Identifizierung von 7 Tage alten Mäusen vor dem Absetzen mit Pinna-Edge-Biopsien

Zusammenfassung

Das Protokoll stellt einen neuartigen schrittweisen Ansatz zur Herstellung einer Pinna-Edge-Biopsie (PEB) bei Mäusen nach dem geburtlichen Tag (PND) 7 zum Zwecke der Identifizierung und gleichzeitigen Genotypisierung dar.

Zusammenfassung

Die Identifizierung und Genotypisierung von Mäusen ist oft ein wesentlicher Bestandteil vieler wissenschaftlicher In-vivo-Studien . Es wurden mehrere Methoden zur Identifizierung und Genotypisierung bei entwöhnten Mäusen beschrieben; Bisher gibt es jedoch weitaus weniger Techniken, die für Mäuse vor der Entwöhnung beschrieben wurden. Die Pinna-Edge-Biopsie (PEB) ist eine Methode zur Identifizierung mit anschließender Verwendung von Gewebe für die Genotypisierung. Dieser Artikel beschreibt und bietet eine Videoanleitung zu einem schrittweisen Ansatz für PEB an 7 Mäusen am postnatalen Tag (PND). Es werden acht verschiedene Muster der Lokalisation und Technik der Ohrmuschelbiopsie skizziert, von denen gezeigt wurde, dass sie bis ins Erwachsenenalter zur Identifizierung erhalten bleiben. In diesem Artikel werden auch Möglichkeiten zur Optimierung des PEB erörtert und die gutartige Wirkung dieser Technik auf das Wachstum und die Entwicklung der Jungtiere gezeigt, wobei alle Mäuse während der gesamten Studie eine angemessene Gewichtszunahme ohne Morbidität oder Mortalität zeigten. Diese Technik wird den Forschern eine Methode zur Identifizierung von Mäusen in einem Alter an die Hand geben, in dem nur wenige Identifizierungs- und Genotypisierungsmethoden zur Verfügung stehen.

Einleitung

In bestimmten wissenschaftlichen Studien kann die Methode zur Identifizierung und gleichzeitigen Genotypisierung einer Maus entscheidend sein. Bei der Verwendung eines Mausmodells gibt es mehrere häufig verwendete Methoden, die entwickelt wurden, um Tiere gleichzeitig zu genotypisieren und zu identifizieren (z. B. Ohrstanzung, Ohrmarkierung), und andere Methoden, die nur Tiere identifizieren (z. B. Tätowierung, subkutane Transponderimplantation, Marker- oder Farbstoffapplikation) oder nur Tiere genotypisieren (z. B. Schwanzbiopsie)^1,2. Die meisten dieser Techniken sollen zum Zeitpunkt der Entwöhnung durchgeführt werden. Es gibt weniger Techniken zur gleichzeitigen Identifizierung und Genotypisierung bei jüngeren Tieren vor dem Absetzen 1,2,3,4.

Um die Arbeit zu unterstützen, die die Identifizierung und Genotypisierung von Mäusen in jüngeren Jahren erfordert, wurde eine Studie durchgeführt, um PEB als zuverlässige Identifizierungs- und Genotypisierungsmethode für PND 7-Jungtiere zu validieren und mit der Verwendung von PEB bei Mäusen zu vergleichen, die bei PND 21⁵ entwöhnt wurden. Wie in dieser Studie detailliert beschrieben, wurden horizontale und vertikale Ohrmuschelscheiben ausgewählt, da eine frühere Studie mit PND 7-Jungtierkörpern ergab, dass die mit PEB erstellten Ohrmuschelmuster klar und schnell waren, eine Vielzahl von Musterkombinationen boten, identifizierbar waren und das Gewebe leicht zu entfernen war⁵. Andere Methoden, wie z. B. Ohrstanzen und Ohrkerben, wurden ebenfalls untersucht, aber es gab nicht genügend Oberfläche auf PND 7 Welpen, um vollständige kreisförmige Stanzen oder Kerben zu erzeugen. Diese Vorarbeiten führten dazu, dass die referenzierte Studie diese Muster an lebenden PND 7-Mäusen testete⁵. Diese Studie zeigte, dass die Gewebegröße, die aus der Biopsie der Ohrmuschel gewonnen wurde, für eine erfolgreiche Genotypisierung verwendet werden kann. Die PEB-Muster waren auch als Mäuse im Alter von PND 63 intakt, unabhängig davon, wann die Ohrmuschel bei PND 7 oder PND 21⁵ biopsiert wurde.

Das Ziel bei der Entwicklung dieser Technik ist es, eine gleichzeitige Identifizierungs- und Genotypisierungsmethode für Tiere im Alter von PND 7 bis 14 Jahren bereitzustellen, für die nach aktuellem Literaturstand keine Methode zur Verfügung steht. Der aktuelle Artikel, begleitet von dem geführten Video, zeigt, wie eine Ohrbiopsie am Ohr einer 7 Tage alten Maus durchgeführt wird, um gleichzeitig eine ausreichende Menge an Gewebe für die PCR-Genotypisierung zu identifizieren und zu gewinnen. Es gibt acht verschiedene Biopsiekombinationen und eine ohne Biopsie für insgesamt neun Ohrmuschelmuster, die zur Identifizierung einzelner Mäuse verwendet werden können. Tipps zur Durchführung von Ohrmuschel-Biopsien werden weiter diskutiert, um den Erfolg bei der eindeutigen Identifizierung der verschiedenen Ohrmuschelmuster bei PND 7-Welpen zu maximieren.

Protokoll

Alle im Protokoll beschriebenen Verfahren wurden in Übereinstimmung mit dem NIH-Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren⁶ durchgeführt und vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) des Massachusetts General Hospital (MGH) genehmigt. Die unten beschriebene Identifizierungsmethode wurde an C57BL/6NCrl-Mäusen beider Geschlechter getestet⁵. Diese Methode wurde bei anderen Stämmen, Stammtieren oder Transgenen nicht angewendet. Die Identifizierung der Pinna-Biopsie ist möglicherweise nicht für Mäuse geeignet, die eine erhöhte Heilungskapazität aufweisen (z. B. MRL-Mausstamm)⁷.

1. Zurückhaltung von Mäusewelpen

1. Stellen Sie sicher, dass die Maus PND 7 oder älter ist. Wenn die Maus jünger als PND 7 ist, ist diese PEB-Methode möglicherweise nicht durchführbar.
2. Halten Sie die Maus vorsichtig so fest, dass sie sichtbar ist und Zugang zu den Ohren hat. Nehmen Sie den Welpen mit der nicht dominanten Hand des Benutzers an der Basis des Schwanzes auf und setzen Sie ihn auf eine stabile Oberfläche.
3. Üben Sie mit dem Daumen und Zeigefinger der dominanten Hand sanften Druck auf den Rücken des Welpen aus, bis die lose Haut zwischen den Ohren eingeklemmt werden kann. Kneifen Sie die Haut fest genug zusammen, damit sich der Kopf nicht frei bewegen kann, aber stellen Sie sicher, dass das Tier normal atmet (Abbildung 1).
4. Wenn das Tier mit der linken Hand fixiert wird, stellen Sie sicher, dass sich der Welpe in einer Position befindet, die die rechte Ohrmuschel zugänglich macht (d. h. die Nase des Welpen zeigt vom Körper des Handers weg). Um an die linke Ohrmuschel zu gelangen, supinieren Sie den Handgriff, so dass die linke Seite des Tieres dem Führer zugewandt ist.
5. Wenn das Tier mit der rechten Hand fixiert wird, stellen Sie sicher, dass sich der Welpe in einer Position befindet, die die linke Ohrmuschel leicht zugänglich macht (d. h. die Nase des Welpen zeigt vom Körper des Hundeführers weg). Um an die rechte Ohrmuschel zu gelangen, supinieren Sie die Hand, die das Tier greift, so, dass die rechte Seite des Tieres dem Führer zugewandt ist.

2. Auswahl des Ohrmuschel-Biopsiemusters

1. Verwenden Sie insgesamt neun Muster mit acht PEB-Mustern und einem No-Biopsie-Muster (Abbildung 2). Wählen Sie ein PEB-Muster aus und zeichnen Sie es auf.

3. Biopsie an der Ohrmuschelkante

1. Verwenden Sie für jede Biopsie saubere Instrumente. Empfohlen wird eine kleine Sezierschere oder eine McPherson-Vannas-Schere (siehe Materialtabelle). Sprühen Sie die Instrumente mit Desinfektionsmitteln ein und wischen Sie sie nach jedem Gebrauch mit 70%igem Isopropylalkohol ab.
2. Halten Sie die Schere mit der dominanten Hand.
3. Um eine vertikale PEB zu erzeugen, schneiden Sie den lateralen Rand der Ohrmuschel in vertikaler Richtung ab, so dass etwa 1/^{4 bis 1} /^{3 der gesamten} Ohrmuscheln (d. h. etwa 0,8 mm x 3 mm Gewebe) von der Seite des Ohrs entfernt wird (Abbildung 3G).
4. Um einen horizontalen PEB zu erstellen, schneiden Sie den dorsalen Rand der Ohrmuschel so ab, dass etwa 1/^{4 bis 1} /^{3 der gesamten} Ohrmuschel (d. h. etwa 0,8 mm x 3 mm Gewebe) entfernt wird (Abbildung 3H). Führen Sie den Schnitt in einem Winkel von 45° statt einer geraden Linie aus (Abbildung 4). Der Winkel berücksichtigt die Entwicklung und das Wachstum der Ohren im Laufe der Zeit und stellt sicher, dass das Muster horizontal bleibt.
   1. Die acht Ohrmuschelmuster sind eine Kombination aus dem vertikalen PEB und dem horizontalen PEB auf der linken, rechten oder beiden Ohrmuscheln. Führen Sie die folgenden acht Ohrmuschel-Biopsiemuster durch: links vertikal (LV), rechts vertikal (RV), links horizontal (LH), rechts horizontal (RH), links vertikal und rechts horizontal (LVRH), links und rechts vertikal (LVRV), links und rechts horizontal (LHRH) und links horizontal und rechts vertikal (LHRV).
5. Verwenden Sie eine feine Pinzette, um das herausgeschnittene Ohrmuschelgewebe vorsichtig in ein Probengefäß zu legen, das für die Genotypisierung verwendet wird.
   1. Wenn sich in dem unwahrscheinlichen Fall, dass sich Blut aus der Ohrmuschel-Biopsiestelle ansammelt, mit der dominanten Hand und während das Tier noch fixiert ist, verwenden Sie ein Stück saubere Gaze oder einen Wattestäbchenapplikator, um Druck auf die Blutungsstelle auszuüben, bis die Blutung aufhört.
6. Setzen Sie den Welpen vorsichtig wieder in den Käfig mit der Hündin ein. Beobachten Sie die Welpen 1-2 Minuten lang, nachdem Sie sie wieder in den Käfig gesetzt haben, um zu beurteilen, ob es zu weiteren Blutungen an der PEB-Stelle kommt.

Ergebnisse

Abbildung 1 zeigt eine manuelle Methode, bei der PND 7-Mäuse sanft zurückgehalten werden, so dass ihre Ohren für die Manipulation sichtbar sind. Die Fessel greift mit Daumen und Zeigefinger die überschüssige Haut des Genicks. Die Menge der erfassten Haut hängt vom Alter des Tieres ab, wobei bei kleineren Tieren weniger Gewebe zur Verfügung steht.

Die in Abbildung 2 aufgeführten PEB-Muster wurd...

Diskussion

Bedeutung im Hinblick auf bestehende Methoden
In früheren Artikeln wurde darauf hingewiesen, dass bei Tieren mit PND 14 und jünger die Ohrmuschel aufgrund der geringen Größe ^2,3 möglicherweise nicht für die Manipulation geeignet ist. Während bestehende Ohridentifikationssysteme wie Ohrlochbiopsien, Ohrkerben oder Ohrmarken sowohl die Identifizierung als auch die Genotypisierung durchführen können, k?...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dissection scissors	Kent Scientific	INS600393-G	10 cm long
McPherson-Vannas Scissors	Kent Scientific	INS600124	8 cm long