JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

В этом протоколе подробно описана процедура получения транзиторных химерных антигенных рецепторов (CAR) Т-клеток с использованием неинтегрирующей мРНК для иммунотерапии рака, а также представлены надежные методы оценки CAR-T-клеток и их цитотоксической функции.

Аннотация

Терапия Т-клетками с помощью химерного антигенного рецептора (CAR) стала новаторским методом лечения рака, достигнув беспрецедентных успехов в лечении некоторых гематологических злокачественных новообразований, таких как лимфомы и лейкозы. Тем не менее, по мере того, как все больше онкологических пациентов получают терапию CAR-T-клетками, все чаще сообщается о вторичных злокачественных новообразованиях, связанных с лечением, отчасти из-за неожиданного введения трансгена CAR, что вызывает серьезные опасения по поводу безопасности. Чтобы решить эту проблему, мы опишем здесь невирусный, неинтегрирующий подход к получению транзиторных CAR-T-клеток с использованием мРНК. Мы электропорировали Т-клетки модифицированной мРНК, кодирующей специфичный для рецептора эпидермального фактора роста человека 2 (HER2) CAR, и получили транзиторные CAR-T-клетки, нацеленные на HER2. CAR эффективно экспрессировался на поверхности Т-клеток через 1 день после электропорации, увеличивался на 2-й день и резко снижался к 5-му дню. Транзиторные CAR-T-клетки проявляли потенциальную цитотоксичность в отношении HER2-положительных клеток рака яичников SKOV-3 и секретировали высокие уровни ИФН-Υ. Этот протокол представляет собой пошаговое руководство по созданию маломасштабных транзиторных CAR-T-клеток без постоянной интеграции трансгена CAR, описывающее подробные процедуры получения мРНК CAR, активации и трансфекции Т-клеток, оценки экспрессии CAR и анализа функции CAR-T-клеток in vitro . Этот метод подходит для получения транзиторных CAR-T-клеток как в доклинических, так и в клинических исследованиях.

Введение

Рак становится все более серьезной угрозой для здоровья человека: ежегодно во всем мире диагностируется 23,6 миллиона новых случаев заболевания и 10 миллионов случаев смерти1. Хирургическое лечение в сочетании с лучевой и химиотерапией остается золотым стандартом лечения различных типов локализованных неинвазивных и инвазивных раковых опухолей 2,3,4. Несмотря на то, что традиционное систематическое лечение достигло огромных успехов в лечении рака на ранних стадиях, оно очень токсично и оказывает ограниченное воздействие на метастатические и гематологические видырака. Пациенты с этими видами рака проходят частое лечение и терпят значительную токсичность в надежде стабилизировать и замедлить прогрессирование заболевания. Терапия Т-клетками с помощью химерных антигенных рецепторов (CAR) недавно стала революционной таргетной терапией, которая демонстрирует потенциальную эффективность при В-клеточном гематологическом раке и дает надежду этим отчаявшимсяпациентам.

CAR-T-клетки представляют собой сконструированные Т-лимфоциты, экспрессирующие CAR на поверхности клетки, которые специфически распознают опухолеассоциированные антигены (TAA) и активируют клетки, не требуя антигенной презентации со стороны основных белков комплекса гистосовместимости (MHC)7. После активации CAR-T-клетки секретируют панель цитокинов и лизируют опухолевые клетки независимо от MHC, тем самым усиливая разрушение опухолей даже тогда, когда MHC подавляются или теряются из-за иммуносупрессивного микроокружения опухоли 8,9. CAR состоят, по меньшей мере, из трех различных доменов: внеклеточного варианта одноцепочечного фрагмента (scFv), содержащего антиген-распознающие вариабельные области TAA-специфического антитела, трансмембранного домена, который прикрепляет CAR к поверхности клетки, и внутриклеточного домена, который опосредует набор адапторных белков и нисходящую передачу сигналов.. Основываясь на вариациях внутриклеточных доменов, структуры CAR эволюционировали на протяжении пяти поколений, причем первое поколение содержало только активационный домен CD3ζ, а последующие поколения обладали одним или несколькими дополнительными костимулирующими доменами из молекул, таких как 4-1BB и CD2811. Эти внутриклеточные домены влияют на сигнальные механизмы CAR-T-клеток, пролиферацию, выживаемость и токсичность, которые в совокупности определяют клиническую противоопухолевую эффективность. Клинический успех CAR-T-клеточной терапии обусловлен CAR-T-клетками второго поколения, которые специально нацелены на CD19, биомаркер, высоко экспрессирующийся на клетках B-линии, для лечения B-клеточных лейкозов и лимфом12,13. На сегодняшний день Управление по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов (FDA) одобрило шесть терапий второго поколения CAR-T-клетками, нацеленных либо на CD-19, либо на антиген созревания B-клеток (BCMA) при рецидивирующих или рефрактерных гематологических злокачественных новообразованиях, включая большую В-клеточную лимфому, мантийноклеточную лимфому и множественную миелому 6. Новые поколения CAR-T-клеток в настоящее время проходят интенсивные доклинические и клинические исследования14,15.

