זיהוי עכברים בני 7 ימים לפני הגמילה עם ביופסיות קצה אפרכסת

Summary

הפרוטוקול מציג גישה חדשה והדרגתית להפקת ביופסיה בקצה האפרכסת (PEB) בעכברי יום לאחר הלידה (PND) לצורך זיהוי וגנוטיפ בו זמנית.

Abstract

זיהוי וגנוטיפ של עכברים הוא לעתים קרובות חלק חיוני במחקרים מדעיים רבים in vivo . תוארו מספר שיטות לזיהוי וגנוטיפ בעכברים נגמלים; עם זאת, נכון להיום, יש הרבה פחות טכניקות שתוארו עבור עכברים לפני הגמילה. Pinna Edge Biopsy (PEB) היא שיטה לזיהוי עם שימוש עוקב ברקמה לצורך גנוטיפ. מאמר זה מתאר ומספק הדרכת וידאו על גישה מדורגת ל-PEB בעכברים 7 ביום שלאחר הלידה (PND). מתוארים שמונה דפוסים שונים של מיקום וטכניקה של ביופסיית אפרכסת אפרכסת אשר הוכחו כמחזיקים מעמד לבגרות לצורך זיהוי. מאמר זה דן גם בדרכים לייעל את ה-PEB ומראה את ההשפעה השפירה שיש לטכניקה זו על הגדילה וההתפתחות של הגורים, כאשר כל העכברים מראים עלייה מתאימה במשקל ללא כל תחלואה או תמותה לאורך המחקר. טכניקה זו תספק לחוקרים שיטה לזיהוי עכברים בגיל שבו יש מעט שיטות זיהוי וגנוטיפ זמינות.

Introduction

במחקרים מדעיים מסוימים, השיטה לזהות ובו זמנית גנוטיפ של עכבר יכולה להיות מכריעה. בעת שימוש במודל עכבר, ישנן מספר שיטות נפוצות שפותחו כדי לגנוטיפ ולזהות בעלי חיים בו זמנית (למשל, ניקוב אוזניים, תיוג אוזניים), ושיטות אחרות המזהות רק בעלי חיים (למשל, קעקוע, השתלת טרנספונדר תת עורי, מריחת טוש או צבע) או רק בעלי חיים גנוטיפיים (למשל, ביופסיית זנב)^1,2. רוב הטכניקות הללו מיועדות לביצוע בזמן הגמילה. טכניקות לזיהוי וגנוטיפ בו-זמנית בבעלי חיים צעירים יותר לפני הגמילה הן פחות 1,2,3,4.

כדי לסייע בעבודה הדורשת זיהוי וגנוטיפ של עכברים בגילאים צעירים יותר, בוצע מחקר כדי לאמת את PEB כשיטת זיהוי וגנוטיפ אמינה לגורי PND 7 ולהשוות אותו לשימוש ב-PEB בעכברים שנגמלו ב-PND 21⁵. כפי שמפרט מחקר זה, פרוסות אפרכסת אופקיות ואנכיות נבחרו מכיוון שמחקר קודם שהשתמש בפגרי גורי PND 7 מצא שדפוסי אפרכסת שנוצרו באמצעות PEB היו ברורים, מהירים, סיפקו מגוון שילובי דפוסים, ניתנים לזיהוי, והרקמה הייתה קלה להסרה⁵. שיטות אחרות, כגון אגרופים באוזניים וחריצי אוזניים, נחקרו גם כן, אך לא היה מספיק שטח פנים על גורי PND 7 ליצירת אגרופים או חריצים עגולים שלמים. עבודה ראשונית זו הובילה את המחקר המוזכר לבדיקת דפוסים אלה בעכברי PND 7 חיים⁵. מחקר זה הראה כי גודל הרקמה שנשלף מהביופסיה של אפרכסת האוזן יכול לשמש לגנוטיפ מוצלח. דפוסי ה-PEB היו שלמים גם כאשר עכברים בגיל PND 63, ללא קשר למועד הביופסיה של האפרכסת ב-PND 7 או PND 21⁵.

המטרה לפיתוח טכניקה זו היא לספק שיטת זיהוי וגנוטיפ בו זמנית לבעלי חיים בגילאי PND 7 עד 14 שעל פי הספרות הנוכחית אין להם שיטה זמינה. המאמר הנוכחי, המלווה בסרטון המודרך, ממחיש כיצד לבצע ביופסיית אוזניים בקצה האפרכסת של אוזן של עכבר בן 7 ימים כדי לזהות ולאחזר בו זמנית כמות מספקת של רקמה לגנוטיפ PCR. ישנם שמונה שילובי ביופסיה שונים ואחד ללא ביופסיה בסך הכל תשעה דפוסי אפרכסת זמינים לשימוש לזיהוי עכברים בודדים. טיפים לביצוע ביופסיות אפרכסת נדונים עוד כדי למקסם את ההצלחה לזיהוי ברור של דפוסי האפרכסת השונים בגורי PND 7.

Protocol

כל ההליכים המתוארים בפרוטוקול בוצעו בהתאם למדריך ה-NIH לטיפול ושימוש בחיות מעבדה⁶ ואושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים של בית החולים הכללי של מסצ'וסטס (MGH). שיטת הזיהוי המתוארת להלן נבדקה בעכברי C57BL/6NCrl משני המינים⁵. שיטה זו לא שימשה בזנים אחרים, מניות או טרנסגנים. ייתכן שזיהוי ביופסיית אפרכסת לא יתאים לעכברים בעלי יכולת ריפוי מוגברת (למשל, זן עכבר MRL)⁷.

1. ריסון גור עכבר

1. ודא שהעכבר הוא PND 7 ומעלה. אם העכבר צעיר מ-PND 7, ייתכן ששיטת PEB זו לא תהיה ישימה.
2. רסנו בעדינות את העכבר באופן המאפשר הדמיה וגישה לאוזניים. הרימו את הגור מבסיס הזנב ביד הלא דומיננטית של המשתמש והעבירו אותו למשטח יציב.
3. הפעל לחץ עדין לאורך גב הגור עם האגודל והאצבע של היד הדומיננטית עד שניתן יהיה לצבוט את העור הרפוי בין האוזניים. צבטו את העור מספיק חזק כך שהראש לא ינוע בחופשיות, אולם וודאו שהחיה נושמת באופן רגיל (איור 1).
4. אם החיה מרוסנת ביד שמאל, ודא שהגור נמצא בתנוחה שהופכת את אפרכסת האוזן הימנית לנגישה (כלומר, אפו של הגור פונה הרחק מגופו של המטפל). כדי לגשת לאפרכסת האוזן השמאלית, השכב את היד האוחזת כך שהצד השמאלי של החיה יפנה למטפל.
5. אם החיה מרוסנת ביד ימין, ודא שהגור נמצא בתנוחה שהופכת את אפרכסת האוזן השמאלית לנגישה בקלות (כלומר, אפו של הגור פונה הרחק מגופו של המטפל). כדי לגשת לאפרכסת האוזן הימנית, הניחו את היד האוחזת בבעל החיים כך שהצד הימני של החיה יפנה למטפל.

2. בחירת תבנית ביופסיה של אפרכסת

1. השתמש בסך הכל בתשעה דפוסים עם שמונה דפוסי PEB ודפוס אחד ללא ביופסיה (איור 2). בחר והקלט תבנית PEB.

3. ביופסיית קצה אפרכסת

1. השתמש במכשירים נקיים עבור כל ביופסיה. מספריים לדיסקציה קטנה או מספריים של McPherson-Vannas מומלצים (ראה טבלת חומרים). יש לרסס את המכשירים בחומרי חיטוי ולנגב עם 70% אלכוהול איזופרופיל לאחר כל שימוש.
2. החזק את המספריים ביד הדומיננטית.
3. כדי ליצור PEB אנכי, חתכו את הקצה הצדדי של האפרכסת בכיוון אנכי כך שכ-1/^{4 עד 1} /³ מהאצטרובל הכולל (כלומר, כ-0.8 מ"מ על 3 מ"מ רקמה) יוסרו מהצד של האוזן (איור 3G).
4. כדי ליצור PEB אופקי, חתכו את הקצה הגבי של האפרכסת כך שבערך 1/^{4 עד 1} /^{3 מכלל} האפרכסת (כלומר, כ-0.8 מ"מ על 3 מ"מ רקמה) יוסרו (איור 3H). בצע את החיתוך בזווית של 45 מעלות במקום קו ישר (איור 4). הזווית לוקחת בחשבון את התפתחות האוזן וצמיחתה לאורך זמן ומבטיחה שהתבנית תישאר אופקית בטבעה.
   1. שמונת דפוסי האפרכסת הם שילוב של ה-PEB האנכי וה-PEB האופקי בצד שמאל, ימין או שניהם. בצע את שמונה דפוסי הביופסיה הבאים של אפרכסת הכתובת: אנכי שמאל (LV), אנכי ימני (RV), אופקי שמאל (LH), אופקי ימני (RH), אנכי שמאל וימני אופקי (LVRH), אנכי שמאל וימין (LVRV), אופקי שמאל וימין (LHRH), ואופקי שמאל וימין אנכי (LHRV).
5. השתמש במלקחיים עדינים כדי להפקיד בזהירות את רקמת האפרכסת שנכרתה במיכל דגימה שישמש לגנוטיפ.
   1. אם במקרה הלא סביר שדם מצטבר מאתר הביופסיה של האפרכסת, ביד הדומיננטית ובזמן שהחיה עדיין מרוסנת, השתמש בחתיכת גזה נקייה או באפליקטור עם קצה כותנה כדי להפעיל לחץ על מקום הדימום עד שהדימום ייפסק.
6. הנח את הגור בעדינות בחזרה לכלוב עם הסכר. התבוננו בגורים במשך 1-2 דקות לאחר החזרתם לכלוב כדי להעריך אם יש דימום נוסף מאתר ה-PEB.

תוצאות

איור 1 מדגים שיטה ידנית לריסון עדין של עכברי PND 7 כך שהאוזניים שלהם יהיו גלויות למניפולציה. הריסון משתמש באגודל ובאצבע המורה כדי לתפוס את עודפי העור של הקשקוש. כמות העור שנתפסת תלויה בגיל החיה, עם פחות רקמה זמינה בבעלי חיים קטנים יותר.

דפוסי ?...

Discussion

משמעויות ביחס לשיטות הקיימות
מאמרים קודמים קבעו כי עבור בעלי חיים PND 14 ומטה, ייתכן שהאפרכסת שלהם לא תתאים למניפולציה בגלל הגודל הקטן ^2,3. בעוד שמערכות זיהוי אוזניים קיימות כגון ביופסיות ניקוב אוזניים, חריץ אוזניים או תגי אוזניים...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dissection scissors	Kent Scientific	INS600393-G	10 cm long
McPherson-Vannas Scissors	Kent Scientific	INS600124	8 cm long