JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

פרוטוקול זה מתאר הליך מפורט ליצירת תאי T קולטני אנטיגן כימריים חולפים (CAR) באמצעות mRNA לא משולב לאימונותרפיה לסרטן ומספק שיטות אמינות להערכת תאי CAR-T ותפקודם ציטוטוקסי.

Abstract

טיפול בתאי T של קולטן אנטיגן כימרי (CAR) התגלה כטיפול חלוצי בסרטן, והשיג הצלחה חסרת תקדים בטיפול בממאירויות המטולוגיות מסוימות כגון לימפומות ולוקמיה. עם זאת, ככל שיותר חולי סרטן מקבלים טיפולים בתאי CAR-T, ממאירויות ראשוניות משניות הקשורות לטיפול מדווחות יותר ויותר בחלקן בשל החדרת טרנסגן CAR בלתי צפויה, מה שמעלה חששות בטיחות חמורים. כדי לטפל בבעיה זו, אנו מתארים כאן גישה לא ויראלית ולא משולבת ליצירת תאי CAR-T חולפים באמצעות mRNA. חישלנו תאי T באמצעות mRNA שונה המקודד לקולטן גורם גדילה אפידרמלי אנושי 2 (HER2) ספציפי למכונית ויצרנו תאי CAR-T חולפים ממוקדי HER2. ה-CAR התבטא ביעילות על פני תא T יום אחד לאחר ההתחשמלות, גדל ביום 2 וירד באופן דרמטי ביום 5. תאי CAR-T חולפים הפגינו ציטוטוקסיות חזקה כנגד תאי סרטן שחלות SKOV-3 חיוביים ל-HER2 והפרישו רמות גבוהות של IFN-Υ. פרוטוקול זה מספק מדריך שלב אחר שלב לפיתוח תאי CAR-T חולפים בקנה מידה קטן ללא אינטגרציה קבועה של טרנסגן CAR, המתאר נהלים מפורטים להכנת mRNA CAR, הפעלה וטרנספקציה של תאי T, הערכת ביטוי CAR וניתוח חוץ גופי של תפקוד תאי CAR-T. שיטה זו מתאימה לייצור תאי CAR-T חולפים הן במחקרים פרה-קליניים והן במחקרים קליניים.

Introduction

סרטן הוא איום חשוב יותר ויותר על בריאות האדם, עם הערכה שנתית של 23.6 מיליון מקרים שאובחנו לאחרונה ו -10 מיליון מקרי מוות ברחבי העולם1. טיפול כירורגי בשילוב עם הקרנות וכימותרפיה נותר תקן הזהב לטיפול בסוגים שונים של סרטן מקומי, לא פולשני ופולשני 2,3,4. למרות שהטיפול השיטתי המסורתי השיג הצלחה עצומה בניהול סרטן בשלב מוקדם, הוא רעיל מאוד ובעל השפעה מוגבלת על סרטן גרורתי והמטולוגי5. חולים עם סוגי סרטן אלה עוברים טיפולים תכופים וסובלים מרעילות משמעותית בתקווה לייצב ולעכב את התקדמות המחלה. טיפול בתאי T לקולטן אנטיגן כימרי (CAR) התגלה לאחרונה כטיפול ממוקד מהפכני המדגים יעילות חזקה לסרטן המטולוגי של תאי B ומציע תקווה לחולים נואשים אלה6.

תאי CAR-T הם לימפוציטים מהונדסים מסוג T המבטאים CAR על פני התא המזהה באופן ספציפי אנטיגנים הקשורים לגידול (TAAs) ומפעיל את התאים ללא צורך בהצגה אנטיגנית מחלבונים מורכבים היסטו-תאימות עיקריים (MHCs)7. עם ההפעלה, תאי CAR-T מפרישים פאנל של ציטוקינים ותאי גידול ליז ללא תלות ב-MHCs, ובכך מגבירים את הרס הגידולים גם כאשר MHCs מווסתים או אובדים עקב מיקרו-סביבה של גידול מדכא חיסון 8,9. CARs מורכבים מלפחות שלושה תחומים נפרדים – גרסה חוץ-תאית של מקטע חד-שרשרת (scFv) המכילה את אזורי המשתנים המזהים אנטיגן של נוגדן ספציפי ל-TAA, תחום טרנסממברנה המעגן את ה-CAR לפני השטח של התא, ותחום תוך-תאי המתווך גיוס חלבוני מתאם ואיתות במורד הזרם10. בהתבסס על שינויים בתחומים התוך-תאיים, מבני CAR התפתחו במשך חמישה דורות עד כה, כאשר הדור הראשון מכיל רק את תחום ההפעלה CD3ζ והדורות הבאים מכילים תחום קוסטימולטורי נוסף אחד או יותר ממולקולות כגון 4-1BB ו-CD2811. תחומים תוך-תאיים אלה משפיעים על מנגנוני האיתות של תאי CAR-T, על התפשטות, הישרדות ורעילות, אשר יחד קובעים את היעילות הקלינית נגד גידולים. ההצלחה הקלינית של טיפול בתאי CAR-T מגיעה מתאי CAR-T מהדור השני המכוונים ספציפית ל- CD19, סמן ביולוגי המתבטא מאוד בתאי שושלת B, לטיפול בלוקמיה של תאי B ולימפומות 12,13. נכון להיום, מנהל המזון והתרופות האמריקאי (FDA) אישר שישה טיפולים מהדור השני בתאי CAR-T המכוונים ל-CD-19 או לאנטיגן להבשלת תאי B (BCMA) עבור ממאירויות המטולוגיות חוזרות או עקשניות, כולל לימפומה של תאי B גדולים, לימפומה של תאי מעטפת ומיאלומה נפוצה 6. הדורות החדשים יותר של תאי CAR-T עוברים כיום מחקרים פרה-קליניים וקליניים אינטנסיביים14,15.

