JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Bu protokol, kanser immünoterapisi için entegre olmayan mRNA kullanarak geçici kimerik antijen reseptörü (CAR) T hücreleri oluşturmak için ayrıntılı bir prosedürü ana hatlarıyla belirtir ve CAR-T hücrelerini ve sitotoksik işlevlerini değerlendirmek için güvenilir yöntemler sağlar.

Özet

Kimerik antijen reseptörü (CAR) T hücre tedavisi, lenfomalar ve lösemiler gibi belirli hematolojik malignitelerin tedavisinde benzeri görülmemiş bir başarı elde eden öncü bir kanser tedavisi olarak ortaya çıkmıştır. Bununla birlikte, daha fazla kanser hastası CAR-T hücre tedavileri aldıkça, kısmen beklenmedik CAR transgen eklenmesi nedeniyle tedaviyle ilişkili ikincil primer maligniteler giderek daha fazla rapor edilmekte ve bu da ciddi güvenlik endişelerini artırmaktadır. Bu sorunu çözmek için, burada mRNA kullanarak geçici CAR-T hücreleri oluşturmak için viral olmayan, entegre olmayan bir yaklaşımı açıklıyoruz. İnsan epidermal büyüme faktörü reseptörü 2'ye (HER2) özgü CAR'ı kodlayan modifiye mRNA ile T hücrelerini elektropore ettik ve geçici HER2 hedefli CAR-T hücreleri ürettik. CAR, elektroporasyondan 1 gün sonra T hücre yüzeyinde verimli bir şekilde eksprese edildi, 2. günde arttı ve 5. günde önemli ölçüde azaldı. Geçici CAR-T hücreleri, HER2 pozitif SKOV-3 yumurtalık kanseri hücrelerine karşı güçlü sitotoksisite sergiledi ve yüksek seviyelerde IFN-Υ salgıladı. Bu protokol, kalıcı CAR transgen entegrasyonu olmadan küçük ölçekli geçici CAR-T hücrelerinin geliştirilmesi için adım adım bir kılavuz sağlar, CAR mRNA'nın hazırlanması, T hücrelerinin aktivasyonu ve transfeksiyonu, CAR ekspresyonunun değerlendirilmesi ve CAR-T hücre fonksiyonunun in vitro analizi. Bu yöntem, hem klinik öncesi hem de klinik çalışmalarda geçici CAR-T hücre üretimi için uygundur.

Giriş

Kanser, dünya çapında yılda tahmini 23,6 milyon yeni teşhis edilen vaka ve 10 milyon ölümle insan sağlığı için giderek daha önemli bir tehdit haline gelmektedir1. Radyasyon ve kemoterapi ile birlikte cerrahi tedavi, çeşitli lokalize, noninvaziv ve invaziv kanser türleri için altın bakım standardı olmaya devam etmektedir 2,3,4. Geleneksel sistematik tedavi erken evre kanserlerin tedavisinde muazzam bir başarı elde etmiş olsa da, çok toksiktir ve metastatik ve hematolojik kanserler üzerinde sınırlı bir etkiye sahiptir5. Bu kanserli hastalar sık sık tedavi görürler ve hastalığın ilerlemesini stabilize etme ve geciktirme umuduyla önemli toksisiteye katlanırlar. Kimerik antijen reseptörü (CAR) T hücre tedavisi, son zamanlarda B hücreli hematolojik kanserler için güçlü etkinlik gösteren ve bu çaresiz hastalara umut veren devrim niteliğinde bir hedefe yönelik tedavi olarak ortaya çıkmıştır6.

CAR-T hücreleri, hücre yüzeyinde tümörle ilişkili antijenleri (TAA'lar) spesifik olarak tanıyan ve majör histouyumluluk kompleksi proteinlerinden (MHC'ler) antijenik sunum gerektirmeden hücreleri aktive eden bir CAR eksprese eden tasarlanmış T lenfositleridir7. Aktivasyon üzerine, CAR-T hücreleri, MHC'lerden bağımsız olarak bir sitokin paneli ve lizaz tümör hücreleri salgılar, böylece immünosüpresif tümör mikroçevresi nedeniyle MHC'ler aşağı regüle edildiğinde veya kaybedildiğinde bile tümörlerin yıkımını arttırır 8,9. CAR'lar en az üç farklı alandan oluşur - TAA'ya özgü bir antikorun antijeni tanıyan değişken bölgelerini içeren bir hücre dışı tek zincirli fragman varyantı (scFv), CAR'ı hücre yüzeyine sabitleyen bir transmembran alanı ve adaptör protein alımına ve aşağı akış sinyalizasyonuna aracılık eden bir hücre içi alan10. Hücre içi alanlardaki varyasyonlara dayanarak, CAR yapıları şimdiye kadar beş nesil boyunca evrimleşmiştir, ilk nesil sadece CD3ζ aktivasyon alanını içerir ve sonraki nesiller 4-1BB ve CD28 gibi moleküllerden bir veya daha fazla ekstra uyarıcı alana sahiptir11. Bu hücre içi alanlar, birlikte klinik antitümör etkinliğini belirleyen CAR-T hücre sinyal mekanizmalarını, proliferasyonu, sağkalımı ve toksisiteyi etkiler. CAR-T hücre tedavisinin klinik başarısı, B hücreli lösemileri ve lenfomaları tedavi etmek için B-soy hücrelerinde yüksek oranda eksprese edilen bir biyobelirteç olan CD19'u spesifik olarak hedefleyen ikinci nesil CAR-T hücrelerinden gelir12,13. Bugüne kadar, Gıda ve İlaç Dairesi (FDA), büyük B hücreli lenfoma, manto hücreli lenfoma ve multipl miyelom 6 dahil olmak üzere nüks veya refrakter hematolojik maligniteler için CD-19 veya B hücresi olgunlaşma antijenini (BCMA) hedefleyen altı ikinci nesil CAR-T hücre tedavisini onaylamıştır. Yeni nesil CAR-T hücreleri şu anda yoğun preklinik ve klinik çalışmalardan geçmektedir14,15.

