Идентификация 7-дневных мышей до отъема с помощью биопсии Pinna Edge

Резюме

Протокол представляет собой новый поэтапный подход к проведению биопсии по краю ушной раковины (ПЭБ) у 7 мышей в постнатальный день (ПНД) с целью идентификации и одновременного генотипирования.

Аннотация

Идентификация и генотипирование мышей часто является неотъемлемой частью многих научных исследований in vivo . Было описано несколько методов идентификации и генотипирования у отлученных от груди мышей; Тем не менее, на сегодняшний день существует гораздо меньше методов, описанных для мышей до отлучения от груди. Pinna Edge Biopsy (PEB) – метод идентификации с последующим использованием ткани для генотипирования. В этой статье описывается и приводится видеоинструкция по поэтапному подходу к ПЭБ на 7-м день после рождения (ПНД) мышей. Описаны восемь различных схем расположения и техники биопсии ушной раковины, которые, как было показано, сохраняются во взрослом возрасте для идентификации. В этой статье также обсуждаются способы оптимизации PEB и показано благотворное влияние этого метода на рост и развитие детенышей, при этом все мыши демонстрируют соответствующий прирост веса без какой-либо заболеваемости или смертности на протяжении всего исследования. Этот метод предоставит исследователям метод идентификации мышей в возрасте, когда существует мало доступных методов идентификации и генотипирования.

Введение

В некоторых научных исследованиях метод идентификации и одновременного генотипирования мыши может иметь решающее значение. При использовании мышиной модели существует несколько часто используемых методов, которые были разработаны для одновременной генотипизации и идентификации животных (например, пробивание ушей, бирка ушей), и другие методы, которые идентифицируют только животных (например, татуировка, подкожная имплантация транспондера, нанесение маркеров или красителей) или только генотип животных (например, биопсия хвоста)^1,2. Большинство из этих методов предназначены для выполнения во время отлучения от груди. Методы одновременной идентификации и генотипирования у более молодых животных, не отлученных от груди, меньше 1,2,3,4.

Чтобы помочь работе, требующей идентификации и генотипирования мышей в более молодом возрасте, было проведено исследование для валидации PEB в качестве надежного метода идентификации и генотипирования для щенков PND 7 и сравнения его с использованием PEB у мышей, отлученных от груди в PND 21⁵. Как подробно описано в этом исследовании, горизонтальные и вертикальные срезы ушной раковины были выбраны, потому что предыдущее исследование с использованием туш детенышей PND 7 показало, что узоры на ушных раковинах, созданные с помощью PEB, были четкими, быстрыми, обеспечивали разнообразие комбинаций узоров, идентифицируемыми, а ткань^{легко удалялась}. Другие методы, такие как ушные пробивки и ушные насечки, также были изучены, но на щенках PND 7 не было достаточно площади поверхности для создания полных круглых пробойников или выемок. Эта предварительная работа привела к тому, что упомянутое исследование проверило эти закономерности на живых мышах PND^{7 5}. Это исследование показало, что размер ткани, полученный в результате биопсии ушной раковины, может быть использован для успешного генотипирования. Паттерны PEB также были неповреждены у мышей в возрасте до PND 63, независимо от того, когда была проведена биопсия ушной раковины при PND 7 или PND 21⁵.

Целью разработки данной методики является обеспечение метода одновременной идентификации и генотипирования животных в возрасте от 7 до 14 лет, которые, согласно современной литературе, не имеют доступного метода. В данной статье, сопровождаемой обучающим видео, показано, как выполнить биопсию уха на краю ушной раковины 7-дневного уха мыши для одновременной идентификации и извлечения достаточного количества ткани для генотипирования ПЦР. Существует восемь различных комбинаций биопсии и одна без биопсии, в общей сложности девять паттернов ушных раковин, доступных для использования для идентификации отдельных мышей. Далее обсуждаются советы по проведению биопсии ушной раковины для достижения максимального успеха в четкой идентификации различных паттернов ушной раковины у щенков PND 7.

протокол

Все процедуры, изложенные в протоколе, были выполнены в соответствии с Руководством NIH по уходу и использованию лабораторных животных⁶ и одобрены Комитетом по институциональному уходу за животными и их использованию (IACUC) Массачусетской больницы общего профиля (MGH). Описанный ниже метод идентификации был протестирован на мышах C57BL/6NCrl обоего пола⁵. Этот метод не использовался в других штаммах, акциях или трансгенных препаратах. Идентификация биопсии ушной раковины может не подходить для мышей с повышенной способностью к заживлению (например, мышиной линии MRL)⁷.

1. Удерживающее устройство для щенка мыши

1. Убедитесь, что у мыши установлена версия PND 7 или более ранняя. Если мышь младше PND 7, этот метод PEB может оказаться нецелесообразным.
2. Аккуратно удерживайте мышь таким образом, чтобы обеспечить визуализацию и доступ к ушам. Возьмите щенка за основание хвоста недоминирующей рукой пользователя и перенесите его на устойчивую поверхность.
3. Слегка надавливайте на спину щенка большим и указательным пальцами доминирующей руки, пока не удастся зажать дряблую кожу между ушами. Сожмите кожу достаточно сильно, чтобы голова не двигалась свободно, но убедитесь, что животное нормально дышит (рисунок 1).
4. Если животное удерживается левой рукой, убедитесь, что щенок находится в положении, обеспечивающем доступ к ушной раковине правого уха (т. е. нос щенка обращен в сторону от тела руковода). Чтобы получить доступ к ушной раковине левого уха, супинируйте руку хваткой так, чтобы левая сторона животного была обращена к проводнику.
5. Если животное удерживается правой рукой, убедитесь, что щенок находится в положении, обеспечивающем легкий доступ к ушной раковине левого уха (т. е. нос щенка обращен в сторону от тела проводника). Чтобы получить доступ к ушной раковине правого уха, поверните руку, захватывающую животное, так, чтобы правая сторона животного была обращена к проводнику.

2. Подбор схемы биопсии ушной раковины

1. Используйте в общей сложности девять шаблонов с восемью шаблонами PEB и один шаблон без биопсии (рисунок 2). Выберите и запишите шаблон PEB.

3. Биопсия края ушной раковины

1. Используйте чистые инструменты для каждой биопсии. Рекомендуется использовать небольшие ножницы для препарирования или ножницы McPherson-Vannas (см. Таблицу материалов). Опрыскайте инструменты дезинфицирующими средствами и протирайте 70% изопропиловым спиртом после каждого использования.
2. Держите ножницы доминирующей рукой.
3. Чтобы создать вертикальный PEB, обрежьте боковой край ушной раковины в вертикальном направлении так, чтобы примерно от 1/^{4 до 1}/3 от общего количества ушных раковин (т.е. около 0,8 мм x 3 мм ткани) было удалено со стороны уха (рис. 3G).
4. Чтобы создать горизонтальный PEB, обрежьте тыльный край ушной раковины так, чтобы^{удалить примерно от} 1/4 до 1/3 от общего объема ушной раковины (т.е. около 0,8 мм x 3 мм ткани) (рисунок 3H). Сделайте разрез под углом 45°, а не по прямой линии (Рисунок 4). Угол учитывает развитие и рост ушей с течением времени и гарантирует, что рисунок остается горизонтальным по своей природе.
   1. Восемь узоров в ушных раковинах представляют собой комбинацию вертикального и горизонтального перьев на левой, правой или обеих ушных раковинах. Сделайте следующие восемь схем биопсии ушной раковины: левая вертикальная (LV), правая вертикальная (RV), левая горизонтальная (LH), правая горизонтальная (RH), левая вертикальная и правая горизонтальные (LVRH), левая и правая вертикальные (LVRV), левая и правая горизонтальные (LHRH), левая горизонтальная и правая вертикальные (LHRV).
5. С помощью тонких щипцов аккуратно поместите иссеченную ткань ушной раковины в контейнер для образца, который будет использоваться для генотипирования.
   1. Если в маловероятном случае кровь скапливается из места биопсии ушной раковины, доминирующей рукой и пока животное еще удерживается, используйте кусок чистой марли или аппликатор с ватным наконечником, чтобы надавить на место кровотечения до тех пор, пока кровотечение не остановится.
6. Аккуратно поместите щенка обратно в клетку с матерью. Наблюдайте за щенками в течение 1-2 минут после помещения обратно в клетку, чтобы оценить наличие дальнейших кровотечений из места PEB.

Результаты

На рисунке 1 показан ручной метод мягкого удержания мышей PND 7 так, чтобы их уши были видны для манипуляций. Ограничитель использует большой и указательный пальцы для захвата излишков кожи загривка. Количество захватываемой кожи зависит от возраста жив...

Обсуждение

Значимость по отношению к существующим методам
В предыдущих статьях указывалось, что для животных ПНД 14 и младше их ушная раковина может быть не пригодна для манипуляций из-за небольшого размера ^2,3. В то время как существующи...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dissection scissors	Kent Scientific	INS600393-G	10 cm long
McPherson-Vannas Scissors	Kent Scientific	INS600124	8 cm long