ייצור קליני של תאי CAR-T הוא תהליך מורכב, יקר וגוזל זמן. נכון לעכשיו, הלויקוציטים המשמשים להכנת תאי CAR-T מגיעים מהמטופלים עצמם כדי להימנע מתגובות אלוגניות, אם כי תאי CAR-T אוניברסליים (או מהמדף) שמקורם בתורם נמצאים בפיתוח פעיל והערכה קלינית16. לאחר בידוד הלויקוציטים מהדם ההיקפי של המטופל על ידי לוקפרזיס, מקטע גן זר המקודד את ה- CAR מוכנס לתאי T המופעלים באמצעות גישות ויראליות או לא ויראליות 17,18,19. רטרו-וירוסים ולנטי-וירוסים הם הווקטורים הנגיפיים הנפוצים ביותר להעברת גנים מסוג CAR, מה שמביא לאינטגרציה אקראית וקבועה של הדנ"א המקודד CAR לתוך גנום תא T20. גישות לא-ויראליות, כולל ננו-חלקיקי mRNA-ליפידים, מערכות טרנספוזון ועריכת גנום CRISPR/Cas9, נפוצות פחות21. לאחר מכן, תאי T המבטאים CAR מורחבים ex vivo בקנה מידה גדול ולאחר מכן נאספים ומחדירים מחדש בחזרה לחולים22,23. ייצור וקטורים נגיפיים העומדים בתקני תנאי ייצור נאותים (GMP) מחמירים הוא קשה, מורכב ויקר מאוד, ומטיל נטל משמעותי על יצרנים, סוכנויות רגולטוריות ומטופלים, ובכך מגביל את היישום הקליני הנרחב שלו.

למרות ההצלחה המרגשת של טיפול CAR-T, קיים חשש גובר לגבי בטיחותו. בהתחשב באופי האקראי של שילוב טרנסגן CAR בגנום תאי T במהלך התמרה נגיפית או טרנספוזון, עלול להתרחש שיבוש של גנים מדכאי גידול או הפעלה של אונקוגנים, מה שמוביל להתמרה ממאירה של תאי T24,25. מאז אישור ה-FDA למוצר הראשון לטיפול בתאי CAR-T בשנת 2017, מחקרי המשך מראים כי עד 15% מהחולים המקבלים את הטיפול מפתחים ממאירויות ראשוניות משניות (SPM) כגון לימפומה של תאי T (TCL), סרטן ריאות של תאים לא קטנים (NSCLC) וסרטן העור 26,27,28,29. באופן מדהים, טרנסגנים של CAR זוהו מאוד בחלק מה-SPMs30,31, וכמה מקרים של TCL נגרמו ישירות על ידי התרחבות חריגה של תאי CAR-T 24,32,33, מה שמצביע על תפקיד ישיר של מוצרי CAR-T בגרימת SPM מסוימים. מחקרים אחרים זיהו גם החדרות טרנסגן CAR בגנים קריטיים כגון TET234, JAK135 ו- PBX236 בתאי הגידול SPM. לאור העדויות המצטברות לממאירויות תאי T בעקבות טיפול בתאי CAR-T, ה- FDA הגיע לאחרונה למסקנה כי אזהרה בקופסה המדגישה סיכון חמור לממאירות תאי T נדרשת עבור כל הטיפולים המאושרים כיום בתאי CAR-T מכווני CD19 וממוקדי BCMA37. עם זאת, מחקרי עוקבה גדולים העוקבים אחר ההשפעות ארוכות הטווח של טיפול CAR-T מדווחים על היארעות של SPM הנעה בין 3.8% ל -15% בקרב חולים מטופלים 26,27,28,38,39. ההיארעות אינה גבוהה משמעותית מזו שנצפתה בחולי סרטן הדם שקיבלו טיפול שיטתי מסורתי40,41, מה שמרמז על פרופיל בטוח יחסית לטיפול בתאי CAR-T. עם זאת, יש צורך דחוף לפתח תאי CAR-T בטוחים ויעילים הממזערים את הסיכון ל- SPM באמצעות גישות חסכוניות יותר.

במאמר זה אנו מתארים פרוטוקול מפורט לגישה לא ויראלית ולא משלבת ליצירת תאי CAR-T. המטרה היא לספק מדריך פשוט, צעד אחר צעד, ליצירת תאי CAR-T בקנה מידה קטן ויעיל עם ביטוי CAR חולף, ובכך למנוע מוטגנזה החדרתית ולמזער את הסיכון של SPM. אנו מראים כי אלקטרופורציה של תאי T עם mRNA שונה המקודד מכונית ספציפית ל- TAA HER2 הביאה לביטוי חזק וחולף של המכונית נגד HER2 על פני תא T. בזמן ביטוי ה-CAR, תאי T הרגו בעוצמה תאי גידול חיוביים ל-HER2 והפרישו רמה גבוהה של IFN-Υ. הפרוטוקול מתואר בארבעה חלקים נפרדים אך רציפים הכוללים הכנת CAR mRNA, הפעלה ואלקטרופורציה של תאי T, הערכת ביטוי CAR וניתוח תפקוד תאי CAR-T. גישה זו מתאימה לפיתוח וייצור תאי CAR-T חולפים הן למחקר אקדמי והן לטיפולים תאיים קליניים.

Protocol

ה- PBMCs המשמשים כאן בודדו בעבר מדם מלא ממרכז הדם של בית החולים סטנפורד על פי פרוטוקול מועצת הביקורת המוסדית (IRB) שאושר (13942) באמצעות שיפוע צפיפות Ficoll-Paque שתואר לפני42. הסכמתם המודעת של המשתתפים לא הייתה ישימה מכיוון שהדם שבו השתמשנו כדי לאסוף את ה- PBMCs הושג באופן מסחרי ממרכז הדם של בית החולים סטנפורד.

1. הכנת mRNA CAR

  1. הכנת תבנית
    הערה: פלסמיד ליניארי או מקטע PCR יכולים לשמש כתבנית לסנתז mRNA של CAR במבחנה, בתנאי שהם מכילים מקדם SP6 או T7 תקין, אזור לא מתורגם 5' (UTR), טרנסגן CAR ו- 3'UTR עם זנב פולי(A) מתאים. במחקר זה השתמשנו במבנה דנ"א פלסמיד CAR המכיל מקדם SP6, בטא-גלובין אנושי קצר 5'UTR, טרנסגן CAR, ו-3'UTR המורכב משני בטא-גלובין 3'UTR טנדם ואחריו זנב פולי(A)43 של 112 bp. ה-UTRs, רצף הקידוד והזנב הפולי-(A) משפיעים כולם על יציבות הרנ"א ויעילות התרגום 43,44,45. זנב פולי(A) של 120 bp הוכח כמגביר את תפוקת החלבון בתרבית תאים בהשוואה לזנבות פולי(A) קצרים יותר43.
    1. הכנת DNA פלסמיד לבניית CAR באמצעות ערכת הכנת פלסמיד בהתאם להוראות היצרן. DNA פלסמיד באיכות גבוהה חיוני ליצירת תשואה גבוהה של mRNA CAR.
    2. לינארית את ה- DNA של פלסמיד CAR עם אנזים ההגבלה BglII. בחר אנזים הגבלה שחותך אחרי זנב הפולי(A), עדיף קרוב לקצה זנב הפולי(A). יש לעכל 10 מיקרוגרם (או 10,000 ננוגרם) של הפלסמיד המכומת על ידי ספקטרופוטומטר בתערובת תגובה של 100 מיקרוליטר המכילה 10 U של האנזים, 10 מיקרוליטר של חיץ עיכול, ומים נטולי נוקלאז למשך הלילה ב-37°C.
      הערה: ודא שאנזים ההגבלה אינו חותך בתוך טרנסגן המכונית ורצפי הזנב של פרומוטור, UTR ופולי(A). ליניאריזציה מלאה של פלסמיד CAR נחוצה לשעתוק יעיל של CAR mRNA.
    3. הוסיפו 200 מיקרוגרם/מ"ל פרוטאז K ו-0.5% w/v SDS לתערובת העיכול ודגרו בטמפרטורה של 50°C למשך שעה אחת.
    4. לטהר את הדנ"א של פלסמיד CAR ליניארי. הוסף נפח שווה של פנול: כלורופורם: אלכוהול איזואמיל (25:24:1, v/v) לתגובת העיכול. מערבולת במרץ במשך כ -15 שניות. סובבו את הדגימה בצנטריפוגה עם ספסל במהירות מרבית למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר (RT).
    5. מעבירים את השכבה המימית העליונה, המכילה את הדנ"א, לצינור מיקרוצנטריפוגה חדש. הימנע מהעברה של כל אחת מהשכבות האמצעיות והתחתונות, המכילות זיהומים של חלבון ופנולים. בצע סיבוב שני של מיצוי עם כלורופורם כדי להפחית זיהומים.
    6. מוסיפים 1/10נפח של 7.5 M אמוניום אצטט או 3M נתרן אצטט ומערבבים בעדינות. הוסף 2.5 כרכים של אתנול כדי לזרז את ה- DNA. אחסנו את הדגימה בטמפרטורה של -20°C למשך 30 דקות לפחות.
    7. סובב את הדגימה במהירות מרבית במשך 15 דקות ב 4 ° C כדי לגלול את ה- DNA. הסר את supernatant בזהירות. הוסף 500 μL של 70% אתנול כדי לשטוף את גלולת DNA.
    8. סובבו את הדגימה שוב למשך 2 דקות ב-4°C. בזהירות להסיר את supernatant. השאירו כמות קטנה של תמיסה בצינור.
    9. חזור על הסחיטה במשך 2 דקות ב-4°C. הסר בזהירות את שאריות הסופרנאטנט. ייבשו באוויר את כדורית הדנ"א ב-RT למשך כ-10 דקות במכסה מנוע סטרילי עד שלא נראית תמיסת אתנול בתחתית הצינור.
      הערה: הימנע מייבוש יתר של כדורית ה- DNA, מכיוון שהיא עלולה להיות קשה להתמוסס.
    10. הוסף 20 μL של מים ללא נוקלאז וצינורות למעלה ולמטה בעדינות כדי להמיס את ה- DNA. צנטריפוגו את הדגימה לזמן קצר במהירות מרבית. למדוד ריכוז DNA באמצעות ספקטרופוטומטר.
    11. אחסנו את הדגימה על קרח לשימוש מיידי או בטמפרטורה של -20°C לשימוש עתידי. טען 100 ng של DNA מטוהר על ג'ל agarose ולאמת את הגודל ואת השלמות. הדנ"א צריך להופיע כרצועה אחת מובחנת בגודל הצפוי. אין להקפיד על רצועות נוספות או מרוחות.
      הערה: איכות הדנ"א של התבנית היא קריטית לשעתוק mRNA יעיל. הימנע משימוש בדנ"א טמא, מקוטע ופגום כתבנית לשעתוק mRNA.
  2. תעתיק חוץ גופי (IVT)
    1. לסנתז את ה-mRNA של CAR במבחנה. הקפד להשתמש בריאגנטים, צינורות וקצוות פיפטה נטולי נוקלאז לאורך כל ההליכים.
    2. הפשירו את הריאגנטים המפורטים בטבלה 1 עד RT, למעט תערובת SP6 RNA פולימראז, שיש לאחסן בטמפרטורה של -20°C עד לשימוש. הכינו את תגובת השעתוק בסדר המוצג בטבלה 1 ב-RT . ערבבו בעדינות ודגרו בטמפרטורה של 37°C למשך שעתיים לפחות.
      הערה: ניתן להגדיל או להקטין את התגובה בהתאם לכמות ה-mRNA הדרושה. התגובה המוצגת לעיל מניבה בדרך כלל לפחות 100 מיקרוגרם (או 100,000 ננוגרם) של mRNA סגור בעת שימוש בדנ"א איכותי של תבנית. דגירה ארוכה יותר, כלומר לילה, עשויה להגדיל את תפוקת ה-mRNA.
    3. הוסף 2 μL של DNase I נטול RNase לתגובה, ערבב בעדינות ודגר במשך 15 דקות ב 37 ° C כדי לפרק את ה- DNA של התבנית.
    4. טהרו את ה-CAR mRNA המשועתק באמצעות ערכת ניקוי RNA (ראו טבלת חומרים). בצע את הוראות יצרן הערכה לטיהור. יש להקפיד על ה-mRNA במים נטולי נוקלאז.
      הערה: ניתן לטהר את ה-mRNA גם באמצעות שיטת מיצוי פנול-כלורופורם המוצגת לעיל (שלב 1.1.4).
    5. למדוד את ריכוז mRNA עם ספקטרופוטומטר. יש להעמיס לפחות 200 ננוגרם של mRNA על ג'ל אגרוז ולוודא את גודלו ותקינותו. ה-mRNA אמור להופיע כרצועה דומיננטית בגודל הצפוי, ללא רצועות נוספות או מרוחות. יש לאחסן את ה-mRNA בטמפרטורה של -80°C עד לשימוש.

2. הפעלה ואלקטרופורציה של תאי T

  1. יש להשהות 1 x 106 תאי דם חד-גרעיניים היקפיים אנושיים (PBMCs) ב-1 מ"ל של מדיום CAR-T (מדיום AIM-V בתוספת 10% נסיוב בקר עוברי (FBS), פניצילין/סטרפטומיצין ו-10 נ"ג/מ"ל של IL-2 רקומביננטי אנושי). הפעל את תאי T עם מספר שווה של חרוזי T-Activator CD3/CD28 אנושיים שטופים מראש (ראה טבלת חומרים). תרבית ולהרחיב את התאים ב 37 ° C באינקובטור לח עם 5% CO2 במשך כמה ימים.
    הערה: ניתן להגדיל או להקטין את כמות תאי ה-PBMC בהתאם לכמות תאי ה-T הנדרשת לניסויים הבאים.
  2. הפשרה הכין mRNA CAR על קרח. הוסף 1 מ"ל של מדיום CAR-T לכל באר לשתי בארות של צלחת 12 בארות ואזן את המדיום על ידי הצבת הצלחת באינקובטור ב 37 ° C.
  3. מעבירים 5 x 106 תאי T לצינור סטרילי ומוציאים את החרוזים על ידי הנחת הצינור על מעמד מגנטי ובזהירות הדבקת מתלה התא לצינור חדש.
  4. צנטריפוגה את הצינור ב 300 x גרם במשך 5 דקות ב RT. להשליך את supernatant ו resuspend את גלולת התא ב 1 מ"ל של PBS סטרילי.
  5. צנטריפוגר את הצינור שוב. השליכו את הסופרנאטנט והשהו מחדש את התאים ב-200 מיקרוליטר של חיץ ניאון T (ראו טבלת חומרים).
  6. Pipet 100 μL של תאים לצינור חדש ולהוסיף 5 מיקרוגרם (או 5,000 ננוגרם) של mRNA CAR לתאים46. יש להוסיף את מאגר הניאון T לכמות כוללת של 125 μL ולערבב על ידי פיפטינג למעלה ולמטה.
    הערה: ניתן להגדיל את כמות ה-CAR mRNA שיש להדביק באמצעות אלקטרופורציה עד 8 מיקרוגרם (או 8,000 ננוגרם) לכל 1 x 106 תאי T מבלי להשפיע לרעה על יכולת הקיום של התא, וכמות גבוהה יותר של mRNA עשויה להוביל לביטוי CAR מוגבר46.
  7. הוסף 25 μL של חיץ ניאון T לתאי 100 μL הנותרים. זה משמש כשליטה שלילית.
  8. אלקטרופורציה של תאי T. השתמש בפיפט ניאון כדי לשאוף את תערובת תאי T / CAR mRNA או את תאי T הבקרה השליליים לתוך קצה ניאון 100 μL ולחשמל את התאים עם פולס 10 ms של 1800 V.
  9. העבירו מיד את התאים למדיום התרבית המאוזנת בצלחת 12 בארות (שהוכנה בשלב 2.2) לאחר ההתחשמלות.
  10. מחזירים את הצלחת לאינקובטור ומרחיבים את התאים עד שהם מוכנים לשימוש. כדי להבטיח צמיחה בריאה ומהירה של תאי CAR T, שמרו על צפיפות תאים בין 1-3 x 106 תאים/מ"ל עם תווך טרי עד לצורך.

3. הערכת ביטוי CAR

  1. ערבבו את תאי CAR T על ידי פיטום מעלה ומטה בעדינות מספר פעמים בכל באר, והעבירו לפחות 1 x 105 תאים לצינור FACS של 5 מ"ל.
  2. הוסף 3 מ"ל של חיץ לשטיפה קרה (PBS המכיל 2 mM EDTA ו- 0.5% w/v BSA) לצינור. צנטריפוגה את הצינור ב 500 x גרם במשך 5 דקות ב RT. להסיר את supernatant בזהירות.
  3. להשעות מחדש את גלולת התא ב 100 μL של חיץ שטיפה. הוסף 2 μL של מגיב זיהוי CAR allophycocyanin (APC)-צימוד עז אנטי אנושי IgG F(ab')2 נוגדן (ראה טבלה של חומרים) ו 2 μL של צבע קיימא 7-AAD לתוך התאים מרחפים.
    הערה: ניתן לזהות את המכונית גם באמצעות אנטיגן מטרה מסומן כראוי או נוגדן אנטי-תג אם המכונית מכילה תג (כלומר, דגל). אם נוגדן לא מסומן משמש לזיהוי CAR, נדרשת דגירה עם נוגדן משני מתאים המסומן בפלואורסצנטיות לאחר שלב 3.4.
  4. מערבבים את הדגימה על ידי ניעור עדין של הצינור ודגורים על קרח במשך 30 דקות. יש להימנע מאור במהלך הדגירה. לשטוף את התאים עם 3 מ"ל של חיץ כביסה קרה, וצנטריפוגה את הצינור ב 500 x גרם במשך 5 דקות ב RT.
  5. השליכו את הסופרנאטנט והשהו מחדש את התאים ב-100 מיקרוליטר של חיץ שטיפה. נתח את התאים באמצעות ציטומטר זרימה באופן מיידי. ודא שהתווית הפלואורסצנטית של מגיב הזיהוי וצבע הכדאיות מתוגמלים כראוי באמצעות בקרות חיוביות ושליליות מתאימות.
  6. הערך את ביטוי CAR באמצעות אסטרטגיית gating הבאה: שער על התאים באמצעות התוויית FSC-A לעומת SSC-A; שער על התאים הבודדים באמצעות תרשים FSC-A לעומת FSC-H; שער על התאים החיים באמצעות צביעת 7-AAD.
  7. חשב את אחוז תאי T החיים שהוכתמו על-ידי נוגדן IgG F(ab')2 האנטי-אנושי. השוו את תאי ה-CAR-T לתאי ה-T השליליים של הבקרה, שאמורים להיות בעלי צביעה מינימלית.

4. ניתוח תפקוד תאי CAR-T

  1. ניתוח ציטוטוקסיות
    1. יש לוודא שתאי גידול המטרה מבטאים את האנטיגן בקונפורמציה הניתנת לזיהוי על ידי ה-CAR. כדי לאשר את ביטוי האנטיגן, נתח את תאי הגידול על ידי ציטומטריית זרימה באמצעות נוגדן האב שממנו נגזר ה- CAR. אם ה-CAR אינו יכול לזהות את תאי הגידול, תאי ה-CAR-T לא יצליחו להרוג את תאי הגידול.
    2. הכינו תאי גידול מטרה המבטאים את האנטיגן של CAR על פני התא. טריפסינזציה של תאי הגידול הדבקים עם תמיסת טריפסין-EDTA 0.05% למשך דקה אחת ב-37°C והכן תרחיף של תא בודד עם מדיום תרבית מתאים בטמפרטורה של 1-4 x 105 תאים/מ"ל.
      הערה: תאי הגידול צריכים להיות דבקים היטב כדי להבטיח ניתוח מדויק בשלבים הבאים. אם תאי הגידול נצמדים בצורה גרועה, מתנתקים בקלות או גדלים בתרחיף, צפו את בארות הצלחת המשמשות בשלב הבא בנוגדן מתאים, פולימר פוליקטיוני או חומר ביולוגי כגון פיברונקטין או קולגן כדי להקל על חיבור התא.
    3. הכינו צלחת אלקטרונית (ראו טבלת חומרים). תכנן את מערך הניסוי. הוסף 50 μL של מדיום תרבית תאי גידול שחומם מראש לכל באר ומקם את לוח ה- E במכשיר ניתוח תאים בזמן אמת (RTCA) כדי למדוד עכבת רקע. מדוד את העכבה בדקה אחת לכל מדידה (או טאטוא) במשך 3 טאטואים.
      הערה: עכבת הרקע משמשת להגדרת אינדקס התא לאפס. ללא מדידת עכבת רקע, לא ניתן להשוות את הבארות זו לזו, מה שהופך את התוצאות לבלתי ניתנות לפרשנות.
    4. הסר את צלחת ה- E ממכשיר RTCA והוסף 100 μL של תרחיף תאי הגידול לכל באר. לכן, כל באר מכילה 1-4 x 104 תאים בנפח כולל של 150 μL.
      הערה: יש לקבוע את מספר תאי הגידול שיש לזרוע בכל באר לפני הניסוי. זרעו את לוח ה- E עם מגוון מספרי תאים, ולאחר מכן עקבו אחר אינדקסי התאים במהלך 24-48 השעות הבאות. מספר התאים הרצוי שומר על עלייה מתמדת באינדקס התאים למשך 24 שעות לפחות ללא מישור. זריעת תאים מוגזמת יכולה להאיץ דלדול חומרי מזון והחמצה בינונית, וכתוצאה מכך רמה מוקדמת של אינדקס התא. בנוסף, יש לכלול בארות משוכפלות עבור כל קבוצה כדי לזהות מדידות חריגות פוטנציאליות.
    5. אזנו את לוח ה-E ב-RT למשך 30 דקות. שלב זה מאפשר לתאי הגידול להתיישב ולהיצמד לתחתית הבארות.
      הערה: שלב זה נחוץ למדידה מדויקת של אינדקס התא. דילוג על שלב זה גורם בדרך כלל לשונות טובה במדידות אינדקס התא ולהיצמדות לא אחידה של תאי הגידול בתוך הבארות, וכתוצאה מכך לרעש מוגבר בבדיקה.
    6. החזירו את לוחית ה-E למכשיר RTCA ועקבו אחר אינדקסי התאים במשך כ-24 שעות, עם טאטוא שנלקח כל 5-15 דקות.
    7. למחרת, הכינו את מתלה תאי ה-CAR-T. השהה את תאי CAR-T (תאי המשפיע) משלב 2.10 במדיום RPMI 1640 בתוספת 10% FBS לריכוז שנקבע על ידי תא הגידול (תא המטרה) ויחס תאי האפקטורים:מטרה (E:T) הרצוי. לדוגמה, אם תרחיף תאי הגידול היה בצפיפות של 2 x 105 תאים/מ"ל ורצוי יחס E:T של 10:1, אז תאי CAR-T צריכים להיות מושעים ל 2 x 106 תאים / מ"ל. כלול בקרות נאותות כגון תאי גידול בלבד (ללא תאי אפקטטור) ותאי T בקרה (תאי T שהתחשמלו ללא mRNA או עם mRNA בקרה).
      הערה: לקבלת תוצאות מיטביות, השתמש בתאי CAR-T 1-2 ימים לאחר אלקטרופורציה כאשר ביטוי CAR פני השטח גבוה. כדי לחקור את יחס E:T האופטימלי, ניתן לבדוק טווח של יחסי E:T (לדוגמה, 3:1 עד 20:1). אלא אם כן תדירות ה-CAR-T נמוכה מאוד, כלומר מתחת ל-10%, יחס E:T של 10:1 או 20:1 בדרך כלל מספיק כדי להשיג הרג כמעט מוחלט של תאי הגידול.
    8. השהה את הקלטת אינדקס התא והסר את ה- E-Plate ממכשיר RTCA.
    9. הטו מעט את הצלחת, הסירו בזהירות 50 מיקרוליטר של מדיום תרבית מכל באר מבלי לגעת בתאי הגידול, והוסיפו 100 מיקרוליטר של תאי CAR-T או תאי T בקרה לכל באר.
    10. החזר את ה- E-Plate למכשיר RTCA וחדש את ניטור אינדקס התאים למשך 24 שעות לפחות עם טאטוא שנלקח כל 5-15 דקות.
      הערה: משך ניטור אינדקס התאים תלוי במהירות שבה תאי CAR-T מכוונים לתאי הגידול. תקופת דגירה של 24 שעות מספיקה בדרך כלל לתאי CAR-T כדי להפעיל השפעה ציטוטוקסית מקסימלית.
    11. עצור את ניטור אינדקס התא, הסר את ה- E-Plate ממכשיר RTCA ונתח את תוצאת ציטוטוקסיות. חישוב ציטוטוקסיות כאחוז תאי הגידול שנהרגו על ידי תאי CAR-T. חשב ציטוטוקסיות ממוצעת של תאי CAR-T ובקר בתאי T באמצעות תוכנת RTCA. כדי לחשב את ציטוטוקסיות באופן ידני, השתמש בנוסחה
      ציטוטוקסיות = ((אינדקס התא של תאי הגידול) − (אינדקס התא של תאי הגידול בתוספת תאי האפקט)) / (אינדקס התא של תאי הגידול) × 100%.
  2. ניתוח הפרשת ציטוקינים
    1. כדי לנתח את הציטוקינים כגון IFN-Υ המופרשים על ידי תאי CAR-T במהלך ניתוח ציטוטוקסיות, העבירו את הסופרנאטנט מלוח E לצלחת בעלת תחתית עגולה או בצורת V בעלת 96 בארות.
      הערה: אם יש צורך בניתוח מהלך זמן של הפרשת הציטוקינים, השהה את ניטור אינדקס התא בשלב 4.1.10, אסוף חלק קטן מהסופרנאטנט מכל באר, החזיר את לוח ה- E בחזרה למכשיר RTCA וחדש את הניטור.
    2. צנטריפוגה את צלחת 96 הבארות ב 300 x גרם במשך 5 דקות ב RT. בזהירות להעביר את supernatants לצלחת חדשה 96 באר מבלי להפריע את כדורי התא.
    3. מדדו את רמות הציטוקינים בסופרנאטנטים באמצעות ערכות מסחריות לבדיקת אימונוסורבנט מקושרת אנזימים (ELISA) בהתאם להוראות היצרן. הסופרנאטנטים בדרך כלל דורשים דילול לפני המדידה, לפעמים פי 100, תלוי בציטוקינים המנותחים.
    4. נתח את הנתונים על-ידי אינטרפולציה של ערכי ספיגת הדגימה מול עקומה סטנדרטית הנוצרת מתקנים בדילול סדרתי. הכן גרפים עם קווי שגיאה המייצגים את הממוצע ± סטיית תקן (SD) באמצעות תוכנה מתאימה. כדי להשוות את ההבדל בין הטיפולים, ניתן לבצע מבחן לא של סטודנט. ערך p קטן מ-0.05 נחשב בדרך כלל למובהק סטטיסטית.
      הערה: יש לא לכלול בניתוח נקודות נתונים שהן חריגות ברורות, ככל הנראה עקב טעויות ניסוי.

תוצאות

בנינו מכונית ממוקדת HER2 מהדור השני המכילה scFv שנגזר מהנוגדן החד-שבטי המואנש נגד HER2 (mAb) 4D547, אזור טרנסממברנלי, ותחום קוסטימולטורי תוך-תאי 4-1BB ואחריו תחום ההפעלה CD3ζ (איור 1A). רצף הדנ"א המקודד את המכונית הכיל מקדם SP6 בגודל 5' כדי להניע שעתוק של ה-mRNA ?...

Discussion

במחקר זה, אנו מתארים גישה מפורטת לא ויראלית ולא משולבת ליצירת תאי CAR-T חולפים ומספקים הליכים טכניים להערכת תפקוד תאי CAR-T. גישה זו נמנעת משימוש בווקטורים רטרו-ויראליים ולנטי-ויראליים קונבנציונליים להעברת טרנסגנים קבועה ואקראית של CAR, ובמקום זאת ממנפת אלקטרופורציה כדי להחד...

Disclosures

המחברים ליאנג הו, רוברט ברהוביץ', יאנווי הואנג, שיימינג ז'אנג, ג'יניינג סאן, שיאנגהונג ליו, הואה ג'ואו, שירלי, שו, האוצ'י לי ויטה גולובסקאיה הם עובדים של ProMab Biotechnologies. Lijun Wu הוא עובד ובעל מניות של ProMab Biotechnologies.

Acknowledgements

עבודה זו נתמכה על ידי ProMab Biotechnologies.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
7-AAD viability dye Biolegend420404
ACEA Novocyte flow cytometerAgilentNovoCyte 3000
AIM-V mediumGibco12055083
APC goat anti-human IgG F(ab')2 antibodyJackson ImmunoResearch Laboratories109-136-097
BglII Restriction EnzymeNew England BioLabs (NEB)R0144L
3´-O-Me-m7G(5')ppp(5')G RNA Cap Structure AnalogNEBS1411S
DMEM, high glucoseGibco11965092
Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28 beadsGibco11131D
E-Plate 96Agilent5232376001
EthanolSigma459844-4L
FBSLonza.com14-503F
HiScribe SP6 RNA Synthesis KitNew England BioLabs (NEB)E2070S
Human IL-2 Recombinant ProteinGibco15140122
Millennium RNA MarkersInvitrogenAM7150
Monarch RNA Cleanup Kit (500 μg)NEBT2050L
N1-Methylpseudo-UTPTrilinkN-1081-10
Neon Transfection InstrumentInvitrogenMPK5000
Neon Transfection System 100-μL KitInvitrogenMPK10096
Penicillin-Streptomycin (10000 U/mL)Gibco14-503F
RPMI 1640 MediumGibco11875135
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol redGibco25300120
UltraPure Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol (25:24:1, v/v)Invitrogen15593049
xCELLigence Real-Time Cell Analysis (RTCA) instrumentAgilentRTCA MP
ZymoPURE II Plasmid Midiprep KitZymo ResearchD4201

References

  1. Ataeinia, B., et al. National and subnational incidence, mortality, and years of life lost due to breast cancer in iran: Trends and age-period-cohort analysis since 1990. Front Oncol. 11, 561376 (2021).
  2. Jordan, R. M., Oxenberg, J. . Breast cancer conservation therapy. , (2024).
  3. Tannock, I. F. Combined modality treatment with radiotherapy and chemotherapy. Radiother Oncol. 16 (2), 83-101 (1989).
  4. Mcree, A. J., Cowherd, S., Wang, A. Z., Goldberg, R. M. Chemoradiation therapy in the management of gastrointestinal malignancies. Future Oncol. 7 (3), 409-426 (2011).
  5. Palumbo, M. O., et al. Systemic cancer therapy: Achievements and challenges that lie ahead. Front Pharmacol. 4, 57 (2013).
  6. Mitra, A., et al. From bench to bedside: The history and progress of car t cell therapy. Front Immunol. 14, 1188049 (2023).
  7. Lim, W. A., June, C. H. The principles of engineering immune cells to treat cancer. Cell. 168 (4), 724-740 (2017).
  8. Silveira, C. R. F., et al. Cytokines as an important player in the context of car-t cell therapy for cancer: Their role in tumor immunomodulation, manufacture, and clinical implications. Front Immunol. 13, 947648 (2022).
  9. Labanieh, L., Majzner, R. G., Mackall, C. L. Programming car-t cells to kill cancer. Nat Biomed Eng. 2 (6), 377-391 (2018).
  10. Sadelain, M., Brentjens, R., Riviere, I. The basic principles of chimeric antigen receptor design. Cancer Discov. 3 (4), 388-398 (2013).
  11. Tokarew, N., Ogonek, J., Endres, S., Von Bergwelt-Baildon, M., Kobold, S. Teaching an old dog new tricks: Next-generation car t cells. Br J Cancer. 120 (1), 26-37 (2019).
  12. Kochenderfer, J. N., et al. Eradication of b-lineage cells and regression of lymphoma in a patient treated with autologous t cells genetically engineered to recognize cd19. Blood. 116 (20), 4099-4102 (2010).
  13. Brentjens, R. J., et al. Safety and persistence of adoptively transferred autologous cd19-targeted t cells in patients with relapsed or chemotherapy refractory b-cell leukemias. Blood. 118 (18), 4817-4828 (2011).
  14. Tomasik, J., Jasinski, M., Basak, G. W. Next generations of car-t cells - new therapeutic opportunities in hematology. Front Immunol. 13, 1034707 (2022).
  15. Asmamaw Dejenie, T., et al. Current updates on generations, approvals, and clinical trials of car t-cell therapy. Hum Vaccin Immunother. 18 (6), 2114254 (2022).
  16. Sun, W., Jiang, Z., Jiang, W., Yang, R. Universal chimeric antigen receptor t cell therapy - the future of cell therapy: A review providing clinical evidence. Cancer Treat Res Commun. 33, 100638 (2022).
  17. Wang, X., Riviere, I. Clinical manufacturing of car t cells: Foundation of a promising therapy. Mol Ther Oncolytics. 3, 16015 (2016).
  18. Pinto, I. S., Cordeiro, R. A., Faneca, H. Polymer- and lipid-based gene delivery technology for car t cell therapy. J Control Release. 353, 196-215 (2023).
  19. Magnani, C. F., et al. Sleeping beauty-engineered car t cells achieve antileukemic activity without severe toxicities. J Clin Invest. 130 (11), 6021-6033 (2020).
  20. Irving, M., Lanitis, E., Migliorini, D., Ivics, Z., Guedan, S. Choosing the right tool for genetic engineering: Clinical lessons from chimeric antigen receptor-t cells. Hum Gene Ther. 32 (19-20), 1044-1058 (2021).
  21. Moretti, A., et al. The past, present, and future of non-viral car t cells. Front Immunol. 13, 867013 (2022).
  22. Song, H. W., et al. Car-t cell expansion platforms yield distinct t cell differentiation states. Cytotherapy. 26 (7), 757-768 (2024).
  23. Stephenson, M., Grayson, W. Recent advances in bioreactors for cell-based therapies. F1000Res. 7, (2018).
  24. Micklethwaite, K. P., et al. Investigation of product-derived lymphoma following infusion of piggybac-modified cd19 chimeric antigen receptor t cells. Blood. 138 (16), 1391-1405 (2021).
  25. Ghilardi, G., et al. T cell lymphoma and secondary primary malignancy risk after commercial car t cell therapy. Nat Med. 30 (4), 984-989 (2024).
  26. Steffin, D. H. M., et al. Long-term follow-up for the development of subsequent malignancies in patients treated with genetically modified iecs. Blood. 140 (1), 16-24 (2022).
  27. Cappell, K. M., et al. Long-term follow-up of anti-cd19 chimeric antigen receptor t-cell therapy. J Clin Oncol. 38 (32), 3805-3815 (2020).
  28. Cordeiro, A., et al. Late events after treatment with cd19-targeted chimeric antigen receptor modified t cells. Biol Blood Marrow Transplant. 26 (1), 26-33 (2020).
  29. Zhao, A., et al. Secondary myeloid neoplasms after cd19 car t therapy in patients with refractory/relapsed b-cell lymphoma: Case series and review of literature. Front Immunol. 13, 1063986 (2022).
  30. Verdun, N., Marks, P. Secondary cancers after chimeric antigen receptor t-cell therapy. N Engl J Med. 390 (7), 584-586 (2024).
  31. Ruella, M., et al. Induction of resistance to chimeric antigen receptor t cell therapy by transduction of a single leukemic b cell. Nat Med. 24 (10), 1499-1503 (2018).
  32. Bishop, D. C., et al. Development of car t-cell lymphoma in 2 of 10 patients effectively treated with piggybac-modified cd19 car t cells. Blood. 138 (16), 1504-1509 (2021).
  33. Shah, N. N., et al. Clonal expansion of car t cells harboring lentivector integration in the cbl gene following anti-cd22 car t-cell therapy. Blood Adv. 3 (15), 2317-2322 (2019).
  34. Fraietta, J. A., et al. Disruption of tet2 promotes the therapeutic efficacy of cd19-targeted t cells. Nature. 558 (7709), 307-312 (2018).
  35. Heinrich, T., et al. Mature t-cell lymphomagenesis induced by retroviral insertional activation of janus kinase 1. Mol Ther. 21 (6), 1160-1168 (2013).
  36. Harrison, S. J., et al. Car+ t-cell lymphoma post ciltacabtagene autoleucel therapy for relapsed refractory multiple myeloma. Blood. 142 (Supplement 1), 6939-6939 (2023).
  37. FDA Administration. . Fda requires boxed warning for t cell malignancies following treatment with bcma-directed or cd19-directed autologous chimeric antigen receptor (car) t cell immunotherapies. , (2024).
  38. Elsallab, M., et al. Second primary malignancies after commercial car t-cell therapy: Analysis of the fda adverse events reporting system. Blood. 143 (20), 2099-2105 (2024).
  39. Levine, B. L., et al. Unanswered questions following reports of secondary malignancies after car-t cell therapy. Nat Med. 30 (2), 338-341 (2024).
  40. Tward, J. D., Wendland, M. M., Shrieve, D. C., Szabo, A., Gaffney, D. K. The risk of secondary malignancies over 30 years after the treatment of non-hodgkin lymphoma. Cancer. 107 (1), 108-115 (2006).
  41. Kumar, V., et al. Trends in the risk of second primary malignancies among survivors of chronic lymphocytic leukemia. Blood Cancer J. 9 (10), 75 (2019).
  42. Holtkamp, S., et al. Modification of antigen-encoding rna increases stability, translational efficacy, and t-cell stimulatory capacity of dendritic cells. Blood. 108 (13), 4009-4017 (2006).
  43. Dvir, S., et al. Deciphering the rules by which 5'-utr sequences affect protein expression in yeast. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (30), E2792-E2801 (2013).
  44. Van Der Velden, A. W., Voorma, H. O., Thomas, A. A. Vector design for optimal protein expression. Biotechniques. 31 (3), 572-580 (2001).
  45. Jaatinen, T., Laine, J. Isolation of mononuclear cells from human cord blood by ficoll-paque density gradient. Curr Protoc Stem Cell Biol. Chapter 2 (Unit 2A), 1 (2007).
  46. Zhao, Y., et al. High-efficiency transfection of primary human and mouse t lymphocytes using rna electroporation. Mol Ther. 13 (1), 151-159 (2006).
  47. Carter, P., et al. Humanization of an anti-p185her2 antibody for human cancer therapy. Proc Natl Acad Sci U S A. 89 (10), 4285-4289 (1992).
  48. Hu, L., et al. Her2-cd3-fc bispecific antibody-encoding mrna delivered by lipid nanoparticles suppresses her2-positive tumor growth. Vaccines. 12 (7), 808 (2024).
  49. Perales-Puchalt, A., et al. DNA-encoded bispecific t cell engagers and antibodies present long-term antitumor activity. JCI Insight. 4 (8), e126086 (2019).
  50. Schwanhausser, B., et al. Global quantification of mammalian gene expression control. Nature. 473 (7347), 337-342 (2011).
  51. Kozak, M. Features in the 5' non-coding sequences of rabbit alpha and beta-globin mrnas that affect translational efficiency. J Mol Biol. 235 (1), 95-110 (1994).
  52. Wu, Q., et al. Translation affects mrna stability in a codon-dependent manner in human cells. Elife. 8, e45396 (2019).
  53. Henderson, J. M., et al. Cap 1 messenger rna synthesis with co-transcriptional cleancap((r)) analog by in vitro transcription. Curr Protoc. 1 (2), e39 (2021).
  54. Kariko, K., et al. Incorporation of pseudouridine into mrna yields superior nonimmunogenic vector with increased translational capacity and biological stability. Mol Ther. 16 (11), 1833-1840 (2008).
  55. Gehl, J. Electroporation: Theory and methods, perspectives for drug delivery, gene therapy and research. Acta Physiol Scand. 177 (4), 437-447 (2003).
  56. Stacey, M., Fox, P., Buescher, S., Kolb, J. Nanosecond pulsed electric field induced cytoskeleton, nuclear membrane and telomere damage adversely impact cell survival. Bioelectrochemistry. 82 (2), 131-134 (2011).
  57. Meaking, W. S., Edgerton, J., Wharton, C. W., Meldrum, R. A. Electroporation-induced damage in mammalian cell DNA. Biochim Biophys Acta. 1264 (3), 357-362 (1995).
  58. Zhang, J., et al. Non-viral, specifically targeted car-t cells achieve high safety and efficacy in b-nhl. Nature. 609 (7926), 369-374 (2022).
  59. Von Auw, N., et al. Comparison of two lab-scale protocols for enhanced mrna-based car-t cell generation and functionality. Sci Rep. 13 (1), 18160 (2023).
  60. Gauthier, J., Turtle, C. J. Insights into cytokine release syndrome and neurotoxicity after cd19-specific car-t cell therapy. Curr Res Transl Med. 66 (2), 50-52 (2018).
  61. Beatty, G. L., et al. Activity of mesothelin-specific chimeric antigen receptor t cells against pancreatic carcinoma metastases in a phase 1 trial. Gastroenterology. 155 (1), 29-32 (2018).
  62. Beatty, G. L., et al. Mesothelin-specific chimeric antigen receptor mrna-engineered t cells induce anti-tumor activity in solid malignancies. Cancer Immunol Res. 2 (2), 112-120 (2014).
  63. Tchou, J., et al. Safety and efficacy of intratumoral injections of chimeric antigen receptor (car) t cells in metastatic breast cancer. Cancer Immunol Res. 5 (12), 1152-1161 (2017).
  64. Wu, J., Wu, W., Zhou, B., Li, B. Chimeric antigen receptor therapy meets mrna technology. Trends Biotechnol. 42 (2), 228-240 (2024).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

216mRNARTCAHER2

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved