تحديد الفئران البالغة من العمر 7 أيام قبل الفطام باستخدام خزعات Pinna Edge

Summary

يقدم البروتوكول نهجا تدريجيا جديدا لإنتاج خزعة من حافة الصيوان (PEB) في يوم ما بعد الولادة (PND) 7 فئران لغرض تحديد التنميط الجيني المتزامن.

Abstract

غالبا ما يكون تحديد الفئران وتنويطه الجيني جزءا أساسيا من العديد من الدراسات العلمية في الجسم الحي . تم وصف عدة طرق لتحديد الفئران المفطومة والتنميط الجيني. ومع ذلك ، حتى الآن ، هناك عدد أقل بكثير من التقنيات الموصوفة للفئران قبل الفطام. خزعة Pinna Edge (PEB) هي طريقة لتحديد الهوية مع الاستخدام اللاحق للأنسجة للتنميط الجيني. تصف هذه المقالة وتوفر تعليمات فيديو حول نهج تدريجي ل PEB في يوم ما بعد الولادة (PND) 7 فئران. تم تحديد ثمانية أنماط مختلفة من موقع وتقنية خزعة الصيوان التي ثبت أنها تستمر حتى مرحلة البلوغ لتحديد الهوية. تناقش هذه المقالة أيضا طرق تحسين PEB وتوضح التأثير الحميد لهذه التقنية على نمو وتطور الجراء ، حيث تظهر جميع الفئران زيادة مناسبة في الوزن دون أي مراضة أو وفيات طوال الدراسة. ستوفر هذه التقنية للمحققين طريقة لتحديد الفئران في سن لا تتوفر فيها سوى عدد قليل من طرق تحديد الهوية والتنميط الجيني.

Introduction

في بعض الدراسات العلمية ، يمكن أن تكون طريقة تحديد الفأر ووضعه الجيني في نفس الوقت أمرا بالغ الأهمية. عند استخدام نموذج الفأر ، هناك العديد من الطرق شائعة الاستخدام التي تم تطويرها للتنميط الجيني وتحديد في نفس الوقت (على سبيل المثال ، تثقيب الأذن ، وعلامات الأذن) ، والطرق الأخرى التي تحدد فقط (على سبيل المثال ، الوشم ، وزرع جهاز الإرسال والاستقبال تحت الجلد ، وتطبيق العلامة أو الصبغة) أو النمط الجيني فقط (على سبيل المثال ، خزعة الذيل) ^1،2. تهدف معظم هذه التقنيات إلى إجراؤها في وقت الفطام. تقنيات التعرف على الأصغر سنا قبل الفطام وتصنيفها الجيني في وقت واحد أقل^1،2،3،4.

للمساعدة في العمل الذي يتطلب تحديد الفئران وتنويطه الجيني في الأعمار الأصغر ، تم إجراء دراسة للتحقق من صحة PEB كطريقة موثوقة لتحديد التنميط والنميط الجيني لصغار PND 7 ومقارنتها باستخدام PEB في الفئران التي تم فطومها في PND 21⁵. كما تفاصيل هذه الدراسة ، تم اختيار شرائح الصيوان الأفقية والرأسية لأن دراسة سابقة باستخدام جثث الجرو PND 7 وجدت أن أنماط الصيوان التي تم إنشاؤها باستخدام PEB كانت واضحة وسريعة وقدمت مجموعة متنوعة من مجموعات الأنماط ، ويمكن التعرف عليها ، وكان من السهل إزالة^{الأنسجة 5}. كما تم استكشاف طرق أخرى ، مثل لكمات الأذن وشقوق الأذن ، ولكن لم تكن هناك مساحة سطح كافية على صغار PND 7 لإنشاء لكمات دائرية كاملة أو شقوق. أدى هذا العمل الأولي إلى دراسة المشار إليها لاختبار هذه الأنماط في الفئران الحية PND 7⁵. أظهرت هذه الدراسة أنه يمكن استخدام حجم الأنسجة المسترجع من خزعة صيوان الأذن للتنميط الجيني الناجح. كانت أنماط PEB سليمة أيضا كفئران تتراوح أعمارها بين PND 63 ، بغض النظر عن وقت أخذ خزعة من الصيوان في PND 7 أو PND 21⁵.

الهدف من تطوير هذه التقنية هو توفير طريقة تحديد وتنميط جيني متزامنة للحيوانات التي تتراوح أعمارها بين 7 و 14 عاما والتي ، وفقا للأدبيات الحالية ، ليس لديها طريقة متاحة. توضح المقالة الحالية ، مصحوبة بالفيديو الموجه ، كيفية إجراء خزعة الأذن على حافة الصيوان لأذن الفأر لمدة 7 أيام لتحديد واسترداد كمية كافية من الأنسجة في نفس الوقت للتنميط الجيني PCR. هناك ثماني مجموعات مختلفة من الخزعة وواحدة بدون خزعة ليصبح المجموع تسعة أنماط صيوان متاحة للاستخدام لتحديد الفئران الفردية. تتم مناقشة النصائح حول إجراء خزعات الصيوان لتحقيق أقصى قدر من النجاح للتعرف الواضح على أنماط الصيوان المختلفة في صنوبر PND 7.

Protocol

تم تنفيذ جميع الإجراءات الموضحة في البروتوكول وفقا لدليل المعاهد الوطنية للصحة لرعاية واستخدام المختبر⁶ وتمت الموافقة عليها من قبل لجنة رعاية واستخدام المؤسسية (IACUC) التابعة لمستشفى ماساتشوستس العام (MGH). تم اختبار طريقة تحديد الهوية الموضحة أدناه في الفئران C57BL / 6NCrl من كلا الجنسين⁵. لم يتم استخدام هذه الطريقة في السلالات أو الأسهم أو الجينات المعدلة وراثيا الأخرى. قد لا يكون تحديد خزعة الصيوان مناسبا للفئران التي لديها قدرة شفاء متزايدة (على سبيل المثال ، سلالة الفأر MRL)⁷.

1. ضبط النفس جرو الفأر

1. تأكد من أن الماوس PND 7 أو أقدم. إذا كان الماوس أصغر من PND 7 ، فقد لا تكون طريقة PEB هذه ممكنة.
2. كبح جماح الماوس برفق بطريقة تسمح بالتصور والوصول إلى الأذنين. التقط الجرو من قاعدة الذيل بيد المستخدم غير المهيمنة وانقله إلى سطح ثابت.
3. ضع ضغطا برفق على طول ظهر الجرو بإبهام والسبابة من اليد المهيمنة حتى يمكن ضغط الجلد المترهل بين الأذنين. اضغط على الجلد بإحكام بما يكفي حتى لا يتحرك الرأس بحرية ، ولكن تأكد من أن يتنفس بشكل طبيعي (الشكل 1).
4. إذا تم تقييد باليد اليسرى ، فتأكد من أن الجرو في وضع يجعل الوصول إلى صيوان الأذن اليمنى (على سبيل المثال ، أنف الجرو متجها بعيدا عن جسم اليد). للوصول إلى الصيوان في الأذن اليسرى ، قم بتثبيت الإمساك باليد بحيث يواجه الجانب الأيسر من المعالج.
5. إذا تم تقييد باليد اليمنى ، فتأكد من أن الجرو في وضع يجعل الوصول إلى صيوان الأذن اليسرى يسهل الوصول إليه (على سبيل المثال ، أنف الجرو متجها بعيدا عن جسم المعالج). للوصول إلى الصيوان في الأذن اليمنى ، قم بتثبيت اليد التي تمسك بالحيوان بحيث يواجه الجانب الأيمن من المعالج.

2. اختيار نمط خزعة الصيوان

1. استخدم ما مجموعه تسعة أنماط مع ثمانية أنماط PEB ونمط واحد بدون خزعة (الشكل 2). حدد نمط PEB وسجله.

3. خزعة حافة بينا

1. استخدم أدوات نظيفة لكل خزعة. يوصى باستخدام مقص تشريح صغير أو مقص McPherson-Vannas (انظر جدول المواد). رش الأدوات بالمطهرات وامسحها بمحلول 70٪ من كحول الأيزوبروبيل بعد كل استخدام.
2. امسك المقص باليد المهيمنة.
3. لإنشاء PEB عمودي ، قم بقص الحافة الجانبية للصيوان في اتجاه رأسي بحيث تتم إزالة ما يقرب من 1/4^إلى 1/3^rd من إجمالي الصيوان (أي حوالي 0.8 مم × 3 مم من الأنسجة) من جانب الأذن (الشكل 3G).
4. لإنشاء PEB أفقي ، قم بقص الحافة الظهرية للصيوان بحيث تتم إزالة ما يقرب من 1/^{4 إلى 1} /3^rd من إجمالي الصيوان (أي حوالي 0.8 مم × 3 مم من الأنسجة) (الشكل 3H). قم بعمل القطع بزاوية 45 درجة بدلا من خط مستقيم (الشكل 4). تفسر الزاوية تطور الأذن ونموها بمرور الوقت وتضمن بقاء النمط أفقيا بطبيعته.
   1. أنماط الصيوان الثمانية هي مزيج من PEB الرأسي و PEB الأفقي إما على اليسار أو اليمين أو كليهما. قم بعمل أنماط خزعة الصيوان الثمانية التالية: الرأسي الأيسر (LV) ، الرأسي الأيمن (RV) ، الأفقي الأيسر (LH) ، الأفقي الأيمن (RH) ، الرأسي الأيسر والأفقي الأيمن (LVRH) ، الرأسي الأيسر واليمين (LVRV) ، الأفقي الأيسر واليمين الأفقي (LHRH) ، والرأسي الأيسر والرأسي الأيمن (LHRV).
5. استخدم ملقطا دقيقا لإيداع أنسجة الصيوان المستأصلة بعناية في حاوية عينة لاستخدامها في التنميط الجيني.
   1. إذا كان الدم يتجمع من موقع خزعة الصيوان ، وهو أمر غير محتمل ، مع اليد المهيمنة وبينما لا يزال مقيدا ، فاستخدم قطعة من الشاش النظيف أو قضيب طرف قطني للضغط على موقع النزيف حتى يتوقف النزيف.
6. ضع الجرو برفق في القفص مع السد. راقب الجراء لمدة 1-2 دقيقة بعد وضعها مرة أخرى في القفص لتقييم أي نزيف آخر من موقع PEB.

النتائج

يوضح الشكل 1 طريقة يدوية لتقييد فئران PND 7 بلطف بحيث تكون آذانها مرئية للتلاعب. يستخدم التقييد الإبهام والسبابة لإمساك الجلد الزائد للقفص. تعتمد كمية الجلد الممسكة على عمر ، مع توفر أنسجة أقل في الصغيرة.

تم اختبار أنماط PEB المدرجة في

Discussion

الأهمية فيما يتعلق بالأساليب الحالية
ذكرت المقالات السابقة أنه بالنسبة لحيوانات PND 14 والأصغر سنا ، قد لا تكون الصيوان مناسبة للتلاعب بسبب صغر حجمها ^2,3. في حين أن أنظمة تحديد الأذن الحالية مثل خزعات الأذن أو إحراز الأذن أو علاما?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dissection scissors	Kent Scientific	INS600393-G	10 cm long
McPherson-Vannas Scissors	Kent Scientific	INS600124	8 cm long