمر متعدد الكاتيونيات أو مادة بيولوجية مثل الفبرونيكتين أو الكولاجين لتسهيل ارتباط الخلية.
    3. قم بإعداد لوحة إلكترونية (انظر جدول المواد). تصميم الإعداد التجريبي. أضف 50 ميكرولتر من وسط زراعة الخلايا السرطانية الدافئ مسبقا في كل بئر وضع اللوحة الإلكترونية في أداة تحليل الخلايا في الوقت الفعلي (RTCA) لقياس مقاومة الخلفية. قم بقياس المعاوقة عند 1 دقيقة لكل قياس (أو مسح) لمدة 3 عمليات مسح.
      ملاحظة: يتم استخدام مقاومة الخلفية لضبط فهرس الخلية على الصفر. بدون قياس مقاومة الخلفية ، لا يمكن مقارنة الآبار ببعضها البعض ، مما يجعل النتائج غير قابلة للتفسير.
    4. قم بإزالة اللوحة الإلكترونية من أداة RTCA وأضف 100 ميكرولتر من تعليق الخلية السرطانية إلى كل بئر. لذلك ، يحتوي كل بئر على 1-4 × 104 خلايا في الحجم الكلي 150 ميكرولتر.
      ملاحظة: يجب تحديد عدد الخلايا السرطانية التي سيتم زرعها في كل بئر قبل التجربة. قم بزرع اللوحة الإلكترونية بمجموعة من أرقام الخلايا ، ثم راقب فهارس الخلايا خلال 24-48 ساعة القادمة. يحافظ العدد المطلوب من الخلايا على زيادة مطردة في مؤشر الخلايا لمدة 24 ساعة على الأقل دون استقرار. يمكن أن يؤدي البذر المفرط للخلايا إلى تسريع استنفاد المغذيات والتحمض المتوسط ، مما يؤدي إلى الاستقرار المبكر لمؤشر الخلية. بالإضافة إلى ذلك ، يجب تضمين الآبار المتكررة لكل مجموعة لتحديد القياسات الخارجية المحتملة.
    5. قم بموازنة اللوحة الإلكترونية عند RT لمدة 30 دقيقة. تسمح هذه الخطوة للخلايا السرطانية بالاستقرار والالتصاق بقاع الآبار.
      ملاحظة: هذه الخطوة ضرورية لقياس مؤشر الخلية بدقة. عادة ما يتسبب تخطي هذه الخطوة في تباين جيد إلى جيد في قياسات مؤشر الخلايا والتصاق غير متكافئ للخلايا السرطانية داخل الآبار ، مما يؤدي إلى زيادة الضوضاء في الفحص.
    6. ضع اللوحة الإلكترونية مرة أخرى على أداة RTCA وراقب فهارس الخلية لمدة 24 ساعة تقريبا ، مع عمليات المسح التي يتم إجراؤها كل 5-15 دقيقة.
    7. في اليوم التالي ، قم بإعداد تعليق خلية CAR-T. قم بتعليق خلايا CAR-T (الخلايا المستجيبة) من الخطوة 2.10 في وسط RPMI 1640 بالإضافة إلى 10٪ FBS إلى تركيز تحدده الخلية السرطانية (الخلية المستهدفة) والمستجيب المطلوب: نسبة الخلية المستهدفة (E:T). على سبيل المثال ، إذا كان تعليق الخلية السرطانية بكثافة 2 × 105 خلايا / مل ونسبة E: T 10: 1 مطلوبة ، فيجب تعليق خلايا CAR-T إلى 2 × 106 خلايا / مل. قم بتضمين الضوابط المناسبة مثل الخلايا السرطانية وحدها (بدون خلايا مستجيبة) والخلايا التائية الضابطة (الخلايا التائية المكهربة بدون mRNA أو مع mRNA للتحكم).
      ملاحظة: للحصول على أفضل النتائج ، استخدم خلايا CAR-T بعد 1-2 أيام من التثقيب الكهربائي عندما يكون تعبير CAR السطحي مرتفعا. لاستكشاف نسبة E:T المثلى، يمكن اختبار نطاق من نسب E:T (على سبيل المثال، 3:1 إلى 20:1). ما لم يكن تردد CAR-T منخفضا جدا ، أي أقل من 10٪ ، فإن نسبة E: T البالغة 10: 1 أو 20: 1 عادة ما تكون كافية لتحقيق القتل شبه الكامل للخلايا السرطانية.
    8. أوقف تسجيل فهرس الخلية مؤقتا وقم بإزالة اللوحة الإلكترونية من أداة RTCA.
    9. قم بإمالة اللوحة قليلا ، وقم بإزالة 50 ميكرولتر من وسط المزرعة من كل بئر بعناية دون لمس الخلايا السرطانية ، وأضف 100 ميكرولتر من خلايا CAR-T أو الخلايا التائية الضابطة في كل بئر.
    10. أعد اللوحة الإلكترونية إلى أداة RTCA واستأنف مراقبة مؤشر الخلية لمدة 24 ساعة على الأقل مع عمليات المسح التي يتم إجراؤها كل 5-15 دقيقة.
      ملاحظة: يعتمد طول مراقبة مؤشر الخلية على مدى سرعة استهداف خلايا CAR-T للخلايا السرطانية. عادة ما تكون فترة الحضانة التي تبلغ 24 ساعة كافية لخلايا CAR-T لممارسة أقصى تأثير سام للخلايا.
    11. أوقف مراقبة مؤشر الخلية ، وقم بإزالة اللوحة الإلكترونية من أداة RTCA ، وقم بتحليل نتيجة السمية الخلوية. احسب السمية الخلوية كنسبة مئوية للخلايا السرطانية التي قتلتها خلايا CAR-T. احسب متوسط السمية الخلوية لخلايا CAR-T وتحكم في الخلايا التائية باستخدام برنامج RTCA. لحساب السمية الخلوية يدويا ، استخدم الصيغة
      السمية الخلوية = ((فهرس الخلية للخلايا السرطانية) - (فهرس الخلية للخلايا السرطانية بالإضافة إلى الخلايا المستجيبة)) / (مؤشر الخلية للخلايا السرطانية) × 100٪.
  2. تحليل إفراز السيتوكين
    1. لتحليل السيتوكينات مثل IFN-Υ التي تفرزها خلايا CAR-T أثناء تحليل السمية الخلوية ، انقل المادة الطافية من الصفيحة الإلكترونية إلى صفيحة مستديرة القاع أو على شكل حرف V 96 بئر.
      ملاحظة: إذا كان التحليل الزمني لإفراز السيتوكين مطلوبا ، فقم بإيقاف مراقبة مؤشر الخلية مؤقتا عند الخطوة 4.1.10 ، واجمع جزءا صغيرا من المادة الطافية من كل بئر ، وأعد اللوحة الإلكترونية مرة أخرى إلى أداة RTCA ، واستأنف المراقبة.
    2. جهاز الطرد المركزي للوحة 96 بئرا عند 300 × جم لمدة 5 دقائق في RT. انقل المواد الطافية بعناية إلى صفيحة جديدة مكونة من 96 بئرا دون إزعاج كريات الخلية.
    3. قم بقياس مستويات السيتوكين في المواد الطافية باستخدام مجموعات مقايسة الممتز المناعي المرتبط بالإنزيم (ELISA) التجارية وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. عادة ما تتطلب المواد الطافية التخفيف قبل القياس ، وأحيانا أكثر من 100 ضعف ، اعتمادا على السيتوكينات التي يتم تحليلها.
    4. قم بتحليل البيانات عن طريق استيفاء قيم امتصاص العينة مقابل منحنى قياسي تم إنشاؤه من المعايير المخففة بشكل متسلسل. قم بإعداد الرسوم البيانية بأشرطة الخطأ التي تمثل متوسط ± الانحراف المعياري (SD) باستخدام البرامج المناسبة. لمقارنة الفرق بين العلاجات ، يمكن إجراء اختبار t للطالب. عادة ما تعتبر قيمة p أقل من 0.05 ذات دلالة إحصائية.
      ملاحظة: ينبغي استبعاد نقاط البيانات المتطرفة الواضحة، والتي يرجع ذلك على الأرجح إلى أخطاء تجريبية، من التحليل.

النتائج

قمنا ببناء الجيل الثاني من CAR المستهدف HER2 يحتوي على scFv مشتق من الجسم المضاد أحادي النسيلة للفأر المضاد ل HER2 (mAb) 4D547 ، وهو منطقة عبر الغشاء ، ومجال تكلفة داخل الخلايا 4-1BB متبوعا بمجال تنشيط CD3ζ (الشكل 1 أ). احتوى تسلسل الحمض النووي الذي يشفر CAR على ?...

Discussion

في هذه الدراسة ، نصف نهجا مفصلا غير فيروسي وغير متكامل لتوليد خلايا CAR-T عابرة ونقدم إجراءات فنية لتقييم وظيفة الخلايا التائية ذات مستقبلات المستضدات النوعية. يتجنب هذا النهج استخدام نواقل الفيروسات القهقرية التقليدية والفيروسات العكسية لتوصيل الجينات المعدلة والمستم?...

Disclosures

المؤلفون ليانغ هو ، وروبرت بيراهوفيتش ، ويانوي هوانغ ، وشيمينغ تشانغ ، وجينينج صن ، وشيانغونغ ليو ، وهوا تشو ، وشيرلي ، وشو ، وهاوكي لي ، وفيتا جولوبوفسكايا هم موظفون في ProMab Biotechnologies. Lijun Wu هو موظف ومساهم في ProMab Biotechnologies.

Acknowledgements

تم دعم هذا العمل من قبل ProMab Biotechnologies.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
7-AAD viability dye Biolegend420404
ACEA Novocyte flow cytometerAgilentNovoCyte 3000
AIM-V mediumGibco12055083
APC goat anti-human IgG F(ab')2 antibodyJackson ImmunoResearch Laboratories109-136-097
BglII Restriction EnzymeNew England BioLabs (NEB)R0144L
3´-O-Me-m7G(5')ppp(5')G RNA Cap Structure AnalogNEBS1411S
DMEM, high glucoseGibco11965092
Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28 beadsGibco11131D
E-Plate 96Agilent5232376001
EthanolSigma459844-4L
FBSLonza.com14-503F
HiScribe SP6 RNA Synthesis KitNew England BioLabs (NEB)E2070S
Human IL-2 Recombinant ProteinGibco15140122
Millennium RNA MarkersInvitrogenAM7150
Monarch RNA Cleanup Kit (500 μg)NEBT2050L
N1-Methylpseudo-UTPTrilinkN-1081-10
Neon Transfection InstrumentInvitrogenMPK5000
Neon Transfection System 100-μL KitInvitrogenMPK10096
Penicillin-Streptomycin (10000 U/mL)Gibco14-503F
RPMI 1640 MediumGibco11875135
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol redGibco25300120
UltraPure Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol (25:24:1, v/v)Invitrogen15593049
xCELLigence Real-Time Cell Analysis (RTCA) instrumentAgilentRTCA MP
ZymoPURE II Plasmid Midiprep KitZymo ResearchD4201

References

  1. Ataeinia, B., et al. National and subnational incidence, mortality, and years of life lost due to breast cancer in iran: Trends and age-period-cohort analysis since 1990. Front Oncol. 11, 561376 (2021).
  2. Jordan, R. M., Oxenberg, J. . Breast cancer conservation therapy. , (2024).
  3. Tannock, I. F. Combined modality treatment with radiotherapy and chemotherapy. Radiother Oncol. 16 (2), 83-101 (1989).
  4. Mcree, A. J., Cowherd, S., Wang, A. Z., Goldberg, R. M. Chemoradiation therapy in the management of gastrointestinal malignancies. Future Oncol. 7 (3), 409-426 (2011).
  5. Palumbo, M. O., et al. Systemic cancer therapy: Achievements and challenges that lie ahead. Front Pharmacol. 4, 57 (2013).
  6. Mitra, A., et al. From bench to bedside: The history and progress of car t cell therapy. Front Immunol. 14, 1188049 (2023).
  7. Lim, W. A., June, C. H. The principles of engineering immune cells to treat cancer. Cell. 168 (4), 724-740 (2017).
  8. Silveira, C. R. F., et al. Cytokines as an important player in the context of car-t cell therapy for cancer: Their role in tumor immunomodulation, manufacture, and clinical implications. Front Immunol. 13, 947648 (2022).
  9. Labanieh, L., Majzner, R. G., Mackall, C. L. Programming car-t cells to kill cancer. Nat Biomed Eng. 2 (6), 377-391 (2018).
  10. Sadelain, M., Brentjens, R., Riviere, I. The basic principles of chimeric antigen receptor design. Cancer Discov. 3 (4), 388-398 (2013).
  11. Tokarew, N., Ogonek, J., Endres, S., Von Bergwelt-Baildon, M., Kobold, S. Teaching an old dog new tricks: Next-generation car t cells. Br J Cancer. 120 (1), 26-37 (2019).
  12. Kochenderfer, J. N., et al. Eradication of b-lineage cells and regression of lymphoma in a patient treated with autologous t cells genetically engineered to recognize cd19. Blood. 116 (20), 4099-4102 (2010).
  13. Brentjens, R. J., et al. Safety and persistence of adoptively transferred autologous cd19-targeted t cells in patients with relapsed or chemotherapy refractory b-cell leukemias. Blood. 118 (18), 4817-4828 (2011).
  14. Tomasik, J., Jasinski, M., Basak, G. W. Next generations of car-t cells - new therapeutic opportunities in hematology. Front Immunol. 13, 1034707 (2022).
  15. Asmamaw Dejenie, T., et al. Current updates on generations, approvals, and clinical trials of car t-cell therapy. Hum Vaccin Immunother. 18 (6), 2114254 (2022).
  16. Sun, W., Jiang, Z., Jiang, W., Yang, R. Universal chimeric antigen receptor t cell therapy - the future of cell therapy: A review providing clinical evidence. Cancer Treat Res Commun. 33, 100638 (2022).
  17. Wang, X., Riviere, I. Clinical manufacturing of car t cells: Foundation of a promising therapy. Mol Ther Oncolytics. 3, 16015 (2016).
  18. Pinto, I. S., Cordeiro, R. A., Faneca, H. Polymer- and lipid-based gene delivery technology for car t cell therapy. J Control Release. 353, 196-215 (2023).
  19. Magnani, C. F., et al. Sleeping beauty-engineered car t cells achieve antileukemic activity without severe toxicities. J Clin Invest. 130 (11), 6021-6033 (2020).
  20. Irving, M., Lanitis, E., Migliorini, D., Ivics, Z., Guedan, S. Choosing the right tool for genetic engineering: Clinical lessons from chimeric antigen receptor-t cells. Hum Gene Ther. 32 (19-20), 1044-1058 (2021).
  21. Moretti, A., et al. The past, present, and future of non-viral car t cells. Front Immunol. 13, 867013 (2022).
  22. Song, H. W., et al. Car-t cell expansion platforms yield distinct t cell differentiation states. Cytotherapy. 26 (7), 757-768 (2024).
  23. Stephenson, M., Grayson, W. Recent advances in bioreactors for cell-based therapies. F1000Res. 7, (2018).
  24. Micklethwaite, K. P., et al. Investigation of product-derived lymphoma following infusion of piggybac-modified cd19 chimeric antigen receptor t cells. Blood. 138 (16), 1391-1405 (2021).
  25. Ghilardi, G., et al. T cell lymphoma and secondary primary malignancy risk after commercial car t cell therapy. Nat Med. 30 (4), 984-989 (2024).
  26. Steffin, D. H. M., et al. Long-term follow-up for the development of subsequent malignancies in patients treated with genetically modified iecs. Blood. 140 (1), 16-24 (2022).
  27. Cappell, K. M., et al. Long-term follow-up of anti-cd19 chimeric antigen receptor t-cell therapy. J Clin Oncol. 38 (32), 3805-3815 (2020).
  28. Cordeiro, A., et al. Late events after treatment with cd19-targeted chimeric antigen receptor modified t cells. Biol Blood Marrow Transplant. 26 (1), 26-33 (2020).
  29. Zhao, A., et al. Secondary myeloid neoplasms after cd19 car t therapy in patients with refractory/relapsed b-cell lymphoma: Case series and review of literature. Front Immunol. 13, 1063986 (2022).
  30. Verdun, N., Marks, P. Secondary cancers after chimeric antigen receptor t-cell therapy. N Engl J Med. 390 (7), 584-586 (2024).
  31. Ruella, M., et al. Induction of resistance to chimeric antigen receptor t cell therapy by transduction of a single leukemic b cell. Nat Med. 24 (10), 1499-1503 (2018).
  32. Bishop, D. C., et al. Development of car t-cell lymphoma in 2 of 10 patients effectively treated with piggybac-modified cd19 car t cells. Blood. 138 (16), 1504-1509 (2021).
  33. Shah, N. N., et al. Clonal expansion of car t cells harboring lentivector integration in the cbl gene following anti-cd22 car t-cell therapy. Blood Adv. 3 (15), 2317-2322 (2019).
  34. Fraietta, J. A., et al. Disruption of tet2 promotes the therapeutic efficacy of cd19-targeted t cells. Nature. 558 (7709), 307-312 (2018).
  35. Heinrich, T., et al. Mature t-cell lymphomagenesis induced by retroviral insertional activation of janus kinase 1. Mol Ther. 21 (6), 1160-1168 (2013).
  36. Harrison, S. J., et al. Car+ t-cell lymphoma post ciltacabtagene autoleucel therapy for relapsed refractory multiple myeloma. Blood. 142 (Supplement 1), 6939-6939 (2023).
  37. FDA Administration. . Fda requires boxed warning for t cell malignancies following treatment with bcma-directed or cd19-directed autologous chimeric antigen receptor (car) t cell immunotherapies. , (2024).
  38. Elsallab, M., et al. Second primary malignancies after commercial car t-cell therapy: Analysis of the fda adverse events reporting system. Blood. 143 (20), 2099-2105 (2024).
  39. Levine, B. L., et al. Unanswered questions following reports of secondary malignancies after car-t cell therapy. Nat Med. 30 (2), 338-341 (2024).
  40. Tward, J. D., Wendland, M. M., Shrieve, D. C., Szabo, A., Gaffney, D. K. The risk of secondary malignancies over 30 years after the treatment of non-hodgkin lymphoma. Cancer. 107 (1), 108-115 (2006).
  41. Kumar, V., et al. Trends in the risk of second primary malignancies among survivors of chronic lymphocytic leukemia. Blood Cancer J. 9 (10), 75 (2019).
  42. Holtkamp, S., et al. Modification of antigen-encoding rna increases stability, translational efficacy, and t-cell stimulatory capacity of dendritic cells. Blood. 108 (13), 4009-4017 (2006).
  43. Dvir, S., et al. Deciphering the rules by which 5'-utr sequences affect protein expression in yeast. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (30), E2792-E2801 (2013).
  44. Van Der Velden, A. W., Voorma, H. O., Thomas, A. A. Vector design for optimal protein expression. Biotechniques. 31 (3), 572-580 (2001).
  45. Jaatinen, T., Laine, J. Isolation of mononuclear cells from human cord blood by ficoll-paque density gradient. Curr Protoc Stem Cell Biol. Chapter 2 (Unit 2A), 1 (2007).
  46. Zhao, Y., et al. High-efficiency transfection of primary human and mouse t lymphocytes using rna electroporation. Mol Ther. 13 (1), 151-159 (2006).
  47. Carter, P., et al. Humanization of an anti-p185her2 antibody for human cancer therapy. Proc Natl Acad Sci U S A. 89 (10), 4285-4289 (1992).
  48. Hu, L., et al. Her2-cd3-fc bispecific antibody-encoding mrna delivered by lipid nanoparticles suppresses her2-positive tumor growth. Vaccines. 12 (7), 808 (2024).
  49. Perales-Puchalt, A., et al. DNA-encoded bispecific t cell engagers and antibodies present long-term antitumor activity. JCI Insight. 4 (8), e126086 (2019).
  50. Schwanhausser, B., et al. Global quantification of mammalian gene expression control. Nature. 473 (7347), 337-342 (2011).
  51. Kozak, M. Features in the 5' non-coding sequences of rabbit alpha and beta-globin mrnas that affect translational efficiency. J Mol Biol. 235 (1), 95-110 (1994).
  52. Wu, Q., et al. Translation affects mrna stability in a codon-dependent manner in human cells. Elife. 8, e45396 (2019).
  53. Henderson, J. M., et al. Cap 1 messenger rna synthesis with co-transcriptional cleancap((r)) analog by in vitro transcription. Curr Protoc. 1 (2), e39 (2021).
  54. Kariko, K., et al. Incorporation of pseudouridine into mrna yields superior nonimmunogenic vector with increased translational capacity and biological stability. Mol Ther. 16 (11), 1833-1840 (2008).
  55. Gehl, J. Electroporation: Theory and methods, perspectives for drug delivery, gene therapy and research. Acta Physiol Scand. 177 (4), 437-447 (2003).
  56. Stacey, M., Fox, P., Buescher, S., Kolb, J. Nanosecond pulsed electric field induced cytoskeleton, nuclear membrane and telomere damage adversely impact cell survival. Bioelectrochemistry. 82 (2), 131-134 (2011).
  57. Meaking, W. S., Edgerton, J., Wharton, C. W., Meldrum, R. A. Electroporation-induced damage in mammalian cell DNA. Biochim Biophys Acta. 1264 (3), 357-362 (1995).
  58. Zhang, J., et al. Non-viral, specifically targeted car-t cells achieve high safety and efficacy in b-nhl. Nature. 609 (7926), 369-374 (2022).
  59. Von Auw, N., et al. Comparison of two lab-scale protocols for enhanced mrna-based car-t cell generation and functionality. Sci Rep. 13 (1), 18160 (2023).
  60. Gauthier, J., Turtle, C. J. Insights into cytokine release syndrome and neurotoxicity after cd19-specific car-t cell therapy. Curr Res Transl Med. 66 (2), 50-52 (2018).
  61. Beatty, G. L., et al. Activity of mesothelin-specific chimeric antigen receptor t cells against pancreatic carcinoma metastases in a phase 1 trial. Gastroenterology. 155 (1), 29-32 (2018).
  62. Beatty, G. L., et al. Mesothelin-specific chimeric antigen receptor mrna-engineered t cells induce anti-tumor activity in solid malignancies. Cancer Immunol Res. 2 (2), 112-120 (2014).
  63. Tchou, J., et al. Safety and efficacy of intratumoral injections of chimeric antigen receptor (car) t cells in metastatic breast cancer. Cancer Immunol Res. 5 (12), 1152-1161 (2017).
  64. Wu, J., Wu, W., Zhou, B., Li, B. Chimeric antigen receptor therapy meets mrna technology. Trends Biotechnol. 42 (2), 228-240 (2024).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

216 mRNA RTCA HER2

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved