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요약

이 프로토콜은 암 면역 요법을 위한 비통합 mRNA를 사용하여 일시적 키메라 항원 수용체(CAR) T 세포를 생성하는 자세한 절차를 설명하고 CAR-T 세포 및 세포 독성 기능을 평가하기 위한 신뢰할 수 있는 방법을 제공합니다.

초록

키메라 항원 수용체(CAR) T 세포 요법은 림프종 및 백혈병과 같은 특정 혈액 악성 종양을 치료하는 데 전례 없는 성공을 거두며 선구적인 암 치료법으로 부상했습니다. 그러나 CAR-T 세포 요법을 받는 암 환자가 증가함에 따라 예상치 못한 CAR 전이유전자 삽입으로 인한 치료 관련 2차 원발성 악성 종양이 점점 더 많이 보고되고 있어 심각한 안전성 문제가 제기되고 있습니다. 이 문제를 해결하기 위해 여기에서는 mRNA를 사용하여 일시적인 CAR-T 세포를 생성하는 비바이러스, 비통합적 접근 방식에 대해 설명합니다. 인간 표피 성장 인자 수용체 2(HER2) 특이적 CAR을 인코딩하는 변형된 mRNA로 T 세포를 전기천공하고 일시적인 HER2 표적 CAR-T 세포를 생성했습니다. CAR은 전기천공법 1일 후 T 세포 표면에서 효율적으로 발현되었고, 2일째에는 증가했으며, 5일째에는 급격히 감소했습니다. 일시적인 CAR-T 세포는 HER2 양성 SKOV-3 난소암 세포에 대해 강력한 세포 독성을 보였으며 높은 수준의 IFN-Υ를 분비했습니다. 이 프로토콜은 영구적인 CAR 전이유전자 통합 없이 소규모 일시적 CAR-T 세포를 개발하기 위한 단계별 가이드를 제공하며, CAR mRNA 준비, T 세포의 활성화 및 형질주입, CAR 발현 평가 및 CAR-T 세포 기능의 체외 분석에 대한 자세한 절차를 설명합니다. 이 방법은 전임상 및 임상 연구 모두에서 일시적인 CAR-T 세포 생성에 적합합니다.

서문

암은 인간의 건강에 점점 더 중요한 위협이 되고 있으며, 전 세계적으로 매년 2,360만 명의 신규 진단자와 1,000만 명의 사망자가 발생하는 것으로 추정됩니다1. 방사선 및 화학요법과 병행된 외과적 치료는 다양한 유형의 국소 비침습성 및 침습성 암에 대한 치료의 황금 표준으로 남아 있다 2,3,4. 전통적인 체계적 치료법이 초기 단계의 암을 관리하는 데 큰 성공을 거두었지만, 독성이 매우 강하고 전이성 암과 혈액암에 미치는 영향이 제한적이다5. 이러한 암을 앓고 있는 환자들은 빈번한 치료를 받으며, 질병의 진행을 안정시키고 지연시키기 위해 심각한 독성을 견뎌야 합니다. 키메라 항원 수용체(CAR) T 세포 요법은 최근 B 세포 혈액암에 대한 강력한 효능을 입증하고 절박한 환자들에게 희망을 제공하는 혁신적인 표적 치료법으로 부상했습니다6.

CAR-T 세포는 세포 표면에서 CAR을 발현하는 조작된 T 림프구로, 종양 관련 항원(TAA)을 특이적으로 인식하고 주요 조직적합성 복합 단백질(MHC)의 항원 제시 없이 세포를 활성화합니다7. 활성화 시 CAR-T 세포는 MHC와 독립적으로 사이토카인 및 용해 종양 세포 패널을 분비하므로 면역 억제 종양 미세환경으로 인해 MHC가 하향 조절되거나 손실되는 경우에도 종양의 파괴를 향상시킵니다 8,9. CAR은 TAA 특이적 항체의 항원 인식 가변 영역을 포함하는 세포외 단쇄 단편 변이체(scFv), CAR을 세포 표면에 고정하는 막관통 도메인, 어댑터 단백질 모집 및 다운스트림 신호 전달을 매개하는 세포 내 도메인, 즉 최소 3개의 도메인으로 구성됩니다10. 세포 내 도메인의 변이에 따라 CAR 구조는 지금까지 5세대를 거치며 진화해 왔으며, 첫 번째 세대는 CD3ζ 활성화 도메인만 포함하고 후속 세대는 4-1BB 및 CD28과 같은 분자로부터 하나 이상의 추가 공동 자극 도메인을 소유합니다11. 이러한 세포 내 도메인은 CAR-T 세포 신호 전달 메커니즘, 증식, 생존 및 독성에 영향을 미치며, 이는 함께 임상적 항종양 효능을 결정합니다. CAR-T 세포 치료의 임상적 성공은 B 세포 백혈병과 림프종을 치료하기 위해 B 계통 세포에서 많이 발현되는 바이오마커인 CD19를 특이적으로 표적으로 하는 2세대 CAR-T 세포에서 비롯됩니다12,13. 현재까지 미국 식품의약국(FDA)은 거대 B세포 림프종, 맨틀 세포 림프종, 다발성 골수종 6을 포함한 재발성 또는 불응성 혈액 악성 종양에 대한 CD-19 또는 B세포 성숙 항원(BCMA)을 표적으로 하는 6개의 2세대 CAR-T 세포 치료제를 승인했습니다. 새로운 세대의 CAR-T 세포는 현재 집중적인 전임상 및 임상 연구를 진행하고 있습니다 14,15.

CAR-T 세포의 임상 생산은 복잡하고 비용이 많이 들며 시간이 많이 소요되는 과정입니다. 현재 CAR-T 세포 제제에 사용되는 백혈구는 동종 반응을 피하기 위해 환자 자신으로부터 얻은 것이지만, 공여자에서 유래한 범용(또는 기성품) CAR-T 세포는 활발히 개발 및 임상 평가 중이다16. 백혈구 성분 채집술에 의해 환자의 말초 혈액에서 백혈구를 분리한 후, CAR을 암호화하는 외부 유전자 단편을 바이러스 또는 비바이러스 접근법을 사용하여 활성화된 T 세포에 도입합니다 17,18,19. 레트로바이러스(retrovirus)와 렌티바이러스(lentivirus)는 CAR 유전자 전달을 위한 가장 흔한 바이러스 벡터로, CAR 인코딩 DNA가 T 세포 게놈(genome20)에 무작위적이고 영구적으로 통합되는 결과를 낳습니다. mRNA-지질 나노입자, 트랜스포손 시스템, CRISPR/Cas9 게놈 편집을 포함한 비바이러스 접근법은 흔하지 않다21. 그 후, CAR 발현 T 세포는 대규모로 생체 외에서 확장된 다음 수집되어 환자에게 다시 재주입됩니다22,23. 엄격한 GMP(Good Manufacturing Practice) 표준을 충족하는 바이러스 벡터를 제조하는 것은 매우 어렵고 복잡하며 비용이 많이 들기 때문에 제조업체, 규제 기관 및 환자에게 상당한 부담을 주어 광범위한 임상 적용을 제한합니다.

CAR-T 요법의 놀라운 성공에도 불구하고 안전성에 대한 우려가 커지고 있습니다. 바이러스 또는 전이손 형질전환 중 CAR 전이유전자가 T 세포 게놈에 통합되는 무작위적인 특성을 감안할 때, 종양 억제 유전자의 파괴 또는 종양 유전자의 활성화가 발생하여 T 세포의 악성 형질전환으로 이어질 수 있습니다24,25. 2017년 FDA가 첫 번째 CAR-T 세포 치료제를 승인한 이후, 후속 연구에 따르면 치료를 받은 환자의 15%가 T 세포 림프종(TCL), 비소세포폐암(NSCLC) 및 피부암과 같은 2차 원발성 악성 종양(SPM)을 앓고 있습니다 26,27,28,29. 놀랍게도, CAR 전이유전자는 일부 SPM에서 높게 검출되었고 30,31, 일부 TCL의 사례는 CAR-T 세포 24,32,33의 비정상적인 확장에 의해 직접 유발되었는데, 이는 일부 SPM을 유도하는 데 CAR-T 산물의 직접적인 역할을 나타냅니다. 다른 연구에서는 SPM 종양 세포의 TET234, JAK135 및 PBX236과 같은 중요한 유전자에서 CAR 전이유전자 삽입을 추가로 확인했습니다. CAR-T 세포 요법 후 T 세포 악성 종양에 대한 축적된 증거에 비추어, FDA는 최근 현재 승인된 모든 CD19 유도 및 BCMA 표적 CAR-T 세포 요법에 대해 심각한 T 세포 악성 종양 위험을 강조하는 상자 모양의 경고가 필요하다고 결론을 내렸다37. 그러나 CAR-T 치료의 장기적 효과에 따른 대규모 코호트 연구에서는 치료받은 환자에서 SPM의 발생률이 3.8%에서 15%에 이르는 것으로 보고되었다 26,27,28,38,39. 발병률은 전통적인 체계적 치료를 받은 혈액암 환자에서 관찰된 것보다 유의하게 높지 않으며40,41 이는 CAR-T 세포 요법에 대한 상대적으로 안전한 프로파일을 시사합니다. 그럼에도 불구하고 보다 비용 효율적인 접근 방식을 통해 SPM의 위험을 최소화하는 안전하고 효과적인 CAR-T 세포를 개발하는 것이 시급합니다.

여기에서는 CAR-T 세포를 생성하기 위한 비바이러스, 비통합적 접근 방식에 대한 자세한 프로토콜에 대해 설명합니다. 목표는 일시적인 CAR 발현을 가진 작고 효과적인 CAR-T 세포를 생성하기 위한 간단한 단계별 가이드를 제공하여 삽입 돌연변이 유발을 방지하고 SPM의 위험을 최소화하는 것입니다. 우리는 TAA HER2에 특이적인 CAR을 인코딩하는 변형된 mRNA로 T 세포의 전기천공법이 T 세포 표면에서 anti-HER2 CAR의 강력하고 일시적인 발현을 초래했음을 보여줍니다. CAR을 발현하는 동안 T 세포는 HER2 양성 종양 세포를 강력하게 죽이고 높은 수준의 IFN-Υ를 분비했습니다. 이 프로토콜은 CAR mRNA 준비, T 세포의 활성화 및 전기천공, CAR 발현 평가, CAR-T 세포 기능 분석을 포함하는 4개의 개별적이지만 연속적인 섹션으로 설명됩니다. 이 접근 방식은 학술 연구 및 임상 세포 치료를 위한 일시적인 CAR-T 세포를 개발하고 생산하는 데 적합합니다.

프로토콜

여기에 사용된 PBMC는 이전에42 이전에 설명된 Ficoll-Paque 밀도 구배를 사용하여 IRB(Institutional Review Board) 승인 프로토콜(13942)에 따라 Stanford Hospital Blood Center의 전혈에서 이전에 분리되었습니다. PBMC를 채취하는 데 사용한 혈액은 Stanford Hospital Blood Center에서 상업적으로 얻은 것이었기 때문에 참가자의 사전 동의는 적용되지 않았습니다.

1. CAR mRNA의 제조

  1. 템플릿 준비
    참고: 선형화된 플라스미드 또는 PCR 단편은 적절한 5' SP6 또는 T7 promoter, 5' untranslated region(UTR), CAR 전이유전자 및 적절한 poly(A) tail을 가진 3' UTR을 포함하는 경우 in vitro에서 CAR mRNA를 합성하기 위한 템플릿으로 사용할 수 있습니다. 이 연구에서는 SP6 프로모터, 짧은 인간 베타-글로빈 5'UTR, CAR 전이유전자 및 두 개의 탠덤 베타-글로빈 3'UTR과 112-bp 폴리(A) 꼬리43으로 구성된 3'UTR을 포함하는 CAR 플라스미드 DNA 구조를 사용했습니다. UTR, 코딩 서열 및 폴리(A) 꼬리는 모두 RNA 안정성과 번역 효율에 영향을 미칩니다 43,44,45. 120 bp의 폴리(A) 꼬리는 짧은 폴리(A) 꼬리에 비해 세포 배양에서 단백질 수율을 증가시키는 것으로 나타났습니다43.
    1. 제조업체의 지침에 따라 플라스미드 준비 키트를 사용하여 CAR 구성 플라스미드 DNA를 준비합니다. 고품질 플라스미드 DNA는 높은 수율의 CAR mRNA를 생성하는 데 필수적입니다.
    2. CAR 플라스미드 DNA를 제한 효소 BglII로 선형화합니다. 폴리(A) 꼬리 뒤를 자르는 제한 효소를 선택하고, 우선적으로 폴리(A) 꼬리의 끝에 가깝게 절단합니다. 분광광도계로 정량화된 10 μg(또는 10,000 ng)의 플라스미드를 10 U의 효소, 10 μL의 소화 완충액 및 뉴클레아제가 없는 물을 포함하는 100 μL 반응 혼합물에서 37 °C에서 하룻밤 동안 분해합니다.
      참고: 제한 효소가 CAR 전이유전자와 그 측면 프로모터, UTR 및 폴리(A) 꼬리 서열 내에서 절단하지 않는지 확인하십시오. 효율적인 CAR mRNA transcription을 위해서는 CAR 플라스미드의 완전한 선형화가 필요합니다.
    3. 200 μg/mL 프로테아제 K 및 0.5% w/v SDS를 분해 혼합물에 첨가하고 50°C에서 1시간 동안 배양합니다.
    4. 선형화된 CAR 플라스미드 DNA를 정제합니다. 동일한 부피의 페놀: 클로로포름: 이소아밀 알코올(25:24:1, v/v)을 분해 반응에 추가합니다. 약 15초 동안 격렬하게 소용돌이칩니다. 벤치탑 원심분리기에서 실온(RT)에서 5분 동안 최대 속도로 샘플을 회전시킵니다.
    5. DNA를 포함하는 상부 수성층을 새로운 마이크로 원심분리기 튜브로 옮깁니다. 단백질과 페놀 불순물을 포함하는 중간층과 바닥층의 이동을 피하십시오. 불순물을 줄이기 위해 클로로포름으로 두 번째 추출을 수행합니다.
    6. 10M 암모늄 아세테이트 7.5또는 아 세트산 나트륨 3/3을 넣고 부드럽게 섞습니다. DNA를 침전시키기 위해 2.5 부피의 에탄올을 첨가하십시오. 샘플을 -20°C에서 최소 30분 동안 보관하십시오.
    7. 4°C에서 15분 동안 최대 속도로 샘플을 회전시켜 DNA를 펠릿화합니다. 상등액을 조심스럽게 제거하십시오. DNA 펠릿을 세척하기 위해 500μL의 70% 에탄올을 첨가합니다.
    8. 샘플을 4°C에서 2분 동안 다시 회전시킵니다. 상층액을 조심스럽게 제거하십시오. 튜브에 소량의 용액을 남겨 두십시오.
    9. 4°C에서 2분간 탈수를 반복합니다. 남아 있는 상층액을 조심스럽게 제거합니다. 튜브 바닥에 에탄올 용액이 보이지 않을 때까지 멸균 후드에서 약 10분 동안 RT에서 DNA 펠릿을 자연 건조합니다.
      참고: DNA 펠릿은 용해하기 어려울 수 있으므로 과도하게 건조하지 마십시오.
    10. 뉴클레아제가 없는 물 20μL를 넣고 위아래로 부드럽게 피펫팅하여 DNA를 용해시킵니다. 최대 속도로 샘플을 잠시 원심분리합니다. 분광 광도계로 DNA 농도를 측정합니다.
    11. 즉시 사용할 수 있도록 샘플을 얼음에 보관하거나 나중에 사용할 수 있도록 -20°C에 보관하십시오. 정제된 DNA 100ng를 아가로스 겔에 로드하고 크기와 무결성을 확인합니다. DNA는 예상되는 크기의 뚜렷한 단일 띠로 나타나야 합니다. 불필요하거나 번진 밴드는 관찰되어서는 안 됩니다.
      참고: template DNA의 품질은 효율적인 mRNA transcription에 매우 중요합니다. 불순하고, 단편화되고, 분해된 DNA를 mRNA 전사를 위한 템플릿으로 사용하지 마십시오.
  2. 체외 전사(IVT)
    1. CAR mRNA 를 in vitro에서 합성합니다. 절차 전반에 걸쳐 nuclease-free 시약, 튜브 및 피펫 팁을 사용해야 합니다.
    2. 표 1에 나열된 시약을 RT로 해동하되, SP6 RNA 중합효소 혼합물은 사용할 때까지 -20°C에서 보관해야 합니다. RT에서 표 1에 표시된 순서대로 전사 반응을 준비합니다.부드럽게 혼합하고 37°C에서 최소 2시간 동안 배양합니다.
      참고: 반응은 필요한 mRNA의 양에 따라 확장하거나 축소할 수 있습니다. 위에 표시된 반응은 일반적으로 고품질 템플릿 DNA를 사용할 때 최소 100μg(또는 100,000ng)의 캡된 mRNA를 생성합니다. 더 긴 배양, 즉 하룻밤 동안은 mRNA 수율을 증가시킬 수 있습니다.
    3. RNase-free DNase I 2 μL를 반응에 첨가하고, 부드럽게 혼합한 후, 37 °C에서 15분 동안 배양하여 template DNA를 분해합니다.
    4. RNA Cleanup Kit를 사용하여 전사된 CAR mRNA를 정제합니다( Table of Materials(재료 표 참조). 정제에 대한 키트 제조업체의 지침을 따르십시오. mRNA를 뉴클레아제가 없는 물에서 용리합니다.
      참고: mRNA는 위에 표시된 페놀-클로로포름 추출 방법을 사용하여 정제할 수도 있습니다(1.1.4단계).
    5. 분광 광도계로 mRNA 농도를 측정합니다. 아가로스 겔에 최소 200ng의 mRNA를 로드하고 크기와 무결성을 확인합니다. mRNA는 추가 또는 번진 띠 없이 예상 크기의 우성 띠로 나타나야 합니다. 사용할 때까지 mRNA를 -80°C에서 보관하십시오.

2. T 세포의 활성화 그리고 electroporation

  1. 1 x 106 냉동 보존된 인간 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 1mL의 CAR-T 배지(10% 소 태아 혈청(FBS), 페니실린/스트렙토마이신 및 10ng/ml의 인간 재조합 IL-2가 보충된 AIM-V 배지)에 현탁합니다. 동일한 수의 사전 세척된 Human T-Activator CD3/CD28 비드로 T 세포를 활성화합니다( 재료 표 참조). 37 °C의 가습 인큐베이터에서 5 % CO2 로 며칠 동안 세포를 배양하고 확장하십시오.
    참고: PBMC의 양은 후속 실험에 필요한 T cell의 양에 따라 확대 또는 축소할 수 있습니다.
  2. 얼음 위에서 준비된 CAR mRNA를 해동합니다. 웰당 1mL의 CAR-T 배지를 12웰 플레이트의 2웰에 추가하고 플레이트를 37°C의 인큐베이터에 넣어 배지를 평형화합니다.
  3. 5 x 106 T 세포를 멸균 튜브로 옮기고 튜브를 마그네틱 스탠드에 놓고 세포 현탁액을 새 튜브에 조심스럽게 피펫팅하여 비드를 제거합니다.
  4. RT에서 5분 동안 300 x g 에서 튜브를 원심분리합니다. 상등액을 버리고 세포 펠릿을 1mL의 멸균 PBS에 재현탁합니다.
  5. 튜브를 다시 원심분리하십시오. 상층액을 버리고 200μL의 네온 버퍼 T에 세포를 재현탁합니다( 재료 표 참조).
  6. 새 튜브에 세포 100μL를 피펫하고 세포46에 5μg(또는 5,000ng)의 CAR mRNA를 추가합니다. Neon 버퍼 T를 총 125 μL까지 보충하고 위아래로 피펫팅하여 혼합합니다.
    참고: 전기천공법에 의해 transfection되는 CAR mRNA의 양은 세포 생존력에 부정적인 영향을 미치지 않고 1 x 106 T 세포당 최대 8 μg(또는 8,000 ng)까지 증가할 수 있으며, mRNA의 양이 많을수록 CAR 발현이 증가할 수 있습니다46.
  7. 나머지 100μL 셀에 25μL의 네온 버퍼 T를 추가합니다. 이것은 음의 통제 역할을 합니다.
  8. T 세포를 전기천공합니다. Neon 피펫을 사용하여 T 세포/CAR mRNA 혼합물 또는 음성 대조군 T 세포를 Neon 100 μL 팁으로 흡인하고 1800 V의 10 ms 펄스로 세포를 전기천공합니다.
  9. 전기천공법 후 세포를 12-well 플레이트(단계 2.2에서 준비)의 평형 배양 배지로 즉시 옮깁니다.
  10. 플레이트를 다시 인큐베이터로 되돌리고 사용할 준비가 될 때까지 셀을 확장합니다. CAR T 세포의 건강하고 빠른 성장을 보장하기 위해 필요할 때까지 새로운 배지로 1-3 x 106 cells/mL 사이의 세포 밀도를 유지하십시오.

3. CAR 발현 평가

  1. 각 웰에서 여러 차례 부드럽게 위아래로 피펫팅하여 CAR T 세포를 혼합하고 최소 1 x 105 세포를 5mL FACS 튜브로 옮깁니다.
  2. 튜브에 3mL의 냉세척 버퍼(2mM EDTA 및 0.5% w/v BSA를 함유한 PBS)를 추가합니다. RT에서 500 x g 에서 5분 동안 튜브를 원심분리하고 상층액을 조심스럽게 제거합니다.
  3. 세포 펠릿을 100μL의 세척 완충액에 재현탁합니다. CAR 검출 시약인 알로피코시아닌(APC) 접합 염소 항인간 IgG F(ab')2 항체( 재료 표 참조) 2μL와 생존도 염료 7-AAD 2μL를 부유 세포에 추가합니다.
    참고: CAR에 태그(즉, FLAG)가 포함된 경우 적절하게 라벨링된 표적 항원 또는 안티 태그 항체를 사용하여 CAR을 검출할 수도 있습니다. CAR 검출에 표지되지 않은 항체를 사용하는 경우, 3.4단계 후에 적절한 형광 표지 항체를 사용한 배양이 필요합니다.
  4. 튜브를 부드럽게 흔들어 샘플을 혼합하고 얼음 위에서 30분 동안 배양합니다. 부화 중에는 빛을 피하십시오. 3mL의 냉세척 버퍼로 세포를 세척하고 RT에서 5분 동안 500 x g 으로 튜브를 원심분리합니다.
  5. 상층액을 버리고 100μL의 세척 완충액에 세포를 재현탁합니다. 유세포 분석기를 사용하여 즉시 세포를 분석합니다. 검출 시약의 형광 라벨과 생존도 염료가 적절한 positive 및 negative control을 사용하여 적절하게 보상되었는지 확인합니다.
  6. 다음 게이팅 전략을 사용하여 CAR 발현을 평가합니다: FSC-A 대 SSC-A 플롯을 사용하여 셀에 대한 게이트; FSC-A 대 FSC-H 플롯을 사용하는 단일 셀의 게이트; 7-AAD 염색을 사용하여 살아있는 세포를 게이트합니다.
  7. 항인간 IgG F(ab')2 항체에 의해 염색된 살아있는 T 세포의 비율을 계산합니다. CAR-T 세포를 염색을 최소화해야 하는 음성 대조군 T 세포와 비교합니다.

4. CAR-T 세포 기능 분석

  1. 세포독성 분석
    1. 표적 종양 세포가 CAR이 인식할 수 있는 형태로 항원을 발현하는지 확인합니다. 항원 발현을 확인하기 위해 CAR이 유래된 모 항체를 사용하여 유세포 분석으로 종양 세포를 분석합니다. CAR이 종양 세포를 인식할 수 없으면 CAR-T 세포는 종양 세포를 죽이지 못합니다.
    2. 세포 표면에서 CAR의 항원을 발현하는 표적 종양 세포를 준비합니다. 37°C에서 1분 동안 0.05% 트립신-EDTA 용액으로 부착된 종양 세포를 트립신화하고 1-4 x 105 cells/mL에서 적절한 배양 배지로 단일 세포 현탁액을 준비합니다.
      참고: 종양 세포는 후속 단계에서 정확한 분석을 보장하기 위해 잘 부착되어야 합니다. 종양 세포가 잘 부착되지 않거나 쉽게 분리되거나 현탁액으로 자라는 경우 다음 단계에서 사용된 플레이트의 웰을 적절한 항체, 다양이온 폴리머 또는 피브로넥틴이나 콜라겐과 같은 생물학적 물질로 코팅하여 세포 부착을 용이하게 합니다.
    3. E-플레이트를 준비합니다( 재료 표 참조). 실험 설정을 설계합니다. 예열된 종양 세포 배양 배지 50μL를 각 웰에 추가하고 E-플레이트를 실시간 세포 분석(RTCA) 기기에 배치하여 백그라운드 임피던스를 측정합니다. 3회 스윕에 대해 측정(또는 스윕)당 1분에 임피던스를 측정합니다.
      알림: 배경 임피던스는 셀 인덱스를 0으로 설정하는 데 사용됩니다. 백그라운드 임피던스 측정이 없으면 웰을 서로 비교할 수 없어 결과를 해석할 수 없게 됩니다.
    4. RTCA 기기에서 E-Plate를 제거하고 각 웰에 100μL의 종양 세포 현탁액을 추가합니다. 따라서 각 웰에는 총 부피 150μL에 1−4 x 104 개의 셀이 포함되어 있습니다.
      참고: 각 웰에 파종할 종양 세포의 수는 실험 전에 결정해야 합니다. 다양한 세포 번호로 E-Plate를 시딩한 다음 다음 24-48시간 동안 세포 인덱스를 모니터링합니다. 원하는 수의 세포는 정체 없이 최소 24시간 동안 세포 지수의 꾸준한 증가를 유지합니다. 과도한 세포 파종은 영양 고갈과 중간 산성화를 가속화하여 세포 지수의 조기 정체를 초래할 수 있습니다. 또한 잠재적인 이상치 측정을 식별하기 위해 각 그룹에 대해 복제 우물을 포함해야 합니다.
    5. 30분 동안 실온에서 E-Plate를 평형화합니다. 이 단계를 통해 종양 세포가 침전되어 웰 바닥에 부착될 수 있습니다.
      참고: 이 단계는 정확한 세포 지수 측정을 위해 필요합니다. 이 단계를 건너뛰면 일반적으로 세포 지수 측정에서 well-to-well 변동성이 발생하고 웰 내 종양 세포 접착이 고르지 않아 분석에서 노이즈가 증가합니다.
    6. E-Plate를 RTCA 기기에 다시 놓고 24-5분마다 스윕을 수행하면서 약 15시간 동안 셀 인덱스를 모니터링합니다.
    7. 다음날 CAR-T 세포 현탁액을 준비합니다. RPMI 1640 배지와 10% FBS의 2.10단계에서 CAR-T 세포(효과기 세포)를 종양 세포(표적 세포) 및 원하는 효과기:표적(E:T) 세포 비율에 의해 결정된 농도로 현탁시킵니다. 예를 들어, 종양 세포 현탁액의 밀도가 2 x 105 cells/mL이고 10:1의 E:T 비율이 필요한 경우 CAR-T 세포는 2 x 106 cells/mL로 현탁해야 합니다. 종양 세포 단독(effector 세포 없음) 및 대조 T 세포(mRNA 없이 또는 대조군 mRNA와 함께 전기천공된 T 세포)와 같은 적절한 대조군을 포함합니다.
      참고: 최적의 결과를 얻으려면 표면 CAR 발현이 높을 때 전기천공 후 1-2일 후에 CAR-T 세포를 사용하십시오. 최적의 E:T 비율을 탐색하기 위해 E:T 비율 범위(예: 3:1에서 20:1)를 테스트할 수 있습니다. CAR-T 빈도가 매우 낮지 않는 한, 즉 10% 미만이 아닌 한, 10:1 또는 20:1의 E:T 비율은 일반적으로 종양 세포의 거의 완전한 사멸을 달성하기에 충분합니다.
    8. 세포 인덱스 기록을 일시 중지하고 RTCA 기기에서 E-Plate를 제거합니다.
    9. 플레이트를 약간 기울여 종양 세포를 건드리지 않고 각 웰에서 50μL의 배양 배지를 조심스럽게 제거한 다음 각 웰에 100μL의 CAR-T 세포 또는 대조군 T 세포를 추가합니다.
    10. E-Plate를 RTCA 기기로 되돌리고 5-15분마다 스윕을 수행하여 최소 24시간 동안 세포 인덱스 모니터링을 재개합니다.
      참고: 세포 인덱스 모니터링 기간은 CAR-T 세포가 종양 세포를 얼마나 빨리 표적으로 삼는지에 따라 달라집니다. 일반적으로 24시간의 배양 기간은 CAR-T 세포가 최대 세포독성 효과를 발휘하기에 충분합니다.
    11. 세포 지수 모니터링을 중지하고 RTCA 기기에서 E-Plate를 제거한 다음 세포 독성 결과를 분석합니다. 세포 독성을 CAR-T 세포에 의해 사멸된 종양 세포의 비율로 계산합니다. RTCA 소프트웨어를 사용하여 CAR-T 세포의 평균 세포 독성을 계산하고 T 세포를 제어합니다. 세포 독성을 수동으로 계산하려면 다음 공식을 사용하십시오.
      세포독성 = ((종양 세포의 세포 지수) - (종양 세포와 효과기 세포의 세포 지수)) / (종양 세포의 세포 지수) × 100%.
  2. 사이토카인 분비 분석
    1. 세포독성 분석 시 CAR-T 세포에서 분비되는 IFN-Υ와 같은 사이토카인을 분석하기 위해 E-Plate의 상층액을 둥근 바닥 또는 V자형 96웰 플레이트로 옮깁니다.
      참고: 사이토카인 분비의 시간 경과 분석이 필요한 경우, 4.1.10단계에서 세포 인덱스 모니터링을 일시 중지하고, 각 웰에서 상층액의 작은 부분을 수집하고, E-Plate를 RTCA 기기로 다시 반환하고, 모니터링을 재개합니다.
    2. 96웰 플레이트를 300 x g 에서 RT에서 5분 동안 원심분리합니다. 세포 펠릿을 방해하지 않고 상층액을 새로운 96웰 플레이트로 조심스럽게 옮깁니다.
    3. 제조업체의 지침에 따라 상용 ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay) 키트를 사용하여 상등액의 사이토카인 수치를 측정합니다. 상등액은 일반적으로 측정 전에 희석이 필요하며, 분석되는 사이토카인에 따라 100배 이상 희석해야 하는 경우도 있습니다.
    4. 연속으로 희석된 표준물질에서 생성된 표준 곡선에 대해 샘플 흡광도 값을 보간하여 데이터를 분석합니다. 적절한 소프트웨어를 사용하여 평균 ± 표준 편차(SD)를 나타내는 오차 막대가 있는 그래프를 준비합니다. 처리 간의 차이를 비교하기 위해 Student's t test를 수행할 수 있습니다. p-값이 0.05 미만이면 일반적으로 통계적으로 유의한 것으로 간주됩니다.
      참고: 실험 오류로 인한 것일 수 있는 명확한 이상치인 데이터 포인트는 분석에서 제외해야 합니다.

결과

인간화 항-HER2 마우스 단일클론항체(mAb) 4D547, 막관통 영역, 세포내 4-1BB 공동 자극 도메인과 CD3ζ 활성화 도메인(CD3ζ 활성화 도메인)에서 유래한 scFv를 포함하는 2세대 HER2 표적 CAR을 구축했습니다(그림 1A). CAR을 암호화하는 DNA 염기서열에는 CAR mRNA의 in vitro 전사를 유도하기 위한 5' SP6 promoter가 포함되어 있습니다(

토론

이 연구에서는 일시적인 CAR-T 세포를 생성하기 위한 상세한 비바이러스, 비통합 접근 방식을 설명하고 CAR-T 세포 기능을 평가하기 위한 기술 절차를 제공합니다. 이 접근법은 영구적이고 무작위적인 CAR 전이유전자 전달을 위해 기존의 레트로바이러스 및 렌티바이러스 벡터를 사용하지 않고, 대신 전기천공법을 활용하여 in vitro modified CAR mRNA를 T 세포에 효율적으로 ?...

공개

저자인 Liang Hu, Robert Berahovich, Yanwei Huang, Shiming Zhang, Jinying Sun, Xianghong Liu, Hua Zhou, Shirley, Xu, Haoqi Li 및 Vita Golubovskaya는 ProMab Biotechnologies의 직원입니다. Lijun Wu는 ProMab Biotechnologies의 직원이자 주주입니다.

감사의 말

이 연구는 ProMab Biotechnologies의 지원을 받았습니다.

자료

NameCompanyCatalog NumberComments
7-AAD viability dye Biolegend420404
ACEA Novocyte flow cytometerAgilentNovoCyte 3000
AIM-V mediumGibco12055083
APC goat anti-human IgG F(ab')2 antibodyJackson ImmunoResearch Laboratories109-136-097
BglII Restriction EnzymeNew England BioLabs (NEB)R0144L
3´-O-Me-m7G(5')ppp(5')G RNA Cap Structure AnalogNEBS1411S
DMEM, high glucoseGibco11965092
Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28 beadsGibco11131D
E-Plate 96Agilent5232376001
EthanolSigma459844-4L
FBSLonza.com14-503F
HiScribe SP6 RNA Synthesis KitNew England BioLabs (NEB)E2070S
Human IL-2 Recombinant ProteinGibco15140122
Millennium RNA MarkersInvitrogenAM7150
Monarch RNA Cleanup Kit (500 μg)NEBT2050L
N1-Methylpseudo-UTPTrilinkN-1081-10
Neon Transfection InstrumentInvitrogenMPK5000
Neon Transfection System 100-μL KitInvitrogenMPK10096
Penicillin-Streptomycin (10000 U/mL)Gibco14-503F
RPMI 1640 MediumGibco11875135
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol redGibco25300120
UltraPure Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol (25:24:1, v/v)Invitrogen15593049
xCELLigence Real-Time Cell Analysis (RTCA) instrumentAgilentRTCA MP
ZymoPURE II Plasmid Midiprep KitZymo ResearchD4201

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