CAR-T hücrelerinin klinik üretimi karmaşık, pahalı ve zaman alıcı bir süreçtir. Şu anda, CAR-T hücre hazırlığı için kullanılan lökositler, donör kaynaklı evrensel (veya kullanıma hazır) CAR-T hücreleri aktif geliştirme ve klinik değerlendirme altında olmasına rağmen, allojenik reaksiyonlardan kaçınmak için hastaların kendilerinden gelmektedir16. Lökositlerin hastanın periferik kanından lökoferez ile izole edilmesinin ardından, CAR'ı kodlayan yabancı bir gen fragmanı, viral veya viral olmayan yaklaşımlar kullanılarak aktive edilmiş T hücrelerine verilir 17,18,19. Retrovirüsler ve lentivirüsler, CAR kodlayan DNA'nın T hücresi genomuna rastgele ve kalıcı entegrasyonu ile sonuçlanan CAR gen iletimi için en yaygın viral vektörlerdir20. mRNA-lipid nanopartikülleri, transpozon sistemleri ve CRISPR/Cas9 genom düzenleme dahil olmak üzere viral olmayan yaklaşımlar daha az yaygındır21. Daha sonra, CAR eksprese eden T hücreleri ex vivo olarak büyük ölçekte genişletilir ve daha sonra toplanır ve hastalara geri verilir22,23. Sıkı İyi Üretim Uygulamaları (GMP) standartlarını karşılayan viral vektörlerin üretimi çok zor, karmaşık ve maliyetlidir, üreticiler, düzenleyici kurumlar ve hastalar üzerinde önemli bir yük oluşturur ve böylece yaygın klinik uygulamasını sınırlar.

CAR-T tedavisinin heyecan verici başarısına rağmen, güvenliği konusunda artan bir endişe var. Viral veya transpozon transdüksiyonu sırasında CAR transgen entegrasyonunun T hücresi genomuna rastgele doğası göz önüne alındığında, tümör baskılayıcı genlerin bozulması veya onkogenlerin aktivasyonu meydana gelebilir ve bu da T hücrelerinin malign transformasyonuna yol açabilir24,25. FDA'nın 2017 yılında ilk CAR-T hücre tedavisi ürününü onaylamasından bu yana, takip çalışmaları, tedaviyi alan hastaların %15'inin T hücreli lenfoma (TCL), küçük hücreli dışı akciğer kanseri (NSCLC) ve cilt kanseri gibi ikincil primer maligniteler (SPM'ler) geliştirdiğini göstermektedir 26,27,28,29. Çarpıcı bir şekilde, CAR transgenleri bazı SPM'lerde30,31 yüksek oranda tespit edildi ve bazı TCL vakaları doğrudan CAR-T hücrelerinin 24,32,33 anormal genişlemesinden kaynaklandı, bu da CAR-T ürünlerinin bazı SPM'leri indüklemede doğrudan bir rolü olduğunu gösteriyor. Diğer çalışmalar, SPM tümör hücrelerinde TET234, JAK135 ve PBX236 gibi kritik genlerde CAR transgen eklemelerini daha fazla tanımladı. CAR-T hücre tedavisini takiben T hücresi malignitelerinin biriken kanıtları ışığında, FDA yakın zamanda şu anda onaylanmış tüm CD19'a yönelik ve BCMA hedefli CAR-T hücre tedavileri için ciddi bir T hücresi malignitesi riskini vurgulayan kutulu bir uyarının gerekli olduğu sonucuna varmıştır37. Bununla birlikte, CAR-T tedavisinin uzun vadeli etkilerini takip eden geniş kohort çalışmaları, tedavi edilen hastalar arasında %3,8 ila %15 arasında değişen bir SPM insidansı bildirmektedir 26,27,28,38,39. İnsidans, geleneksel sistematik tedavi alan kan kanseri hastalarında gözlemlenenden önemli ölçüde daha yüksek değildir40,41, bu da CAR-T hücre tedavisi için nispeten güvenli bir profil olduğunu düşündürmektedir. Bununla birlikte, daha uygun maliyetli yaklaşımlarla SPM riskini en aza indiren güvenli ve etkili CAR-T hücrelerinin geliştirilmesine acil bir ihtiyaç vardır.

Burada, CAR-T hücreleri oluşturmak için viral olmayan, entegre olmayan bir yaklaşım için ayrıntılı bir protokol açıklıyoruz. Amaç, geçici CAR ekspresyonu ile küçük ölçekli, etkili CAR-T hücreleri oluşturmak için basit, adım adım bir kılavuz sağlamak, böylece insersiyonel mutajenezi önlemek ve SPM riskini en aza indirmektir. TAA HER2'ye özgü bir CAR'ı kodlayan modifiye mRNA ile T hücrelerinin elektroporasyonunun, T hücresi yüzeyinde anti-HER2 CAR'ın sağlam ve geçici ekspresyonu ile sonuçlandığını gösterdik. CAR'ı eksprese ederken, T hücreleri HER2 pozitif tümör hücrelerini güçlü bir şekilde öldürdü ve yüksek düzeyde IFN-Υ salgıladı. Protokol, CAR mRNA'nın hazırlanmasını, T hücresinin aktivasyonunu ve elektroporasyonunu, CAR ekspresyonunun değerlendirilmesini ve CAR-T hücre fonksiyonunun analizini içeren dört ayrı ancak sürekli bölümde açıklanmaktadır. Bu yaklaşım, hem akademik araştırma hem de klinik hücre tedavileri için geçici CAR-T hücrelerinin geliştirilmesi ve üretilmesi için uygundur.

Protokol

Burada kullanılan PBMC'ler, daha önce42'den önce açıklanan Ficoll-Paque yoğunluk gradyanı kullanılarak Kurumsal İnceleme Kurulu (IRB) onaylı protokole (13942) göre Stanford Hastanesi Kan Merkezi'nden alınan tam kandan izole edilmiştir. PBMC'leri toplamak için kullandığımız kan, Stanford Hastanesi Kan Merkezi'nden ticari olarak elde edildiğinden, katılımcıların bilgilendirilmiş onamları geçerli değildi.

1. CAR mRNA'nın Hazırlanması

  1. Şablon hazırlama
    NOT: Doğrusallaştırılmış bir plazmit veya bir PCR fragmanı, uygun bir 5' SP6 veya T7 promotörü, 5' çevrilmemiş bölge (UTR), bir CAR transgeni ve uygun bir poli(A) kuyruğuna sahip bir 3'UTR içermeleri koşuluyla, in vitro CAR mRNA'yı sentezlemek için bir şablon görevi görebilir. Bu çalışmada, bir SP6 promotörü, kısa bir insan beta-globin 5'UTR, bir CAR transgeni ve iki tandem beta-globin 3'UTR'den oluşan bir 3'UTR ve ardından 112-bp poli (A) kuyruğu43 içeren bir CAR plazmid DNA yapısı kullandık. UTR'ler, kodlama dizisi ve poli(A) kuyruğunun tümü RNA stabilitesini ve translasyon verimliliğinietkiler 43,44,45. 120 bp'lik bir poli (A) kuyruğunun, daha kısa poli (A) kuyruklarına43 kıyasla hücre kültüründe protein verimini arttırdığı gösterilmiştir.
    1. Üreticinin talimatlarına göre bir plazmit hazırlama kiti kullanarak CAR yapı plazmid DNA'sını hazırlayın. Yüksek kaliteli plazmid DNA, yüksek verim CAR mRNA üretmek için gereklidir.
    2. CAR plazmid DNA'sını kısıtlama enzimi BglII ile doğrusallaştırın. Poli(A) kuyruğundan sonra, tercihen poli(A) kuyruğunun sonuna yakın kesen bir kısıtlama enzimi seçin. 10 μg (veya 10.000 ng), 10 μL enzim, 10 μL sindirim tamponu ve nükleaz içermeyen su içeren 100 μL'lik bir reaksiyon karışımında bir spektrofotometre ile ölçülen plazmitin 37 ° C'de gece boyunca sindiril.
      NOT: Kısıtlama enziminin CAR transgeni ve onun yan promotor, UTR ve poli(A) kuyruk dizileri içinde kesilmediğinden emin olun. Verimli CAR mRNA transkripsiyonu için CAR plazmidinin tamamen doğrusallaştırılması gereklidir.
    3. Sindirim karışımına 200 μg/mL proteaz K ve %0,5 w/v SDS ekleyin ve 50 °C'de 1 saat inkübe edin.
    4. Doğrusallaştırılmış CAR plazmit DNA'sını saflaştırın. Sindirim reaksiyonuna eşit hacimde fenol: kloroform: izoamil alkol (25:24:1, h/h) ekleyin. Yaklaşık 15 saniye boyunca kuvvetlice girdap. Numuneyi tezgah üstü bir santrifüjde oda sıcaklığında (RT) 5 dakika boyunca maksimum hızda döndürün.
    5. DNA'yı içeren üst sulu tabakayı yeni bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Protein ve fenol safsızlıkları içeren orta ve alt katmanların herhangi birinin transferinden kaçının. Safsızlıkları azaltmak için kloroform ile ikinci bir ekstraksiyon turu gerçekleştirin.
    6. 1/10'uncu hacimde 7.5 M amonyum asetat veya 3 M sodyum asetat ekleyin ve hafifçe karıştırın. DNA'yı çökeltmek için 2.5 hacim etanol ekleyin. Numuneyi -20 °C'de en az 30 dakika saklayın.
    7. DNA'yı peletlemek için numuneyi 4 °C'de 15 dakika boyunca maksimum hızda döndürün. Süpernatanı dikkatlice çıkarın. DNA peletini yıkamak için 500 μL %70 etanol ekleyin.
    8. Numuneyi 4 °C'de 2 dakika tekrar döndürün. Süpernatanı dikkatlice çıkarın. Tüpte az miktarda çözelti bırakın.
    9. Sıkma işlemini 4°C'de 2 dakika boyunca tekrarlayın. Kalan süpernatanı dikkatlice çıkarın. DNA peletini RT'de steril bir başlıkta yaklaşık 10 dakika boyunca tüpün dibinde etanol çözeltisi görünmeyene kadar havayla kurutun.
      NOT: Çözülmesi zor olabileceğinden DNA peletini aşırı kurutmaktan kaçının.
    10. 20 μL nükleaz içermeyen su ekleyin ve DNA'yı çözmek için hafifçe yukarı ve aşağı pipetleyin. Numuneyi maksimum hızda kısa bir süre santrifüjleyin. DNA konsantrasyonunu bir spektrofotometre ile ölçün.
    11. Numuneyi hemen kullanım için buz üzerinde veya ileride kullanmak üzere -20 °C'de saklayın. Saflaştırılmış DNA'nın 100 ng'ını bir agaroz jel üzerine yükleyin ve boyutunu ve bütünlüğünü doğrulayın. DNA, beklenen boyutta tek, farklı bir bant olarak görünmelidir. Fazladan veya lekeli bantlara dikkat edilmemelidir.
      NOT: Şablon DNA'nın kalitesi, verimli mRNA transkripsiyonu için kritik öneme sahiptir. mRNA transkripsiyonu için bir şablon olarak saf olmayan, parçalanmış ve bozulmuş DNA'yı kullanmaktan kaçının.
  2. İn vitro transkripsiyon (IVT)
    1. CAR mRNA'yı in vitro olarak sentezleyin. Prosedürler boyunca nükleaz içermeyen reaktifler, tüpler ve pipet uçları kullandığınızdan emin olun.
    2. Kullanıma kadar -20 ° C'de saklanması gereken SP6 RNA polimeraz karışımı dışında, Tablo 1'de listelenen reaktifleri RT'ye çözün. Transkripsiyon reaksiyonunu RT'de Tablo 1'de gösterilen sırayla hazırlayın. Yavaşça karıştırın ve 37 ° C'de en az 2 saat inkübe edin.
      NOT: Reaksiyon, gereken mRNA miktarına bağlı olarak yukarı veya aşağı ölçeklendirilebilir. Yukarıda gösterilen reaksiyon, yüksek kaliteli şablon DNA kullanıldığında tipik olarak en az 100 μg (veya 100.000 ng) kapaklı mRNA verir. Daha uzun inkübasyon, yani gece boyunca, mRNA verimini artırabilir.
    3. Reaksiyona 2 μL RNaz içermeyen DNaz I ekleyin, hafifçe karıştırın ve şablon DNA'yı bozmak için 37 ° C'de 15 dakika inkübe edin.
    4. Kopyalanan CAR mRNA'yı bir RNA Temizleme Kiti kullanarak saflaştırın (bkz. Malzeme Tablosu). Arıtma için kit üreticisinin talimatlarına uyun. mRNA'yı nükleaz içermeyen suda elute edin.
      NOT: mRNA, yukarıda gösterilen fenol-kloroform ekstraksiyon yöntemi kullanılarak da saflaştırılabilir (adım 1.1.4).
    5. mRNA konsantrasyonunu bir spektrofotometre ile ölçün. Bir agaroz jel üzerine en az 200 ng mRNA yükleyin ve boyutunu ve bütünlüğünü doğrulayın. mRNA, herhangi bir ek veya lekeli bant olmaksızın, beklenen boyutta baskın bir bant olarak görünmelidir. mRNA'yı kullanana kadar -80 °C'de saklayın.

2. T Hücresinin aktivasyonu ve elektroporasyonu

  1. 1 x 106 dondurularak korunmuş insan periferik kan mononükleer hücrelerini (PBMC'ler) 1 mL CAR-T ortamında (% 10 fetal sığır serumu (FBS), penisilin / streptomisin ve 10 ng / ml insan rekombinant IL-2 ile desteklenmiş AIM-V ortamı) askıya alın. T hücrelerini eşit sayıda önceden yıkanmış İnsan T-Aktivatörü CD3 / CD28 boncukları ile aktive edin (bkz. Malzeme Tablosu). Hücreleri 37 ° C'de% 5 CO2 içeren nemlendirilmiş bir inkübatörde birkaç gün boyunca kültürleyin ve genişletin.
    NOT: PBMC'lerin miktarı, sonraki deneyler için gereken T hücrelerinin miktarına bağlı olarak yukarı veya aşağı ölçeklendirilebilir.
  2. Buz üzerinde hazırlanan CAR mRNA'yı çözdürün. 12 oyuklu bir plakanın iki oyuğuna oyuk başına 1 mL CAR-T ortamı ekleyin ve plakayı 37 °C'de inkübatöre yerleştirerek ortamı dengeleyin.
  3. 5 x 106 T hücreleri steril bir tüpe aktarın ve tüpü manyetik bir standa koyarak ve hücre süspansiyonunu yeni bir tüpe dikkatlice pipetleyerek boncukları çıkarın.
  4. Tüpü RT'de 5 dakika boyunca 300 x g'da santrifüjleyin. Süpernatanı atın ve hücre peletini 1 mL steril PBS'de yeniden süspanse edin.
  5. Tüpü tekrar santrifüj edin. Süpernatanı atın ve hücreleri 200 μL Neon tampon T içinde yeniden süspanse edin (Malzeme Tablosuna bakınız).
  6. 100 μL hücreyi yeni bir tüpe pipetleyin ve hücrelere 5 μg (veya 5.000 ng) CAR mRNA ekleyin46. Neon tampon T'yi toplam 125 μL'ye kadar destekleyin ve yukarı ve aşağı pipetleyerek karıştırın.
    NOT: Elektroporasyon ile transfekte edilecek CAR mRNA miktarı, hücre canlılığını olumsuz etkilemeden 1 x 106 T hücre başına 8 μg'ye (veya 8.000 ng) kadar arttırılabilir ve daha yüksek miktarda mRNA, CAR ekspresyonununartmasına neden olabilir 46.
  7. Kalan 100 μL hücrelere 25 μL Neon tampon T ekleyin. Bu, negatif kontrol görevi görür.
  8. T hücrelerini elektropoze edin. T hücrelerini/CAR mRNA karışımını veya negatif kontrol T hücrelerini Neon 100 μL'lik bir uca aspire etmek için Neon Pipeti kullanın ve hücreleri 10 ms'lik 1800 V'luk bir darbeyle elektropore edin.
  9. Elektroporasyondan sonra hücreleri hemen 12 oyuklu plakadaki (adım 2.2'de hazırlanan) dengelenmiş kültür ortamına aktarın.
  10. Plakayı inkübatöre geri koyun ve kullanıma hazır olana kadar hücreleri genişletin. CAR T hücrelerinin sağlıklı ve hızlı büyümesini sağlamak için, hücre yoğunluğunu ihtiyaç duyulana kadar taze ortamla 1−3 x 106 hücre/mL arasında tutun.

3. CAR ifadesinin değerlendirilmesi

  1. CAR T hücrelerini her bir oyukta birkaç kez hafifçe yukarı ve aşağı pipetleyerek karıştırın ve en az 1 x 105 hücreyi 5 mL'lik bir FACS tüpüne aktarın.
  2. Tüpe 3 mL soğuk yıkama tamponu (2 mM EDTA içeren PBS ve %0,5 w/v BSA) ekleyin. Tüpü RT'de 5 dakika boyunca 500 x g'da santrifüjleyin. Süpernatanı dikkatlice çıkarın.
  3. Hücre peletini 100 μL yıkama tamponunda yeniden süspanse edin. Süspanse hücrelere 2 μL CAR tespit reaktifi allofikosiyanin (APC) konjuge keçi anti-insan IgG F (ab ') 2 antikoru (Malzeme Tablosuna bakınız) ve 2 μL canlılık boyası 7-AAD ekleyin.
    NOT: CAR, CAR bir etiket içeriyorsa (yani, FLAG) uygun şekilde etiketlenmiş bir hedef antijen veya bir anti-etiket antikoru kullanılarak da tespit edilebilir. CAR tespiti için etiketlenmemiş bir antikor kullanılıyorsa, adım 3.4'ten sonra uygun bir floresan etiketli ikincil antikor ile inkübasyon gereklidir.
  4. Tüpü hafifçe sallayarak numuneyi karıştırın ve 30 dakika buz üzerinde inkübe edin. Kuluçka sırasında ışıktan kaçının. Hücreleri 3 mL soğuk yıkama tamponu ile yıkayın ve tüpü RT'de 5 dakika boyunca 500 x g'da santrifüjleyin.
  5. Süpernatanı atın ve hücreleri 100 μL yıkama tamponunda yeniden süspanse edin. Hemen bir akış sitometresi kullanarak hücreleri analiz edin. Algılama reaktifinin floresan etiketinin ve canlılık boyasının uygun pozitif ve negatif kontroller kullanılarak uygun şekilde telafi edildiğinden emin olun.
  6. Aşağıdaki geçit stratejisini kullanarak CAR ifadesini değerlendirin: FSC-A ve SSC-A grafiğini kullanarak hücrelere geçit verin; FSC-A ve FSC-H grafiğini kullanarak tek hücrelere geçit verin; 7-AAD boyamayı kullanarak canlı hücrelerin üzerini kapatın.
  7. Anti-insan IgG F (ab') 2 antikoru tarafından boyanan canlı T hücrelerinin yüzdesini hesaplayın. CAR-T hücrelerini, minimum lekelenmeye sahip olması gereken negatif kontrol T hücreleriyle karşılaştırın.

4. CAR-T hücre fonksiyonunun analizi

  1. Sitotoksisite analizi
    1. Hedef tümör hücrelerinin antijeni CAR tarafından tanınabilecek bir konformasyonda eksprese ettiğinden emin olun. Antijen ekspresyonunu doğrulamak için, CAR'ın türetildiği ana antikoru kullanarak tümör hücrelerini akış sitometrisi ile analiz edin. CAR tümör hücrelerini tanıyamazsa, CAR-T hücreleri tümör hücrelerini öldüremez.
    2. Hücre yüzeyinde CAR'ın antijenini eksprese eden hedef tümör hücrelerini hazırlayın. Yapışan tümör hücrelerini 37 ° C'de 1 dakika boyunca% 0.05 tripsin-EDTA çözeltisi ile tripsinize edin ve 1-4 x 105 hücre / mL'de uygun kültür ortamı ile tek hücreli süspansiyon hazırlayın.
      NOT: Sonraki adımlarda doğru analiz sağlamak için tümör hücreleri iyi yapışmalıdır. Tümör hücreleri zayıf bir şekilde yapışırsa, kolayca ayrılırsa veya süspansiyon halinde büyürse, hücre bağlanmasını kolaylaştırmak için bir sonraki adımda kullanılan plakanın kuyularını uygun bir antikor, polikatyonik polimer veya fibronektin veya kollajen gibi biyolojik materyal ile kaplayın.
    3. Bir E-Plaka hazırlayın (Malzeme Tablosuna bakın). Deney düzeneğini tasarlar. Her bir oyuğa 50 μL önceden ısıtılmış tümör hücresi kültürü ortamı ekleyin ve arka plan empedansını ölçmek için E-Plakayı Gerçek Zamanlı Hücre Analizi (RTCA) cihazına yerleştirin. 3 tarama için ölçüm (veya tarama) başına 1 dakikada empedansı ölçün.
      NOT: Arka plan empedansı, hücre indeksini sıfıra ayarlamak için kullanılır. Arka plan empedans ölçümü olmadan, kuyular birbiriyle karşılaştırılamaz ve bu da sonuçları yorumlanamaz hale getirir.
    4. E-Plakayı RTCA cihazından çıkarın ve her oyuğa 100 μL tümör hücresi süspansiyonu ekleyin. Bu nedenle, her kuyucuk 150 μL toplam hacimde 1−4 x10 4 hücre içerir.
      NOT: Her bir kuyucuğa ekilecek tümör hücrelerinin sayısı deneyden önce belirlenmelidir. E-Plakayı bir dizi hücre numarasıyla tohumlayın, ardından sonraki 24-48 saat boyunca hücre indekslerini izleyin. İstenilen hücre sayısı, plato oluşmadan en az 24 saat boyunca hücre indeksinde sabit bir artış sağlar. Aşırı hücre tohumlaması, besin tükenmesini ve orta asitleşmeyi hızlandırarak hücre indeksinin erken plato haline gelmesine neden olabilir. Ek olarak, potansiyel aykırı değer ölçümlerini belirlemek için her grup için çoğaltma kuyuları dahil edilmelidir.
    5. E-Plakayı RT'de 30 dakika dengeleyin. Bu adım, tümör hücrelerinin kuyucukların dibine yerleşmesini ve yapışmasını sağlar.
      NOT: Bu adım, doğru hücre indeksi ölçümü için gereklidir. Bu adımın atlanması genellikle hücre indeksi ölçümlerinde iyiden kuyuya değişkenliğe ve kuyucuklar içinde eşit olmayan tümör hücresi yapışmasına neden olur ve bu da tahlilde gürültünün artmasına neden olur.
    6. E-Plakayı RTCA cihazına geri yerleştirin ve her 5-15 dakikada bir süpürme yapılarak hücre indekslerini yaklaşık 24 saat izleyin.
    7. Ertesi gün, CAR-T hücre süspansiyonunu hazırlayın. CAR-T hücrelerini (efektör hücreler) RPMI 1640 ortamındaki adım 2.10'dan artı %10 FBS'den tümör hücresi (hedef hücre) ve istenen efektör: hedef (E: T) hücre oranı tarafından belirlenen bir konsantrasyona kadar askıya alın. Örneğin, tümör hücresi süspansiyonu 2 x 105 hücre / mL yoğunluktaysa ve 10: 1'lik bir E: T oranı isteniyorsa, CAR-T hücreleri 2 x 106 hücre / mL'ye askıya alınmalıdır. Tek başına tümör hücreleri (efektör hücre yok) ve kontrol T hücreleri (mRNA olmadan veya kontrol mRNA'sı ile elektropore edilmiş T hücreleri) gibi uygun kontrolleri dahil edin.
      NOT: En iyi sonuçlar için, yüzey CAR ifadesinin yüksek olduğu elektroporasyondan 1-2 gün sonra CAR-T hücrelerini kullanın. En uygun E:T oranını keşfetmek için bir dizi E:T oranı (örneğin, 3:1 ila 20:1) test edilebilir. CAR-T frekansı çok düşük olmadıkça, yani %10'un altında olmadıkça, tümör hücrelerinin neredeyse tamamen öldürülmesini sağlamak için genellikle 10:1 veya 20:1'lik bir E:T oranı yeterlidir.
    8. Hücre indeksi kaydını duraklatın ve E-Plakayı RTCA cihazından çıkarın.
    9. Plakayı hafifçe eğin, tümör hücrelerine dokunmadan her bir oyuktan 50 μL kültür ortamını dikkatlice çıkarın ve her bir oyuğa 100 μL CAR-T hücresi veya kontrol T hücresi ekleyin.
    10. E-Plakayı RTCA cihazına geri koyun ve her 24-5 dakikada bir yapılan taramalarla en az 15 saat hücre indeksi izlemeye devam edin.
      NOT: Hücre indeksi izlemenin uzunluğu, CAR-T hücrelerinin tümör hücrelerini ne kadar hızlı hedeflediğine bağlıdır. CAR-T hücrelerinin maksimum sitotoksik etki göstermesi için genellikle 24 saatlik bir inkübasyon süresi yeterlidir.
    11. Hücre indeksi izlemeyi durdurun, E-Plakayı RTCA cihazından çıkarın ve sitotoksisite sonucunu analiz edin. Sitotoksisiteyi, CAR-T hücreleri tarafından öldürülen tümör hücrelerinin yüzdesi olarak hesaplayın. CAR-T hücrelerinin ortalama sitotoksisitesini hesaplayın ve RTCA yazılımını kullanarak T hücrelerini kontrol edin. Sitotoksisiteyi manuel olarak hesaplamak için aşağıdaki formülü kullanın
      sitotoksisite = ((tümör hücrelerinin hücre indeksi) - (tümör hücrelerinin hücre indeksi artı efektör hücreler)) / (tümör hücrelerinin hücre indeksi) × %100.
  2. Sitokin sekresyon analizi
    1. Sitotoksisite analizi sırasında CAR-T hücreleri tarafından salgılanan IFN-Υ gibi sitokinleri analiz etmek için, süpernatanı E-Plakadan yuvarlak tabanlı veya V şeklinde 96 oyuklu bir plakaya aktarın.
      NOT: Sitokin sekresyonunun zaman seyri analizi isteniyorsa, adım 4.1.10'da hücre indeksi izlemeyi duraklatın, her kuyucuktan süpernatantın küçük bir kısmını toplayın, E-Plakayı RTCA cihazına geri koyun ve izlemeye devam edin.
    2. 96 oyuklu plakayı RT'de 5 dakika boyunca 300 x g'da santrifüjleyin. Hücre peletlerini bozmadan süpernatanları dikkatlice yeni bir 96 oyuklu plakaya aktarın.
    3. Üreticinin talimatlarına göre ticari enzime bağlı immünosorbent test (ELISA) kitleri kullanarak süpernatanlardaki sitokin seviyelerini ölçün. Süpernatanlar genellikle ölçümden önce, analiz edilen sitokinlere bağlı olarak bazen 100 kattan fazla seyreltme gerektirir.
    4. Numune absorbans değerlerini seri olarak seyreltilmiş standartlardan oluşturulan standart bir eğriye göre enterpolasyon yaparak verileri analiz edin. Uygun yazılımı kullanarak ortalama ± standart sapmayı (SD) temsil eden hata çubuklu grafikler hazırlayın. Tedaviler arasındaki farkı karşılaştırmak için bir Student t testi yapılabilir. 0,05'ten küçük bir p değeri genellikle istatistiksel olarak anlamlı kabul edilir.
      NOT: Muhtemelen deneysel hatalardan dolayı açık aykırı değerler olan veri noktaları analizden çıkarılmalıdır.

Sonuçlar

İnsanlaştırılmış anti-HER2 fare monoklonal antikoru (mAb) 4D547'den türetilen bir scFv, bir transmembran bölgesi ve hücre içi bir 4-1BB kostimülatör alanı ve ardından CD3ζ aktivasyon alanı içeren ikinci nesil HER2 hedefli bir CAR oluşturduk (Şekil 1A). CAR'ı kodlayan DNA dizisi, CAR mRNA'nın in vitro transkripsiyonunu sürmek için bir 5' SP6 promotörü içeriyordu (Şekil 1B

Tartışmalar

Bu çalışmada, geçici CAR-T hücreleri oluşturmak için ayrıntılı bir viral olmayan, entegre olmayan bir yaklaşım tanımladık ve CAR-T hücre fonksiyonunu değerlendirmek için teknik prosedürler sağladık. Bu yaklaşım, kalıcı ve rastgele CAR transgen iletimi için geleneksel retroviral ve lentiviral vektörlerin kullanılmasından kaçınır, bunun yerine in vitro modifiye CAR mRNA'yı T hücrelerine verimli bir şekilde dahil etmek için elektroporasyondan yara...

Açıklamalar

Yazarlar Liang Hu, Robert Berahovich, Yanwei Huang, Shiming Zhang, Jinying Sun, Xianghong Liu, Hua Zhou, Shirley, Xu, Haoqi Li ve Vita Golubovskaya ProMab Biotechnologies'in çalışanlarıdır. Lijun Wu, ProMab Biotechnologies'in bir çalışanı ve hissedarıdır.

Teşekkürler

Bu çalışma ProMab Biyoteknoloji tarafından desteklenmiştir.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
7-AAD viability dye Biolegend420404
ACEA Novocyte flow cytometerAgilentNovoCyte 3000
AIM-V mediumGibco12055083
APC goat anti-human IgG F(ab')2 antibodyJackson ImmunoResearch Laboratories109-136-097
BglII Restriction EnzymeNew England BioLabs (NEB)R0144L
3´-O-Me-m7G(5')ppp(5')G RNA Cap Structure AnalogNEBS1411S
DMEM, high glucoseGibco11965092
Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28 beadsGibco11131D
E-Plate 96Agilent5232376001
EthanolSigma459844-4L
FBSLonza.com14-503F
HiScribe SP6 RNA Synthesis KitNew England BioLabs (NEB)E2070S
Human IL-2 Recombinant ProteinGibco15140122
Millennium RNA MarkersInvitrogenAM7150
Monarch RNA Cleanup Kit (500 μg)NEBT2050L
N1-Methylpseudo-UTPTrilinkN-1081-10
Neon Transfection InstrumentInvitrogenMPK5000
Neon Transfection System 100-μL KitInvitrogenMPK10096
Penicillin-Streptomycin (10000 U/mL)Gibco14-503F
RPMI 1640 MediumGibco11875135
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol redGibco25300120
UltraPure Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol (25:24:1, v/v)Invitrogen15593049
xCELLigence Real-Time Cell Analysis (RTCA) instrumentAgilentRTCA MP
ZymoPURE II Plasmid Midiprep KitZymo ResearchD4201

Referanslar

  1. Ataeinia, B., et al. National and subnational incidence, mortality, and years of life lost due to breast cancer in iran: Trends and age-period-cohort analysis since 1990. Front Oncol. 11, 561376 (2021).
  2. Jordan, R. M., Oxenberg, J. . Breast cancer conservation therapy. , (2024).
  3. Tannock, I. F. Combined modality treatment with radiotherapy and chemotherapy. Radiother Oncol. 16 (2), 83-101 (1989).
  4. Mcree, A. J., Cowherd, S., Wang, A. Z., Goldberg, R. M. Chemoradiation therapy in the management of gastrointestinal malignancies. Future Oncol. 7 (3), 409-426 (2011).
  5. Palumbo, M. O., et al. Systemic cancer therapy: Achievements and challenges that lie ahead. Front Pharmacol. 4, 57 (2013).
  6. Mitra, A., et al. From bench to bedside: The history and progress of car t cell therapy. Front Immunol. 14, 1188049 (2023).
  7. Lim, W. A., June, C. H. The principles of engineering immune cells to treat cancer. Cell. 168 (4), 724-740 (2017).
  8. Silveira, C. R. F., et al. Cytokines as an important player in the context of car-t cell therapy for cancer: Their role in tumor immunomodulation, manufacture, and clinical implications. Front Immunol. 13, 947648 (2022).
  9. Labanieh, L., Majzner, R. G., Mackall, C. L. Programming car-t cells to kill cancer. Nat Biomed Eng. 2 (6), 377-391 (2018).
  10. Sadelain, M., Brentjens, R., Riviere, I. The basic principles of chimeric antigen receptor design. Cancer Discov. 3 (4), 388-398 (2013).
  11. Tokarew, N., Ogonek, J., Endres, S., Von Bergwelt-Baildon, M., Kobold, S. Teaching an old dog new tricks: Next-generation car t cells. Br J Cancer. 120 (1), 26-37 (2019).
  12. Kochenderfer, J. N., et al. Eradication of b-lineage cells and regression of lymphoma in a patient treated with autologous t cells genetically engineered to recognize cd19. Blood. 116 (20), 4099-4102 (2010).
  13. Brentjens, R. J., et al. Safety and persistence of adoptively transferred autologous cd19-targeted t cells in patients with relapsed or chemotherapy refractory b-cell leukemias. Blood. 118 (18), 4817-4828 (2011).
  14. Tomasik, J., Jasinski, M., Basak, G. W. Next generations of car-t cells - new therapeutic opportunities in hematology. Front Immunol. 13, 1034707 (2022).
  15. Asmamaw Dejenie, T., et al. Current updates on generations, approvals, and clinical trials of car t-cell therapy. Hum Vaccin Immunother. 18 (6), 2114254 (2022).
  16. Sun, W., Jiang, Z., Jiang, W., Yang, R. Universal chimeric antigen receptor t cell therapy - the future of cell therapy: A review providing clinical evidence. Cancer Treat Res Commun. 33, 100638 (2022).
  17. Wang, X., Riviere, I. Clinical manufacturing of car t cells: Foundation of a promising therapy. Mol Ther Oncolytics. 3, 16015 (2016).
  18. Pinto, I. S., Cordeiro, R. A., Faneca, H. Polymer- and lipid-based gene delivery technology for car t cell therapy. J Control Release. 353, 196-215 (2023).
  19. Magnani, C. F., et al. Sleeping beauty-engineered car t cells achieve antileukemic activity without severe toxicities. J Clin Invest. 130 (11), 6021-6033 (2020).
  20. Irving, M., Lanitis, E., Migliorini, D., Ivics, Z., Guedan, S. Choosing the right tool for genetic engineering: Clinical lessons from chimeric antigen receptor-t cells. Hum Gene Ther. 32 (19-20), 1044-1058 (2021).
  21. Moretti, A., et al. The past, present, and future of non-viral car t cells. Front Immunol. 13, 867013 (2022).
  22. Song, H. W., et al. Car-t cell expansion platforms yield distinct t cell differentiation states. Cytotherapy. 26 (7), 757-768 (2024).
  23. Stephenson, M., Grayson, W. Recent advances in bioreactors for cell-based therapies. F1000Res. 7, (2018).
  24. Micklethwaite, K. P., et al. Investigation of product-derived lymphoma following infusion of piggybac-modified cd19 chimeric antigen receptor t cells. Blood. 138 (16), 1391-1405 (2021).
  25. Ghilardi, G., et al. T cell lymphoma and secondary primary malignancy risk after commercial car t cell therapy. Nat Med. 30 (4), 984-989 (2024).
  26. Steffin, D. H. M., et al. Long-term follow-up for the development of subsequent malignancies in patients treated with genetically modified iecs. Blood. 140 (1), 16-24 (2022).
  27. Cappell, K. M., et al. Long-term follow-up of anti-cd19 chimeric antigen receptor t-cell therapy. J Clin Oncol. 38 (32), 3805-3815 (2020).
  28. Cordeiro, A., et al. Late events after treatment with cd19-targeted chimeric antigen receptor modified t cells. Biol Blood Marrow Transplant. 26 (1), 26-33 (2020).
  29. Zhao, A., et al. Secondary myeloid neoplasms after cd19 car t therapy in patients with refractory/relapsed b-cell lymphoma: Case series and review of literature. Front Immunol. 13, 1063986 (2022).
  30. Verdun, N., Marks, P. Secondary cancers after chimeric antigen receptor t-cell therapy. N Engl J Med. 390 (7), 584-586 (2024).
  31. Ruella, M., et al. Induction of resistance to chimeric antigen receptor t cell therapy by transduction of a single leukemic b cell. Nat Med. 24 (10), 1499-1503 (2018).
  32. Bishop, D. C., et al. Development of car t-cell lymphoma in 2 of 10 patients effectively treated with piggybac-modified cd19 car t cells. Blood. 138 (16), 1504-1509 (2021).
  33. Shah, N. N., et al. Clonal expansion of car t cells harboring lentivector integration in the cbl gene following anti-cd22 car t-cell therapy. Blood Adv. 3 (15), 2317-2322 (2019).
  34. Fraietta, J. A., et al. Disruption of tet2 promotes the therapeutic efficacy of cd19-targeted t cells. Nature. 558 (7709), 307-312 (2018).
  35. Heinrich, T., et al. Mature t-cell lymphomagenesis induced by retroviral insertional activation of janus kinase 1. Mol Ther. 21 (6), 1160-1168 (2013).
  36. Harrison, S. J., et al. Car+ t-cell lymphoma post ciltacabtagene autoleucel therapy for relapsed refractory multiple myeloma. Blood. 142 (Supplement 1), 6939-6939 (2023).
  37. FDA Administration. . Fda requires boxed warning for t cell malignancies following treatment with bcma-directed or cd19-directed autologous chimeric antigen receptor (car) t cell immunotherapies. , (2024).
  38. Elsallab, M., et al. Second primary malignancies after commercial car t-cell therapy: Analysis of the fda adverse events reporting system. Blood. 143 (20), 2099-2105 (2024).
  39. Levine, B. L., et al. Unanswered questions following reports of secondary malignancies after car-t cell therapy. Nat Med. 30 (2), 338-341 (2024).
  40. Tward, J. D., Wendland, M. M., Shrieve, D. C., Szabo, A., Gaffney, D. K. The risk of secondary malignancies over 30 years after the treatment of non-hodgkin lymphoma. Cancer. 107 (1), 108-115 (2006).
  41. Kumar, V., et al. Trends in the risk of second primary malignancies among survivors of chronic lymphocytic leukemia. Blood Cancer J. 9 (10), 75 (2019).
  42. Holtkamp, S., et al. Modification of antigen-encoding rna increases stability, translational efficacy, and t-cell stimulatory capacity of dendritic cells. Blood. 108 (13), 4009-4017 (2006).
  43. Dvir, S., et al. Deciphering the rules by which 5'-utr sequences affect protein expression in yeast. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (30), E2792-E2801 (2013).
  44. Van Der Velden, A. W., Voorma, H. O., Thomas, A. A. Vector design for optimal protein expression. Biotechniques. 31 (3), 572-580 (2001).
  45. Jaatinen, T., Laine, J. Isolation of mononuclear cells from human cord blood by ficoll-paque density gradient. Curr Protoc Stem Cell Biol. Chapter 2 (Unit 2A), 1 (2007).
  46. Zhao, Y., et al. High-efficiency transfection of primary human and mouse t lymphocytes using rna electroporation. Mol Ther. 13 (1), 151-159 (2006).
  47. Carter, P., et al. Humanization of an anti-p185her2 antibody for human cancer therapy. Proc Natl Acad Sci U S A. 89 (10), 4285-4289 (1992).
  48. Hu, L., et al. Her2-cd3-fc bispecific antibody-encoding mrna delivered by lipid nanoparticles suppresses her2-positive tumor growth. Vaccines. 12 (7), 808 (2024).
  49. Perales-Puchalt, A., et al. DNA-encoded bispecific t cell engagers and antibodies present long-term antitumor activity. JCI Insight. 4 (8), e126086 (2019).
  50. Schwanhausser, B., et al. Global quantification of mammalian gene expression control. Nature. 473 (7347), 337-342 (2011).
  51. Kozak, M. Features in the 5' non-coding sequences of rabbit alpha and beta-globin mrnas that affect translational efficiency. J Mol Biol. 235 (1), 95-110 (1994).
  52. Wu, Q., et al. Translation affects mrna stability in a codon-dependent manner in human cells. Elife. 8, e45396 (2019).
  53. Henderson, J. M., et al. Cap 1 messenger rna synthesis with co-transcriptional cleancap((r)) analog by in vitro transcription. Curr Protoc. 1 (2), e39 (2021).
  54. Kariko, K., et al. Incorporation of pseudouridine into mrna yields superior nonimmunogenic vector with increased translational capacity and biological stability. Mol Ther. 16 (11), 1833-1840 (2008).
  55. Gehl, J. Electroporation: Theory and methods, perspectives for drug delivery, gene therapy and research. Acta Physiol Scand. 177 (4), 437-447 (2003).
  56. Stacey, M., Fox, P., Buescher, S., Kolb, J. Nanosecond pulsed electric field induced cytoskeleton, nuclear membrane and telomere damage adversely impact cell survival. Bioelectrochemistry. 82 (2), 131-134 (2011).
  57. Meaking, W. S., Edgerton, J., Wharton, C. W., Meldrum, R. A. Electroporation-induced damage in mammalian cell DNA. Biochim Biophys Acta. 1264 (3), 357-362 (1995).
  58. Zhang, J., et al. Non-viral, specifically targeted car-t cells achieve high safety and efficacy in b-nhl. Nature. 609 (7926), 369-374 (2022).
  59. Von Auw, N., et al. Comparison of two lab-scale protocols for enhanced mrna-based car-t cell generation and functionality. Sci Rep. 13 (1), 18160 (2023).
  60. Gauthier, J., Turtle, C. J. Insights into cytokine release syndrome and neurotoxicity after cd19-specific car-t cell therapy. Curr Res Transl Med. 66 (2), 50-52 (2018).
  61. Beatty, G. L., et al. Activity of mesothelin-specific chimeric antigen receptor t cells against pancreatic carcinoma metastases in a phase 1 trial. Gastroenterology. 155 (1), 29-32 (2018).
  62. Beatty, G. L., et al. Mesothelin-specific chimeric antigen receptor mrna-engineered t cells induce anti-tumor activity in solid malignancies. Cancer Immunol Res. 2 (2), 112-120 (2014).
  63. Tchou, J., et al. Safety and efficacy of intratumoral injections of chimeric antigen receptor (car) t cells in metastatic breast cancer. Cancer Immunol Res. 5 (12), 1152-1161 (2017).
  64. Wu, J., Wu, W., Zhou, B., Li, B. Chimeric antigen receptor therapy meets mrna technology. Trends Biotechnol. 42 (2), 228-240 (2024).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

Kanser Ara t rmalarSay 216kimerik antijen resept rmRNAkanser imm noterapisielektroporasyonRTCAsitotoksisiteHER2h cre tedavisi

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır