用耳廓边缘活检鉴定断奶前 7 日龄小鼠

摘要

该方案提出了一种新的逐步方法，用于在出生后第 7 天 （PND） 7 小鼠中产生耳廓边缘活检 （PEB），以进行鉴定和同步基因分型。

摘要

小鼠的鉴定和基因分型通常是许多 体内 科学研究的重要组成部分。已经描述了几种用于断奶小鼠鉴定和基因分型的方法;然而，迄今为止，针对断奶前小鼠描述的技术要少得多。耳廓边缘活检 （PEB） 是一种识别方法，随后使用组织进行基因分型。本文介绍并提供了有关出生后 （PND） 7 小鼠 PEB 逐步方法的视频说明。概述了耳廓活检位置和技术的八种不同模式，这些模式已被证明可以持续到成年以进行识别。本文还讨论了优化 PEB 的方法，并展示了该技术对幼崽生长发育的良性影响，在整个研究过程中，所有小鼠都表现出适当的体重增加，没有任何发病率或死亡率。这项技术将为研究人员提供一种在几乎没有识别和基因分型方法可用的年龄进行小鼠识别的方法。

引言

在某些科学研究中，识别和同时对小鼠进行基因分型的方法可能至关重要。使用小鼠模型时，已经开发了几种常用的方法来同时对动物进行基因分型和识别（例如，打耳、耳标），以及其他仅识别动物的方法（例如，纹身、皮下应答器植入、标记物或染料应用）或仅对动物进行基因分型（例如，尾部活检）^1,2.这些技术中的大多数都是在脱机时进行的。在较年轻的断奶前动物中同时识别和基因分型的技术较少 1,2,3,4。

为了帮助需要对年轻小鼠进行鉴定和基因分型的工作，进行了一项研究，以验证 PEB 是 PND 7 幼崽的可靠鉴定和基因分型方法，并将其与 PND 21⁵ 断奶小鼠中使用 PEB 进行比较。正如这项研究所详述的，之所以选择水平和垂直耳廓切片，是因为先前使用 PND 7 幼崽尸体的研究发现，使用 PEB 创建的耳廓图案清晰、快速，提供多种图案组合，可识别，并且组织易于去除⁵。还探索了其他方法，例如打耳和耳槽，但 PND 7 幼崽上没有足够的表面积来创建完整的圆形打孔或缺口。这项初步工作导致参考研究在活体 PND 7 小鼠中测试这些模式⁵。这项研究表明，从耳廓活检中检索到的组织大小可用于成功的基因分型。无论在 PND 7 或 PND 21⁵ 对耳廓进行活检时，小鼠的 PND 63 的 PEB 模式也完好无损。

该技术开发的目标是为 PND 7 至 14 岁的动物提供一种同步鉴定和基因分型方法，根据目前的文献，这些动物没有可用的方法。本文附有指导视频，说明了如何在 7 天小鼠耳朵的耳廓边缘进行耳活检，以同时识别和检索足够数量的组织进行 PCR 基因分型。有八种不同的活检组合和一种无活检的组合，总共有九种耳廓模式可用于识别个体小鼠。进一步讨论了进行耳廓活检的技巧，以最大限度地提高 PND 7 幼崽中各种耳廓模式的成功率。

研究方案

协议中概述的所有程序均按照 NIH 实验动物护理和使用指南⁶ 执行，并经马萨诸塞州总医院 （MGH） 机构动物护理和使用委员会 （IACUC） 批准。以下描述的鉴定方法已在两性的 C57BL/6NCrl 小鼠中进行了测试⁵。该方法尚未用于其他菌株、原种或转基因。耳廓活检鉴定可能不适用于愈合能力增加的小鼠（例如 MRL 小鼠品系）⁷。

1. 老鼠幼崽约束

1. 确保鼠标为 PND 7 或更低版本。如果鼠标小于 PND 7，则这种 PEB 方法可能不可行。
2. 以允许可视化和接触耳朵的方式轻轻地抑制鼠标。用使用者的非惯用手抓住幼崽的尾巴根部，并将其转移到稳定的表面上。
3. 用惯用手的拇指和食指沿着幼犬的背部轻轻按压，直到可以捏住耳朵之间松弛的皮肤。将皮肤捏得足够紧，使头部不能自由移动，但要确保动物呼吸正常（图 1）。
4. 如果用左手束缚动物，请确保幼犬处于可触及右耳廓的位置（即，幼犬的鼻子背对着手的身体）。要接触到左耳廓，请旋后抓握的手，使动物的左侧面向驯兽师。
5. 如果用右手束缚动物，请确保幼犬处于使左耳廓易于触及的位置（即，幼犬的鼻子背对着训练员的身体）。要进入右耳廓，请旋后抓住动物的手，使动物的右侧面向驯兽师。

2. 耳廓活检模式的选择

1. 总共使用九种模式，其中八种 PEB 模式和一种无活检模式（图 2）。选择并记录 PEB 模式。

3. 耳廓边缘活检

1. 每次活检使用干净的器械。建议使用小解剖剪刀或 McPherson-Vannas 剪刀（见 材料表）。每次使用后，用消毒剂喷洒器械并用 70% 异丙醇擦拭干净。
2. 用惯用手握住剪刀。
3. 要创建垂直 PEB，沿垂直方向修剪耳廓的外侧边缘，以便从耳朵侧面去除大约 1/4^至 1/3 的总耳廓（即约 0.8 毫米 x 3 毫米组织）（图 3G）。
4. 要创建水平 PEB，请修剪耳廓的背侧边缘，以便去除总耳^廓的大约 1/^{4 至 1}/3（即约 0.8 毫米 x 3 毫米组织）（图 3H）。以 45° 角而不是直线进行切割（图 4）。这个角度考虑了耳朵随着时间的推移而发育和生长，并确保模式在本质上保持水平。
   1. 八种耳廓图案是左侧、右侧或两个耳廓上的垂直 PEB 和水平 PEB 的组合。制作以下八种耳廓活检模式：左垂直 （LV）、右垂直 （RV）、左水平 （LH）、右水平 （RH）、左垂直和右水平 （LVRH）、左和右垂直 （LVRV）、左和右水平 （LHRH）和左水平和右垂直 （LHRV）。
5. 使用细镊子小心地将切除的耳廓组织放入样品容器中，用于基因分型。
   1. 如果万一血液从耳廓活检部位淤积，用惯用手，当动物仍然被束缚时，使用一块干净的纱布或棉签涂抹器对出血部位施加压力，直到出血停止。
6. 将幼犬轻轻地放回带有母乳的笼子中。将幼崽放回笼子后观察幼崽 1-2 分钟，以评估 PEB 部位是否有任何进一步的出血。

结果

图 1 说明了一种轻轻抑制 PND 7 小鼠的手动方法，以便可以看到它们的耳朵以供作。约束装置使用拇指和食指抓住 scruff 的多余皮肤。抓握的皮肤量取决于动物的年龄，较小的动物可用的组织较少。

图 2 中列出的 PEB 模式已经过测试，可在 PND 63 之前识别，并且据传闻持续时间更长（即 2 年）。

讨论

相对于现有方法的重要性
以前的文章指出，对于 PND 14 及更年轻的动物，它们的耳廓可能由于体积小而不适合作 ^2,3。虽然现有的耳识别系统（如耳穿刺活检、耳槽或耳标）可以同时进行识别和基因分型，但它们可能需要更大的耳廓，因此需要年长的小鼠进行识别。这种新颖的 PEB 方法为以前没有识别和基因分型?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dissection scissors	Kent Scientific	INS600393-G	10 cm long
McPherson-Vannas Scissors	Kent Scientific	INS600124	8 cm long