Клиническое производство CAR-T-клеток является сложным, дорогостоящим и трудоемким процессом. В настоящее время лейкоциты, используемые для получения CAR-T-клеток, поступают от самих пациентов, чтобы избежать аллогенных реакций, хотя универсальные (или готовые) CAR-T-клетки, полученные от доноров, находятся в стадии активной разработки иклинической оценки. После выделения лейкоцитов из периферической крови пациента с помощью лейкафереза чужеродный фрагмент гена, кодирующий CAR, вводят в активированные Т-клетки с использованием вирусного или невирусного подходов 17,18,19. Ретровирусы и лентивирусы являются наиболее распространенными вирусными векторами для доставки гена CAR, что приводит к случайной и постоянной интеграции ДНК, кодирующей CAR, в геном Т-клеток20. Невирусные подходы, включая мРНК-липидные наночастицы, транспозонные системы и редактирование генома CRISPR/Cas9, менее распространены21. Впоследствии CAR-экспрессирующие Т-клетки размножают ex vivo в больших масштабах, а затем собирают и повторно вводят пациентам22,23. Производство вирусных векторов, отвечающих строгим стандартам надлежащей производственной практики (GMP), является очень сложным, сложным и дорогостоящим, что создает значительную нагрузку на производителей, регулирующие органы и пациентов, тем самым ограничивая их широкое клиническое применение.

Несмотря на ошеломляющий успех CAR-T-терапии, растет обеспокоенность по поводу ее безопасности. Учитывая случайный характер интеграции трансгена CAR в геном Т-клеток во время вирусной или транспозонной трансдукции, может произойти нарушение генов-супрессоров опухолей или активация онкогенов, что приведет к злокачественной трансформации Т-клеток24,25. С момента одобрения FDA первого продукта CAR-T-клеточной терапии в 2017 году, последующие исследования показывают, что у 15% пациентов, получающих терапию, развиваются вторичные первичные злокачественные новообразования (SPM), такие как Т-клеточная лимфома (TCL), немелкоклеточный рак легкого (НМРЛ) и рак кожи 26,27,28,29. Поразительно, что трансгены CAR были высоко обнаружены в некоторых СЗМ30,31, а некоторые случаи ТКЛ были непосредственно вызваны аномальной экспансией CAR-T-клеток 24,32,33, что указывает на прямую роль продуктов CAR-T в индуцировании некоторых СЗМ. Другие исследования также выявили вставки трансгенов CAR в критически важных генах, таких как TET234, JAK135 и PBX236 в опухолевых клетках SPM. В свете накапливающихся доказательств злокачественных новообразований Т-клеток после терапии CAR-T-клетками, FDA недавно пришло к выводу, что для всех одобренных в настоящее время методов терапии CAR-T-клеток, направленных на CD19 и BCMA, требуется предупреждение, указывающее на серьезный риск злокачественных новообразований Т-клеток. Тем не менее, в исследованиях большой когорты, посвященных долгосрочным эффектам лечения CAR-T, сообщается о частоте СЗМ в диапазоне от 3,8% до 15% среди пролеченных пациентов 26,27,28,38,39. Заболеваемость незначительно выше, чем у пациентов с раком крови, получающих традиционное систематическое лечение40,41, что свидетельствует об относительно безопасном профиле для терапии CAR-T-клетками. Тем не менее, существует острая необходимость в разработке безопасных и эффективных CAR-T-клеток, которые минимизируют риск СЗМ с помощью более экономически эффективных подходов.

В этой статье мы опишем подробный протокол для невирусного, неинтегрирующего подхода к созданию CAR-T-клеток. Цель состоит в том, чтобы предоставить простое, пошаговое руководство по созданию небольших эффективных CAR-T-клеток с транзиторной экспрессией CAR, тем самым избегая инсерционного мутагенеза и сводя к минимуму риск СЗМ. Мы показываем, что электропорация Т-клеток модифицированной мРНК, кодирующей CAR, специфичный к TAA HER2, приводит к устойчивой и преходящей экспрессии анти-HER2 CAR на поверхности Т-клеток. Во время экспрессии CAR Т-клетки мощно убивали HER2-положительные опухолевые клетки и секретировали высокий уровень ИФН-Υ. Протокол описан в четырех отдельных, но непрерывных разделах, которые включают в себя получение мРНК CAR, активацию и электропорацию Т-клеток, оценку экспрессии CAR и анализ функции CAR-T-клеток. Этот подход подходит для разработки и производства транзиторных CAR-T-клеток как для академических исследований, так и для клинической клеточной терапии.

протокол

Использованные здесь PBMC ранее были выделены из цельной крови из Центра крови Стэнфордской больницы в соответствии с протоколом, одобренным Институциональным наблюдательным советом (IRB) (13942), с использованием градиента плотности Фиколла-Пака, описанного ранее42. Информированное согласие участников не было применимо, поскольку кровь, которую мы использовали для сбора PBMC, была получена на коммерческой основе в Центре крови Стэнфордской больницы.

1. Получение мРНК CAR

  1. Подготовка шаблона
    Примечание: Либо линеаризованная плазмида, либо фрагмент ПЦР могут служить матрицей для синтеза мРНК CAR in vitro, при условии, что они содержат надлежащий 5'-промотор SP6 или T7, 5'-нетранслируемую область (UTR), трансген CAR и 3'UTR с подходящим поли(А)-хвостом. В этом исследовании мы использовали конструкцию ДНК плазмиды CAR, содержащую промотор SP6, короткий человеческий бета-глобин 5'UTR, трансген CAR и 3'UTR, состоящий из двух тандемных бета-глобина 3'UTR, за которыми следует поли(А) хвост43.о. 112.о. UTR, кодирующая последовательность и поли(А)-хвост влияют на стабильность РНК и эффективность трансляции 43,44,45. Было показано, что поли(А)-хвост в 120.о. увеличивает выход белка в клеточной культуре по сравнению с более короткими поли(А)-хвостами43.
    1. Подготовьте CAR конструкционную плазмидную ДНК с помощью набора для подготовки плазмид в соответствии с инструкциями производителя. Высококачественная плазмидная ДНК необходима для получения высокого выхода CAR мРНК.
    2. Линеаризируйте ДНК плазмиды CAR с помощью фермента рестрикции BglII. Выберите фермент рестрикции, который разрезается после поли(А)-хвоста, предпочтительно близко к концу поли(А)-хвоста. Расщепляют 10 г (или 10 000 нг) плазмиды, количественно определенной с помощью спектрофотометра, в реакционной смеси объемом 100 мкл, содержащей 10 ЕД фермента, 10 мкл буфера для расщепления и воду, не содержащую нуклеаз, в течение ночи при 37 °С.
      Примечание: Убедитесь, что фермент рестрикции не проникает в трансген CAR и его боковые промоторы, UTR и поли(А)-хвосты. Полная линеаризация CAR-плазмиды необходима для эффективной транскрипции мРНК CAR.
    3. Добавьте 200 мкг/мл протеазы K и 0,5% мас./v SDS в смесь для сбраживания и инкубируйте при 50 °C в течение 1 ч.
    4. Очистите линеаризованную ДНК плазмиды CAR. Добавьте равное количество фенола: хлороформа: изоамиловый спирт (25:24:1, v/v) в реакцию пищеварения. Вихрь энергично в течение примерно 15 с. Вращайте образец в настольной центрифуге на максимальной скорости в течение 5 минут при комнатной температуре (RT).
    5. Перенесите верхний водный слой, в котором находится ДНК, в новую микроцентрифужную пробирку. Избегайте переноса любого из средних и нижних слоев, которые содержат примеси белка и фенола. Проведите второй раунд экстракции хлороформом для уменьшения количества примесей.
    6. Добавьте 1/10-й объем 7,5 М ацетата аммония или 3 М ацетата натрия и аккуратно перемешайте. Добавьте 2,5 объема этанола для осаждения ДНК. Храните образец при температуре −20 °C не менее 30 минут.
    7. Вращайте образец на максимальной скорости в течение 15 минут при 4 °C, чтобы гранулировать ДНК. Осторожно удалите надосадочную жидкость. Добавьте 500 мкл 70% этанола для промывки гранулы ДНК.
    8. Снова вращайте образец в течение 2 минут при температуре 4 °C. Осторожно удалите надосадочную жидкость. Оставьте небольшое количество раствора в пробирке.
    9. Повторяйте отжим в течение 2 минут при температуре 4°C. Аккуратно удалите остатки надосадочной жидкости. Высушите гранулу ДНК на воздухе в режиме RT в течение примерно 10 минут в стерильном колпаке до тех пор, пока на дне пробирки не останется раствор этанола.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте пересушивания гранулы ДНК, так как ее может быть трудно растворить.
    10. Добавьте 20 μL воды, не содержащей нуклеаз, и осторожно пипетируйте вверх и вниз, чтобы растворить ДНК. Кратковременно центрифугируйте образец на максимальной скорости. Измерьте концентрацию ДНК с помощью спектрофотометра.
    11. Храните образец на льду для немедленного использования или при температуре −20 °C для дальнейшего использования. Загрузите 100 нг очищенной ДНК в агарозный гель и проверьте размер и целостность. ДНК должна выглядеть как одна, отчетливая полоса ожидаемого размера. Не должно быть никаких лишних или размазанных полос.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Качество матричной ДНК имеет решающее значение для эффективной транскрипции мРНК. Избегайте использования нечистой, фрагментированной и деградированной ДНК в качестве матрицы для транскрипции мРНК.
  2. Транскрипция in vitro (IVT)
    1. Синтезировать мРНК CAR in vitro. Обязательно используйте реагенты, не содержащие нуклеазы, пробирки и наконечники для пипеток на протяжении всей процедуры.
    2. Разморозьте реагенты, перечисленные в таблице 1 , до ОТ, за исключением смеси РНК-полимеразы SP6, которую следует хранить при температуре -20 °C до использования. Приготовьте реакцию транскрипции в порядке, указанном в таблице 1 на RT. Осторожно перемешайте и инкубируйте при 37 °C в течение не менее 2 часов.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Реакцию можно масштабировать в большую или меньшую сторону в зависимости от необходимого количества мРНК. Показанная выше реакция обычно дает не менее 100 мкг (или 100 000 нг) кэпированной мРНК при использовании высококачественной матричной ДНК. Более длительная инкубация, т.е. в течение ночи, может увеличить выход мРНК.
    3. Добавьте в реакцию 2 мкл ДНКазы I, свободной от РНКазы, осторожно перемешайте и инкубируйте в течение 15 мин при 37 °C для разрушения матричной ДНК.
    4. Очистите транскрибированную мРНК CAR с помощью набора для очистки РНК (см. Таблицу материалов). Следуйте инструкциям производителя набора по очистке. Разбавьте мРНК в воде, не содержащей нуклеаз.
      ПРИМЕЧАНИЕ: МРНК также может быть очищена с использованием метода фенол-хлороформной экстракции, показанного выше (шаг 1.1.4).
    5. Измерьте концентрацию мРНК с помощью спектрофотометра. Загрузите не менее 200 нг мРНК в агарозный гель и проверьте его размер и целостность. МРНК должна выглядеть как доминантная полоса ожидаемого размера, без каких-либо дополнительных или размазанных полос. Храните мРНК при температуре −80 °C до использования.

2. Активация и электропорация Т-клеток

  1. Суспендировать 1 x 106 криоконсервированных мононуклеарных клеток периферической крови человека (PBMC) в 1 мл среды CAR-T (среда AIM-V с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS), пенициллина/стрептомицина и 10 нг/мл человеческого рекомбинантного IL-2). Активируйте Т-клетки с помощью равного количества предварительно промытых гранул CD3/CD28 Т-активатора человека (см. Таблицу материалов). Культивируйте и расширяйте клетки при 37 °C в увлажненном инкубаторе с 5%CO2 в течение нескольких дней.
    Примечание: Количество PBMC может быть увеличено или уменьшено в зависимости от количества Т-клеток, необходимого для последующих экспериментов.
  2. Разморозьте подготовленную мРНК CAR на льду. Добавьте 1 мл среды CAR-T на лунку в две лунки 12-луночного планшета и уравновесьте среду, поместив планшет в инкубатор при температуре 37 °C.
  3. Перенесите 5 x 106 Т-клеток в стерильную пробирку и удалите шарики, поместив пробирку на магнитную подставку и осторожно пипетируя клеточную суспензию в новую пробирку.
  4. Центрифугируйте пробирку при 300 x g в течение 5 мин при RT. Выбросьте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте клеточную гранулу в 1 мл стерильного PBS.
  5. Снова центрифугируйте пробирку. Выбросьте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте клетки в 200 мкл неонового буфера T (см. Таблицу материалов).
  6. Пипетировать 100 мкл клеток в новую пробирку и добавить 5 мкг (или 5000 нг) мРНК CAR к клеткам46. Добавьте неоновый буфер T в общей сложности до 125 мкл и перемешайте пипетированием вверх и вниз.
    Примечание: Количество мРНК CAR, трансфицируемого электропорацией, может быть увеличено до 8 мкг (или 8000 нг) на 1 x 106 Т-клеток без негативного влияния на жизнеспособность клеток, а большее количество мРНК может привести к увеличению экспрессии CAR46.
  7. Добавьте 25 μL неонового буфера T к оставшимся 100 μL элементам. Это служит негативным контролем.
  8. Электропорировать Т-клетки. С помощью неоновой пипетки отсасывайте смесь Т-клеток/мРНК CAR или отрицательные контрольные Т-клетки в неоновый наконечник объемом 100 мкл и электропорируйте клетки импульсом 10 мс с напряжением 1800 В.
  9. После электропорации клетки немедленно переносят в уравновешенную питательную среду в 12-луночный планшет (подготовленный на шаге 2.2).
  10. Верните пластину обратно в инкубатор и разложите ячейки до готовности к использованию. Чтобы обеспечить здоровый и быстрый рост CAR-Т-клеток, поддерживайте плотность клеток в диапазоне 1−3 x 106 клеток/мл с помощью свежей среды до тех пор, пока это не потребуется.

3. Оценка экспрессии CAR

  1. Смешайте CAR-Т-клетки путем осторожного пипетирования вверх и вниз несколько раз в каждой лунке и перенесите не менее 1 x 105 клеток в пробирку FACS объемом 5 мл.
  2. Добавьте в пробирку 3 мл буфера для холодной стирки (PBS, содержащего 2 мМ ЭДТА и 0,5% мас./об.) в пробирку. Центрифугируйте пробирку при давлении 500 x g в течение 5 минут при RT. Осторожно удалите надосадочную жидкость.
  3. Повторно суспендируйте гранулу ячейки в 100 мкл промывочного буфера. Добавьте в суспензированные клетки 2 мкл конъюгированного с CAR реагента CAR аллофикоцианина (APC)-конъюгированного козьего антитела IgG F(ab')2 (см. Таблицу материалов) и 2 мкл жизнеспособного красителя 7-AAD.
    ПРИМЕЧАНИЕ: CAR также может быть обнаружен с помощью надлежащим образом помеченного целевого антигена или антитела против TAG, если CAR содержит метку (т.е. FLAG). Если для обнаружения CAR используется немеченое антитело, то после этапа 3.4 требуется инкубация с соответствующим флуоресцентно меченным вторичным антителом.
  4. Перемешайте образец, осторожно встряхивая пробирку, и выдерживайте на льду в течение 30 минут. Избегайте попадания света во время инкубации. Промойте ячейки 3 мл буфера для холодной промывки и центрифугируйте пробирку при 500 x g в течение 5 минут при RT.
  5. Выбросьте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте клетки в 100 мкл промывочного буфера. Немедленно проанализируйте клетки с помощью проточного цитометра. Убедитесь, что флуоресцентная метка реагента для обнаружения и краситель жизнеспособности должным образом компенсированы с помощью соответствующих положительных и отрицательных контрольных показателей.
  6. Оценка экспрессии CAR с использованием следующей стратегии стробирования: Вентиль на ячейках с использованием графика FSC-A vs SSC-A; Вентиль на одиночных ячейках с использованием графика FSC-A vs FSC-H; Затвор на живых клетках с помощью окрашивания 7-AAD.
  7. Рассчитайте процент живых Т-клеток, окрашенных антителом IgG F(ab')2 против человека. Сравните CAR-T-клетки с отрицательными контрольными Т-клетками, которые должны иметь минимальное окрашивание.

4. Анализ функции CAR-T-клеток

  1. Анализ цитотоксичности
    1. Убедитесь, что опухолевые клетки-мишени экспрессируют антиген в конформации, которая может быть распознана CAR. Чтобы подтвердить экспрессию антигена, проанализируйте опухолевые клетки методом проточной цитометрии с использованием родительского антитела, из которого был получен CAR. Если CAR-клетки не могут распознать опухолевые клетки, то CAR-T-клетки не смогут убить опухолевые клетки.
    2. Подготовьте опухолевые клетки-мишени, экспрессирующие антиген CAR на поверхности клетки. Трипсинизируют адгезивные опухолевые клетки 0,05% раствором трипсина-ЭДТА в течение 1 мин при 37 °С и получают одиночную клеточную суспензию с соответствующей питательной средой при концентрации 1−4 х 105 кл/мл.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Опухолевые клетки должны быть хорошо адгезивными, чтобы обеспечить точный анализ на последующих этапах. Если опухолевые клетки плохо адгезируются, легко отделяются или растут в виде суспензии, покройте лунки пластины, используемой на следующем этапе, подходящим антителом, поликатионным полимером или биологическим материалом, таким как фибронектин или коллаген, чтобы облегчить прикрепление клеток.
    3. Подготовьте электронную пластину (см. Таблицу материалов). Спроектируйте экспериментальную установку. Добавьте 50 мкл предварительно подогретой среды для культивирования опухолевых клеток в каждую лунку и поместите E-Plate в прибор для анализа клеток в реальном времени (RTCA) для измерения фонового импеданса. Измерьте импеданс через 1 минуту на каждое измерение (или развертку) для 3 разверток.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Фоновое сопротивление используется для установки индекса ячейки равным нулю. Без измерения фонового импеданса скважины не могут быть сравнены друг с другом, что делает результаты неинтерпретируемыми.
    4. Извлеките E-Plate из инструмента RTCA и добавьте в каждую лунку по 100 мкл суспензии опухолевых клеток. Таким образом, каждая лунка содержит 1−4 x10 4 ячейки общим объемом 150 μL.
      Примечание: Количество опухолевых клеток, которые должны быть засеяны в каждую лунку, должно быть определено до начала эксперимента. Засейте E-Plate диапазоном номеров клеток, а затем отслеживайте индексы клеток в течение следующих 24−48 часов. Желаемое количество клеток поддерживает устойчивый рост клеточного индекса в течение как минимум 24 часов без плато. Чрезмерный посев клеток может ускорить истощение питательных веществ и закисление среды, что приводит к раннему плато клеточного индекса. Кроме того, для каждой группы должны быть включены повторяющиеся скважины для выявления потенциальных измерений выбросов.
    5. Уравновесьте E-Plate в положении RT в течение 30 минут. Этот этап позволяет опухолевым клеткам осесть и прилипнуть к дну лунок.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг необходим для точного измерения клеточного индекса. Пропуск этого этапа обычно приводит к вариабельности измерений клеточного индекса от скважины к лунке и неравномерной адгезии опухолевых клеток в лунках, что приводит к увеличению шума при анализе.
    6. Поместите E-Plate обратно в прибор RTCA и контролируйте индексы ячеек в течение примерно 24 часов, выполняя развертки каждые 5−15 минут.
    7. На следующий день приготовьте суспензию CAR-T-клеток. Суспензируйте CAR-T-клетки (эффекторные клетки) с шага 2.10 в среде RPMI 1640 плюс 10% FBS до концентрации, определяемой опухолевой клеткой (клеткой-мишенью) и желаемым соотношением эффектор:клетка-мишень (E:T). Например, если суспензия опухолевых клеток имеет плотность 2 x 105 клеток/мл и желательно соотношение E:T 10:1, то CAR-T-клетки следует суспензировать до 2 x 106 клеток/мл. Включите надлежащие контрольные клетки, такие как только опухолевые клетки (без эффекторных клеток) и контрольные Т-клетки (Т-клетки, электропорированные без мРНК или с контрольной мРНК).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для достижения оптимальных результатов используйте CAR-T-клетки через 1-2 дня после электропорации, когда поверхностная экспрессия CAR высока. Чтобы исследовать оптимальное соотношение E:T, можно протестировать диапазон соотношений E:T (например, от 3:1 до 20:1). Если частота CAR-T не очень низкая, т.е. менее 10%, соотношение E:T 10:1 или 20:1 обычно достаточно для достижения почти полного уничтожения опухолевых клеток.
    8. Приостановите запись индекса ячейки и снимите E-Plate с прибора RTCA.
    9. Слегка наклоните планшет, осторожно удалите 50 мкл питательной среды из каждой лунки, не касаясь опухолевых клеток, и добавьте в каждую лунку по 100 мкл CAR-T-клеток или контрольных Т-клеток.
    10. Верните E-Plate в прибор RTCA и возобновите мониторинг индекса ячейки в течение не менее 24 часов, выполняя развертки каждые 5−15 минут.
      Примечание: Продолжительность мониторинга клеточного индекса зависит от того, насколько быстро CAR-T-клетки нацелены на опухолевые клетки. 24-часового инкубационного периода обычно достаточно для того, чтобы CAR-T-клетки проявили максимальный цитотоксический эффект.
    11. Остановите мониторинг клеточного индекса, извлеките E-Plate из прибора RTCA и проанализируйте результат цитотоксичности. Рассчитайте цитотоксичность как процент опухолевых клеток, убитых CAR-T-клетками. Рассчитать среднюю цитотоксичность CAR-T-клеток и контролировать Т-клетки с помощью программного обеспечения RTCA. Чтобы рассчитать цитотоксичность вручную, воспользуйтесь формулой
      цитотоксичность = ((клеточный индекс опухолевых клеток) − (клеточный индекс опухолевых клеток плюс эффекторные клетки)) / (клеточный индекс опухолевых клеток) × 100%.
  2. Анализ секреции цитокинов
    1. Чтобы проанализировать цитокины, такие как ИФН-Υ, секретируемые CAR-T-клетками во время анализа цитотоксичности, перенесите надосадочную жидкость с Е-планшета на 96-луночный планшет с круглым дном или V-образным дном.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если требуется анализ секреции цитокинов по времени, приостановите мониторинг клеточного индекса на шаге 4.1.10, соберите небольшую порцию надосадочной жидкости из каждой лунки, верните E-Plate обратно в прибор RTCA и возобновите мониторинг.
    2. Центрифугируйте 96-луночный планшет при 300 x g в течение 5 мин при RT. Осторожно перенесите надосадочную жидкость на новый 96-луночный планшет, не нарушая клеточные гранулы.
    3. Измеряйте уровень цитокинов в надосадочной жидкости с помощью коммерческих наборов иммуноферментного анализа (ИФА) в соответствии с инструкциями производителя. Надосадочная жидкость обычно требует разведения перед измерением, иногда более чем в 100 раз, в зависимости от анализируемых цитокинов.
    4. Анализируйте данные путем интерполяции значений поглощения образца по стандартной кривой, полученной из серийно разбавленных стандартов. Подготовьте графики с полосами погрешностей, представляющими среднее значение ± стандартного отклонения (SD), с помощью соответствующего программного обеспечения. Чтобы сравнить разницу между методами лечения, можно провести t-критерий Стьюдента. p-значение менее 0,05 обычно считается статистически значимым.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Точки данных, которые являются явными выбросами, вероятно, из-за экспериментальных ошибок, должны быть исключены из анализа.

Результаты

Мы сконструировали CAR, нацеленный на HER2 второго поколения, содержащий scFv, полученный из гуманизированного мышиного моноклонального антитела (mAb) против HER24D5 47, трансмембранную область и внутриклеточный костимулирующий домен 4-1BB, за которым следует домен а...

Обсуждение

В этом исследовании мы подробно описываем невирусный, неинтегрирующий подход к получению транзиторных CAR-T-клеток и предоставляем технические процедуры для оценки функции CAR-T-клеток. Этот подход позволяет избежать использования обычных ретровирусных и лентивирусны?...

Раскрытие информации

Авторы Лян Ху, Роберт Берахович, Янвэй Хуан, Шимин Чжан, Цзиньин Сун, Сянхун Лю, Хуа Чжоу, Ширли, Сюй, Хаоци Ли и Вита Голубовская являются сотрудниками компании ProMab Biotechnologies. Лицзюнь Ву является сотрудником и акционером компании ProMab Biotechnologies.

Благодарности

Эта работа была поддержана компанией ProMab Biotechnologies.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
7-AAD viability dye Biolegend420404
ACEA Novocyte flow cytometerAgilentNovoCyte 3000
AIM-V mediumGibco12055083
APC goat anti-human IgG F(ab')2 antibodyJackson ImmunoResearch Laboratories109-136-097
BglII Restriction EnzymeNew England BioLabs (NEB)R0144L
3´-O-Me-m7G(5')ppp(5')G RNA Cap Structure AnalogNEBS1411S
DMEM, high glucoseGibco11965092
Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28 beadsGibco11131D
E-Plate 96Agilent5232376001
EthanolSigma459844-4L
FBSLonza.com14-503F
HiScribe SP6 RNA Synthesis KitNew England BioLabs (NEB)E2070S
Human IL-2 Recombinant ProteinGibco15140122
Millennium RNA MarkersInvitrogenAM7150
Monarch RNA Cleanup Kit (500 μg)NEBT2050L
N1-Methylpseudo-UTPTrilinkN-1081-10
Neon Transfection InstrumentInvitrogenMPK5000
Neon Transfection System 100-μL KitInvitrogenMPK10096
Penicillin-Streptomycin (10000 U/mL)Gibco14-503F
RPMI 1640 MediumGibco11875135
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol redGibco25300120
UltraPure Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol (25:24:1, v/v)Invitrogen15593049
xCELLigence Real-Time Cell Analysis (RTCA) instrumentAgilentRTCA MP
ZymoPURE II Plasmid Midiprep KitZymo ResearchD4201

Ссылки

  1. Ataeinia, B., et al. National and subnational incidence, mortality, and years of life lost due to breast cancer in iran: Trends and age-period-cohort analysis since 1990. Front Oncol. 11, 561376 (2021).
  2. Jordan, R. M., Oxenberg, J. . Breast cancer conservation therapy. , (2024).
  3. Tannock, I. F. Combined modality treatment with radiotherapy and chemotherapy. Radiother Oncol. 16 (2), 83-101 (1989).
  4. Mcree, A. J., Cowherd, S., Wang, A. Z., Goldberg, R. M. Chemoradiation therapy in the management of gastrointestinal malignancies. Future Oncol. 7 (3), 409-426 (2011).
  5. Palumbo, M. O., et al. Systemic cancer therapy: Achievements and challenges that lie ahead. Front Pharmacol. 4, 57 (2013).
  6. Mitra, A., et al. From bench to bedside: The history and progress of car t cell therapy. Front Immunol. 14, 1188049 (2023).
  7. Lim, W. A., June, C. H. The principles of engineering immune cells to treat cancer. Cell. 168 (4), 724-740 (2017).
  8. Silveira, C. R. F., et al. Cytokines as an important player in the context of car-t cell therapy for cancer: Their role in tumor immunomodulation, manufacture, and clinical implications. Front Immunol. 13, 947648 (2022).
  9. Labanieh, L., Majzner, R. G., Mackall, C. L. Programming car-t cells to kill cancer. Nat Biomed Eng. 2 (6), 377-391 (2018).
  10. Sadelain, M., Brentjens, R., Riviere, I. The basic principles of chimeric antigen receptor design. Cancer Discov. 3 (4), 388-398 (2013).
  11. Tokarew, N., Ogonek, J., Endres, S., Von Bergwelt-Baildon, M., Kobold, S. Teaching an old dog new tricks: Next-generation car t cells. Br J Cancer. 120 (1), 26-37 (2019).
  12. Kochenderfer, J. N., et al. Eradication of b-lineage cells and regression of lymphoma in a patient treated with autologous t cells genetically engineered to recognize cd19. Blood. 116 (20), 4099-4102 (2010).
  13. Brentjens, R. J., et al. Safety and persistence of adoptively transferred autologous cd19-targeted t cells in patients with relapsed or chemotherapy refractory b-cell leukemias. Blood. 118 (18), 4817-4828 (2011).
  14. Tomasik, J., Jasinski, M., Basak, G. W. Next generations of car-t cells - new therapeutic opportunities in hematology. Front Immunol. 13, 1034707 (2022).
  15. Asmamaw Dejenie, T., et al. Current updates on generations, approvals, and clinical trials of car t-cell therapy. Hum Vaccin Immunother. 18 (6), 2114254 (2022).
  16. Sun, W., Jiang, Z., Jiang, W., Yang, R. Universal chimeric antigen receptor t cell therapy - the future of cell therapy: A review providing clinical evidence. Cancer Treat Res Commun. 33, 100638 (2022).
  17. Wang, X., Riviere, I. Clinical manufacturing of car t cells: Foundation of a promising therapy. Mol Ther Oncolytics. 3, 16015 (2016).
  18. Pinto, I. S., Cordeiro, R. A., Faneca, H. Polymer- and lipid-based gene delivery technology for car t cell therapy. J Control Release. 353, 196-215 (2023).
  19. Magnani, C. F., et al. Sleeping beauty-engineered car t cells achieve antileukemic activity without severe toxicities. J Clin Invest. 130 (11), 6021-6033 (2020).
  20. Irving, M., Lanitis, E., Migliorini, D., Ivics, Z., Guedan, S. Choosing the right tool for genetic engineering: Clinical lessons from chimeric antigen receptor-t cells. Hum Gene Ther. 32 (19-20), 1044-1058 (2021).
  21. Moretti, A., et al. The past, present, and future of non-viral car t cells. Front Immunol. 13, 867013 (2022).
  22. Song, H. W., et al. Car-t cell expansion platforms yield distinct t cell differentiation states. Cytotherapy. 26 (7), 757-768 (2024).
  23. Stephenson, M., Grayson, W. Recent advances in bioreactors for cell-based therapies. F1000Res. 7, (2018).
  24. Micklethwaite, K. P., et al. Investigation of product-derived lymphoma following infusion of piggybac-modified cd19 chimeric antigen receptor t cells. Blood. 138 (16), 1391-1405 (2021).
  25. Ghilardi, G., et al. T cell lymphoma and secondary primary malignancy risk after commercial car t cell therapy. Nat Med. 30 (4), 984-989 (2024).
  26. Steffin, D. H. M., et al. Long-term follow-up for the development of subsequent malignancies in patients treated with genetically modified iecs. Blood. 140 (1), 16-24 (2022).
  27. Cappell, K. M., et al. Long-term follow-up of anti-cd19 chimeric antigen receptor t-cell therapy. J Clin Oncol. 38 (32), 3805-3815 (2020).
  28. Cordeiro, A., et al. Late events after treatment with cd19-targeted chimeric antigen receptor modified t cells. Biol Blood Marrow Transplant. 26 (1), 26-33 (2020).
  29. Zhao, A., et al. Secondary myeloid neoplasms after cd19 car t therapy in patients with refractory/relapsed b-cell lymphoma: Case series and review of literature. Front Immunol. 13, 1063986 (2022).
  30. Verdun, N., Marks, P. Secondary cancers after chimeric antigen receptor t-cell therapy. N Engl J Med. 390 (7), 584-586 (2024).
  31. Ruella, M., et al. Induction of resistance to chimeric antigen receptor t cell therapy by transduction of a single leukemic b cell. Nat Med. 24 (10), 1499-1503 (2018).
  32. Bishop, D. C., et al. Development of car t-cell lymphoma in 2 of 10 patients effectively treated with piggybac-modified cd19 car t cells. Blood. 138 (16), 1504-1509 (2021).
  33. Shah, N. N., et al. Clonal expansion of car t cells harboring lentivector integration in the cbl gene following anti-cd22 car t-cell therapy. Blood Adv. 3 (15), 2317-2322 (2019).
  34. Fraietta, J. A., et al. Disruption of tet2 promotes the therapeutic efficacy of cd19-targeted t cells. Nature. 558 (7709), 307-312 (2018).
  35. Heinrich, T., et al. Mature t-cell lymphomagenesis induced by retroviral insertional activation of janus kinase 1. Mol Ther. 21 (6), 1160-1168 (2013).
  36. Harrison, S. J., et al. Car+ t-cell lymphoma post ciltacabtagene autoleucel therapy for relapsed refractory multiple myeloma. Blood. 142 (Supplement 1), 6939-6939 (2023).
  37. FDA Administration. . Fda requires boxed warning for t cell malignancies following treatment with bcma-directed or cd19-directed autologous chimeric antigen receptor (car) t cell immunotherapies. , (2024).
  38. Elsallab, M., et al. Second primary malignancies after commercial car t-cell therapy: Analysis of the fda adverse events reporting system. Blood. 143 (20), 2099-2105 (2024).
  39. Levine, B. L., et al. Unanswered questions following reports of secondary malignancies after car-t cell therapy. Nat Med. 30 (2), 338-341 (2024).
  40. Tward, J. D., Wendland, M. M., Shrieve, D. C., Szabo, A., Gaffney, D. K. The risk of secondary malignancies over 30 years after the treatment of non-hodgkin lymphoma. Cancer. 107 (1), 108-115 (2006).
  41. Kumar, V., et al. Trends in the risk of second primary malignancies among survivors of chronic lymphocytic leukemia. Blood Cancer J. 9 (10), 75 (2019).
  42. Holtkamp, S., et al. Modification of antigen-encoding rna increases stability, translational efficacy, and t-cell stimulatory capacity of dendritic cells. Blood. 108 (13), 4009-4017 (2006).
  43. Dvir, S., et al. Deciphering the rules by which 5'-utr sequences affect protein expression in yeast. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (30), E2792-E2801 (2013).
  44. Van Der Velden, A. W., Voorma, H. O., Thomas, A. A. Vector design for optimal protein expression. Biotechniques. 31 (3), 572-580 (2001).
  45. Jaatinen, T., Laine, J. Isolation of mononuclear cells from human cord blood by ficoll-paque density gradient. Curr Protoc Stem Cell Biol. Chapter 2 (Unit 2A), 1 (2007).
  46. Zhao, Y., et al. High-efficiency transfection of primary human and mouse t lymphocytes using rna electroporation. Mol Ther. 13 (1), 151-159 (2006).
  47. Carter, P., et al. Humanization of an anti-p185her2 antibody for human cancer therapy. Proc Natl Acad Sci U S A. 89 (10), 4285-4289 (1992).
  48. Hu, L., et al. Her2-cd3-fc bispecific antibody-encoding mrna delivered by lipid nanoparticles suppresses her2-positive tumor growth. Vaccines. 12 (7), 808 (2024).
  49. Perales-Puchalt, A., et al. DNA-encoded bispecific t cell engagers and antibodies present long-term antitumor activity. JCI Insight. 4 (8), e126086 (2019).
  50. Schwanhausser, B., et al. Global quantification of mammalian gene expression control. Nature. 473 (7347), 337-342 (2011).
  51. Kozak, M. Features in the 5' non-coding sequences of rabbit alpha and beta-globin mrnas that affect translational efficiency. J Mol Biol. 235 (1), 95-110 (1994).
  52. Wu, Q., et al. Translation affects mrna stability in a codon-dependent manner in human cells. Elife. 8, e45396 (2019).
  53. Henderson, J. M., et al. Cap 1 messenger rna synthesis with co-transcriptional cleancap((r)) analog by in vitro transcription. Curr Protoc. 1 (2), e39 (2021).
  54. Kariko, K., et al. Incorporation of pseudouridine into mrna yields superior nonimmunogenic vector with increased translational capacity and biological stability. Mol Ther. 16 (11), 1833-1840 (2008).
  55. Gehl, J. Electroporation: Theory and methods, perspectives for drug delivery, gene therapy and research. Acta Physiol Scand. 177 (4), 437-447 (2003).
  56. Stacey, M., Fox, P., Buescher, S., Kolb, J. Nanosecond pulsed electric field induced cytoskeleton, nuclear membrane and telomere damage adversely impact cell survival. Bioelectrochemistry. 82 (2), 131-134 (2011).
  57. Meaking, W. S., Edgerton, J., Wharton, C. W., Meldrum, R. A. Electroporation-induced damage in mammalian cell DNA. Biochim Biophys Acta. 1264 (3), 357-362 (1995).
  58. Zhang, J., et al. Non-viral, specifically targeted car-t cells achieve high safety and efficacy in b-nhl. Nature. 609 (7926), 369-374 (2022).
  59. Von Auw, N., et al. Comparison of two lab-scale protocols for enhanced mrna-based car-t cell generation and functionality. Sci Rep. 13 (1), 18160 (2023).
  60. Gauthier, J., Turtle, C. J. Insights into cytokine release syndrome and neurotoxicity after cd19-specific car-t cell therapy. Curr Res Transl Med. 66 (2), 50-52 (2018).
  61. Beatty, G. L., et al. Activity of mesothelin-specific chimeric antigen receptor t cells against pancreatic carcinoma metastases in a phase 1 trial. Gastroenterology. 155 (1), 29-32 (2018).
  62. Beatty, G. L., et al. Mesothelin-specific chimeric antigen receptor mrna-engineered t cells induce anti-tumor activity in solid malignancies. Cancer Immunol Res. 2 (2), 112-120 (2014).
  63. Tchou, J., et al. Safety and efficacy of intratumoral injections of chimeric antigen receptor (car) t cells in metastatic breast cancer. Cancer Immunol Res. 5 (12), 1152-1161 (2017).
  64. Wu, J., Wu, W., Zhou, B., Li, B. Chimeric antigen receptor therapy meets mrna technology. Trends Biotechnol. 42 (2), 228-240 (2024).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

216RTCAHER2

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены