Identification de souris de 7 jours en pré-sevrage avec biopsies du bord du pavillon de l’oreille

Résumé

Le protocole présente une nouvelle approche par étapes pour produire une biopsie du bord du pavillon (PEB) chez des souris du jour postnatal (JPN) 7 à des fins d’identification et de génotypage simultané.

Résumé

L’identification et le génotypage des souris sont souvent une partie essentielle de nombreuses études scientifiques in vivo . Plusieurs méthodes d’identification et de génotypage ont été décrites chez les souris sevrées ; Cependant, à ce jour, il existe beaucoup moins de techniques décrites pour les souris pré-sevrées. La biopsie du bord de l’oreille (PEB) est une méthode d’identification avec utilisation ultérieure de tissus pour le génotypage. Cet article décrit et fournit des instructions vidéo sur une approche par étapes de l’EPB chez les souris du jour postnatal (JPN) 7. Huit modèles différents de localisation et de technique de biopsie du pavillon de l’oreille sont décrits, qui se sont avérés durables jusqu’à l’âge adulte pour l’identification. Cet article traite également des moyens d’optimiser le PEB et montre l’effet bénin de cette technique sur la croissance et le développement des petits, toutes les souris montrant un gain de poids approprié sans aucune morbidité ou mortalité tout au long de l’étude. Cette technique fournira aux chercheurs une méthode d’identification des souris à un âge où il existe peu de méthodes d’identification et de génotypage.

Introduction

Dans certaines études scientifiques, la méthode permettant d’identifier et de génotyper simultanément une souris peut être cruciale. Lors de l’utilisation d’un modèle murin, il existe plusieurs méthodes couramment utilisées qui ont été développées pour génotyper et identifier les animaux en même temps (par exemple, le poinçonnage d’oreille, le marquage d’oreille), et d’autres méthodes qui identifient uniquement les animaux (par exemple, le tatouage, l’implantation d’un transpondeur sous-cutané, l’application de marqueurs ou de colorants) ou uniquement le génotypage des animaux (par exemple, la biopsie de la queue^)1,2. La plupart de ces techniques sont destinées à être réalisées au moment du sevrage. Les techniques d’identification et de génotypage simultanées chez les jeunes animaux pré-sevrés sont moins nombreuses 1,2,3,4.

Pour faciliter les travaux qui nécessitent l’identification et le génotypage des souris à un plus jeune âge, une étude a été réalisée pour valider le PEB comme méthode fiable d’identification et de génotypage pour les petits du JPN 7 et la comparer à l’utilisation du PEB chez les souris sevrées au JPN 21⁵. Comme le détaille cette étude, les tranches de pavillon horizontales et verticales ont été sélectionnées parce qu’une étude antérieure utilisant des carcasses de petits du JPN 7 a révélé que les motifs du pavillon créés à l’aide du PEB étaient clairs, rapides, fournissaient une variété de combinaisons de motifs, identifiables et que le tissu était facile à enlever⁵. D’autres méthodes, telles que les poinçons d’oreille et les encoches d’oreille, ont également été explorées, mais il n’y avait pas assez de surface sur les petits du JPN 7 pour la création de poinçons ou d’encoches circulaires complets. Ce travail préliminaire a conduit l’étude référencée à tester ces modèles chez des souris PND 7 5 vivantes^. Cette étude a montré que la taille du tissu prélevée à partir de la biopsie du pavillon de l’oreille peut être utilisée pour un génotypage réussi. Les profils de PEB étaient également intacts chez les souris âgées jusqu’au JPN 63, quel que soit le moment où le pavillon a été biopsié au JPN 7 ou au JPN 21⁵.

L’objectif du développement de cette technique est de fournir une méthode d’identification et de génotypage simultanée pour les animaux âgés de JPN 7 à 14 qui, selon la littérature actuelle, ne disposent pas d’une méthode. Le présent article, accompagné de la vidéo guidée, illustre comment réaliser une biopsie de l’oreille au bord du pavillon de l’oreille d’une souris de 7 jours afin d’identifier et de prélever simultanément une quantité suffisante de tissu pour le génotypage par PCR. Il existe huit combinaisons de biopsies différentes et une sans biopsie, pour un total de neuf modèles de pavillon disponibles pour identifier des souris individuelles. Des conseils sur la réalisation de biopsies du pavillon de l’oreille sont discutés plus en détail afin de maximiser le succès de l’identification claire des divers motifs du pavillon de l’oreille chez les petits du JPN 7.

Protocole

Toutes les procédures décrites dans le protocole ont été exécutées conformément au Guide des NIH pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire⁶ et approuvées par le Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) du Massachusetts General Hospital (MGH). La méthode d’identification décrite ci-dessous a été testée chez des souris C57BL/6NCrl des deux sexes⁵. Cette méthode n’a pas été utilisée dans d’autres souches, souches ou transgéniques. L’identification par biopsie du pavillon de l’oreille peut ne pas convenir aux souris qui ont une capacité de guérison accrue (p. ex., souche de souris MRL)⁷.

1. Contention du chiot souris

1. Assurez-vous que la souris est au PND 7 ou plus ancien. Si la souris est plus jeune que le JPN 7, cette méthode peut ne pas être réalisable.
2. Retenez doucement la souris de manière à permettre la visualisation et l’accès aux oreilles. Prenez le chiot par la base de la queue avec la main non dominante de l’utilisateur et transférez-le sur une surface stable.
3. Appliquez une légère pression le long du dos du chiot avec le pouce et l’index de la main dominante jusqu’à ce que la peau lâche entre les oreilles puisse être pincée. Pincez la peau suffisamment pour que la tête ne bouge pas librement, mais assurez-vous que l’animal respire normalement (figure 1).
4. Si l’animal est retenu avec la main gauche, assurez-vous que le petit est dans une position qui rend le pavillon de l’oreille droite accessible (c.-à-d. que le nez du petit est tourné vers l’extérieur du corps de la main). Pour accéder au pavillon de l’oreille gauche, supinez la main en la saisissant de manière à ce que le côté gauche de l’animal fasse face au manipulateur.
5. Si l’animal est immobilisé avec la main droite, assurez-vous que le petit est dans une position qui rend le pavillon de l’oreille gauche facilement accessible (c.-à-d. que le nez du petit est tourné vers l’extérieur du corps du maître). Pour accéder au pavillon de l’oreille droite, supinez la main qui saisit l’animal de manière à ce que le côté droit de l’animal fasse face au manipulateur.

2. Sélection du modèle de biopsie du pavillon de l’oreille

1. Utilisez un total de neuf modèles avec huit modèles PEB et un modèle sans biopsie (Figure 2). Sélectionnez et enregistrez un motif PEB.

3. Biopsie du bord du pavillon

1. Utilisez des instruments propres pour chaque biopsie. De petits ciseaux de dissection ou des ciseaux McPherson-Vannas sont recommandés (voir le tableau des matériaux). Vaporisez les instruments avec des désinfectants et essuyez-les avec de l’alcool isopropylique à 70 % après chaque utilisation.
2. Tenez les ciseaux avec la main dominante.
3. Pour créer un PEB vertical, coupez le bord latéral du pavillon dans une direction verticale de sorte qu’environ 1/4^e à 1/3^e du pavillon total (c.-à-d. environ 0,8 mm x 3 mm de tissu) soit retiré du côté de l’oreille (figure 3G).
4. Pour créer un PEB horizontal, coupez le bord dorsal du pavillon de manière à ce qu’environ 1/4^e à 1/3^e du pavillon total (c.-à-d. environ 0,8 mm x 3 mm de tissu) soit retiré (figure 3H). Faites la coupe à un angle de 45° au lieu d’une ligne droite (Figure 4). L’angle tient compte du développement et de la croissance de l’épi au fil du temps et garantit que le motif reste de nature horizontale.
   1. Les huit motifs de pavillon sont une combinaison du PEB vertical et du PEB horizontal sur la gauche, la droite ou les deux pavillons. Effectuez les huit schémas de biopsie pavillonnaire suivants : verticale gauche (VG), verticale droite (VD), horizontale gauche (LH), horizontale droite (RH), verticale gauche et horizontale droite (LVRH), verticale gauche et droite (LVRV), horizontale gauche et droite horizontale (LHRV).
5. À l’aide d’une pince fine, déposez soigneusement le tissu du pavillon excisé dans un récipient d’échantillon à utiliser pour le génotypage.
   1. Si, dans le cas peu probable où le sang s’accumule sur le site de biopsie du pavillon, avec la main dominante et alors que l’animal est encore attaché, utilisez un morceau de gaze propre ou un applicateur à embout de coton pour exercer une pression sur le site du saignement jusqu’à ce que le saignement cesse.
6. Remettez doucement le chiot dans la cage avec la digre. Observez les petits pendant 1 à 2 minutes après les avoir remis dans la cage pour évaluer s’il y a d’autres saignements du site PEB.

Résultats

La figure 1 illustre une méthode manuelle qui consiste à retenir doucement les souris PND 7 afin que leurs oreilles soient visibles pour la manipulation. La contention utilise le pouce et l’index pour saisir l’excès de peau de la peau. La quantité de peau saisie dépend de l’âge de l’animal, avec moins de tissu disponible chez les animaux plus petits.

Les profils de PEB énumérés à la figure 2<...

Discussion

Importance par rapport aux méthodes existantes
Des articles précédents ont indiqué que pour les animaux JPN 14 et moins, leur pavillon peut ne pas convenir à la manipulation en raison de la petite taille ^2,3. Bien que les systèmes d’identification de l’oreille existants, tels que les biopsies à l’emporte-pièce, l’encoche de l’oreille ou les étiquettes d’oreille, puissent effectuer à la f...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dissection scissors	Kent Scientific	INS600393-G	10 cm long
McPherson-Vannas Scissors	Kent Scientific	INS600124	8 cm long