A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
Method Article
يقدم البروتوكول نهجا تدريجيا جديدا لإنتاج خزعة من حافة الصيوان (PEB) في يوم ما بعد الولادة (PND) 7 فئران لغرض تحديد التنميط الجيني المتزامن.
غالبا ما يكون تحديد الفئران وتنويطه الجيني جزءا أساسيا من العديد من الدراسات العلمية في الجسم الحي . تم وصف عدة طرق لتحديد الفئران المفطومة والتنميط الجيني. ومع ذلك ، حتى الآن ، هناك عدد أقل بكثير من التقنيات الموصوفة للفئران قبل الفطام. خزعة Pinna Edge (PEB) هي طريقة لتحديد الهوية مع الاستخدام اللاحق للأنسجة للتنميط الجيني. تصف هذه المقالة وتوفر تعليمات فيديو حول نهج تدريجي ل PEB في يوم ما بعد الولادة (PND) 7 فئران. تم تحديد ثمانية أنماط مختلفة من موقع وتقنية خزعة الصيوان التي ثبت أنها تستمر حتى مرحلة البلوغ لتحديد الهوية. تناقش هذه المقالة أيضا طرق تحسين PEB وتوضح التأثير الحميد لهذه التقنية على نمو وتطور الجراء ، حيث تظهر جميع الفئران زيادة مناسبة في الوزن دون أي مراضة أو وفيات طوال الدراسة. ستوفر هذه التقنية للمحققين طريقة لتحديد الفئران في سن لا تتوفر فيها سوى عدد قليل من طرق تحديد الهوية والتنميط الجيني.
في بعض الدراسات العلمية ، يمكن أن تكون طريقة تحديد الفأر ووضعه الجيني في نفس الوقت أمرا بالغ الأهمية. عند استخدام نموذج الفأر ، هناك العديد من الطرق شائعة الاستخدام التي تم تطويرها للتنميط الجيني وتحديد في نفس الوقت (على سبيل المثال ، تثقيب الأذن ، وعلامات الأذن) ، والطرق الأخرى التي تحدد فقط (على سبيل المثال ، الوشم ، وزرع جهاز الإرسال والاستقبال تحت الجلد ، وتطبيق العلامة أو الصبغة) أو النمط الجيني فقط (على سبيل المثال ، خزعة الذيل) 1،2. تهدف معظم هذه التقنيات إلى إجراؤها في وقت الفطام. تقنيات التعرف على الأصغر سنا قبل الفطام وتصنيفها الجيني في وقت واحد أقل1،2،3،4.
للمساعدة في العمل الذي يتطلب تحديد الفئران وتنويطه الجيني في الأعمار الأصغر ، تم إجراء دراسة للتحقق من صحة PEB كطريقة موثوقة لتحديد التنميط والنميط الجيني لصغار PND 7 ومقارنتها باستخدام PEB في الفئران التي تم فطومها في PND 215. كما تفاصيل هذه الدراسة ، تم اختيار شرائح الصيوان الأفقية والرأسية لأن دراسة سابقة باستخدام جثث الجرو PND 7 وجدت أن أنماط الصيوان التي تم إنشاؤها باستخدام PEB كانت واضحة وسريعة وقدمت مجموعة متنوعة من مجموعات الأنماط ، ويمكن التعرف عليها ، وكان من السهل إزالةالأنسجة 5. كما تم استكشاف طرق أخرى ، مثل لكمات الأذن وشقوق الأذن ، ولكن لم تكن هناك مساحة سطح كافية على صغار PND 7 لإنشاء لكمات دائرية كاملة أو شقوق. أدى هذا العمل الأولي إلى دراسة المشار إليها لاختبار هذه الأنماط في الفئران الحية PND 75. أظهرت هذه الدراسة أنه يمكن استخدام حجم الأنسجة المسترجع من خزعة صيوان الأذن للتنميط الجيني الناجح. كانت أنماط PEB سليمة أيضا كفئران تتراوح أعمارها بين PND 63 ، بغض النظر عن وقت أخذ خزعة من الصيوان في PND 7 أو PND 215.
الهدف من تطوير هذه التقنية هو توفير طريقة تحديد وتنميط جيني متزامنة للحيوانات التي تتراوح أعمارها بين 7 و 14 عاما والتي ، وفقا للأدبيات الحالية ، ليس لديها طريقة متاحة. توضح المقالة الحالية ، مصحوبة بالفيديو الموجه ، كيفية إجراء خزعة الأذن على حافة الصيوان لأذن الفأر لمدة 7 أيام لتحديد واسترداد كمية كافية من الأنسجة في نفس الوقت للتنميط الجيني PCR. هناك ثماني مجموعات مختلفة من الخزعة وواحدة بدون خزعة ليصبح المجموع تسعة أنماط صيوان متاحة للاستخدام لتحديد الفئران الفردية. تتم مناقشة النصائح حول إجراء خزعات الصيوان لتحقيق أقصى قدر من النجاح للتعرف الواضح على أنماط الصيوان المختلفة في صنوبر PND 7.
تم تنفيذ جميع الإجراءات الموضحة في البروتوكول وفقا لدليل المعاهد الوطنية للصحة لرعاية واستخدام المختبر6 وتمت الموافقة عليها من قبل لجنة رعاية واستخدام المؤسسية (IACUC) التابعة لمستشفى ماساتشوستس العام (MGH). تم اختبار طريقة تحديد الهوية الموضحة أدناه في الفئران C57BL / 6NCrl من كلا الجنسين5. لم يتم استخدام هذه الطريقة في السلالات أو الأسهم أو الجينات المعدلة وراثيا الأخرى. قد لا يكون تحديد خزعة الصيوان مناسبا للفئران التي لديها قدرة شفاء متزايدة (على سبيل المثال ، سلالة الفأر MRL)7.
1. ضبط النفس جرو الفأر
2. اختيار نمط خزعة الصيوان
3. خزعة حافة بينا
يوضح الشكل 1 طريقة يدوية لتقييد فئران PND 7 بلطف بحيث تكون آذانها مرئية للتلاعب. يستخدم التقييد الإبهام والسبابة لإمساك الجلد الزائد للقفص. تعتمد كمية الجلد الممسكة على عمر ، مع توفر أنسجة أقل في الصغيرة.
تم اختبار أنماط PEB المدرجة في
الأهمية فيما يتعلق بالأساليب الحالية
ذكرت المقالات السابقة أنه بالنسبة لحيوانات PND 14 والأصغر سنا ، قد لا تكون الصيوان مناسبة للتلاعب بسبب صغر حجمها 2,3. في حين أن أنظمة تحديد الأذن الحالية مثل خزعات الأذن أو إحراز الأذن أو علاما?...
ليس لدى المؤلفين أي شيء يكشفون عنه.
يود المؤلفون أن يشكروا الدكتورين لوري إس بالي ودونا إم جاريل ، مؤلفا الورقة الأصلية في هذا العمل ، على مساهماتهم.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Dissection scissors | Kent Scientific | INS600393-G | 10 cm long |
McPherson-Vannas Scissors | Kent Scientific | INS600124 | 8 cm long |
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionThis article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved