تطوير نموذج الفئران للاضطراب ثنائي القطب

Summary

تقدم هذه المقالة بروتوكولا لتحريض نموذج فريد من نوعه للفئران للاضطراب ثنائي القطب يلتقط كلا من السلوك الشبيه بالهوس والاكتئاب.

Abstract

الاضطراب ثنائي القطب هو حالة صحية عقلية تتميز بتقلبات مزاجية شديدة ، بما في ذلك فترات الارتفاعات العاطفية (الهوس) والانخفاضات (الاكتئاب). في حين أن علم الأعصاب الأساسي بالضبط لم يتم فهمه تماما بعد ، يبدو أن الاختلالات في أنظمة الناقلات العصبية ، وخاصة الدوبامين ، تلعب دورا مركزيا. لهذا السبب ، تم استخدام التلاعب بمسارات الدوبامين لنمذجة الهوس أو الاكتئاب في القوارض. ومع ذلك ، فإن النماذج التي تمثل بدقة التبديل النموذجي بين هاتين الحلقتين نادرة ، مما يحد من صلاحية الوجه. في نموذج فريد من نوعه ، يتم استخدام التقنيات الحديثة لزيادة تعبير مستقبلات الدوبامين D1 مؤقتا ، والذي كان متورطا في أمراض الاضطراب ثنائي القطب. يتم حقن بنية الفيروس العدسي المحفز بالتتراسيكلين التي تعبر عن مستقبلات الدوبامين D1 تحت سيطرة محفز كالمودولين كيناز II ألفا بشكل تجسيمي في قشرة الفص الجبهي الإنسي للفئران البالغة. يتم تحقيق الإفراط في التعبير عن مستقبلات الدوبامين D1 عن طريق إضافة التتراسيكلين التناظري دوكسيسيكلين إلى مياه الشرب للحيوانات ، مما يؤدي إلى زيادة السلوكيات المرتبطة بالمكافأة والاندفاع والمخاطرة وانخفاض القلق. تشبه هذه السلوكيات نمطا ظاهريا يشبه الهوس. عن طريق إزالة الدوكسيسيكلين من مياه الشرب ، يمكن إحداث نمط ظاهري يشبه الاكتئاب ، يتميز بزيادة العجز وانعدام التلذذ ، داخل نفس. توفر هذه المقالة بروتوكولا خطوة بخطوة لإجراء الجراحة ، بالإضافة إلى إجراءات إحداث النمط الظاهري الشبيه بالاضطراب ثنائي القطب. بالإضافة إلى ذلك ، يتم وصف اعتبارات تقييم التغيرات السلوكية المرتبطة بالسلوك الشبيه بالهوس والاكتئاب. يوفر هذا النموذج الواعد ، الذي يوضح البنية الجيدة وصلاحية الوجه ، أداة قيمة لمزيد من التحقيق في الآليات الفيزيولوجية المرضية للاضطراب ثنائي القطب.

Introduction

الاضطراب ثنائي القطب (BD) هو اضطراب مزاجي حاد يصيب حوالي 1٪ من سكان العالم¹. يتميز بنوبات من المزاج الشديد والاكتئاب والهوس ، جنبا إلى جنب مع حالات اليوثيم. تشبه أعراض نوبات الاكتئاب في مرض بدبي أعراض الاكتئاب أحادي القطب. يظهر المرضى اهتماما ومتعة أقل في الأنشطة ومشاعر الحزن واليأس وانعدام القيمة. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن ملاحظة التغيرات في الشهية وسلوك النوم وكذلك الإعاقات الإدراكية^{في كثير} من الأحيان 2. تتميز نوبات الهوس بمزاج مرتفع بشكل غير طبيعي ، وانخفاض الحاجة إلى النوم ، والتثبيط الاجتماعي ، وزيادة احترام الذات ، والشعور بالعظمة ، فضلا عن زيادة المخاطرة والتهيج².

يبدو أن مسببات مرض BD هي تفاعل معقد بين العوامل الوراثية والتنموية³ ، لكن الآليات الدقيقة التي ينطوي عليها الفيزيولوجيا المرضية لا تزال غير مفهومة تماما. يعتقد أن الأعراض تنشأ من اختلالات في أنظمة الناقل العصبي⁴ ، وعلى وجه الخصوص ، كانت الدراسات التي تركز على نظام الدوبامين^{مؤثرة 5}. على سبيل المثال ، افترض بيرك ^{وآخرون فرضية} الدوبامين ، على افتراض أن حالة فرط الدوبامين تكمن وراء الهوس ، بينما ينشأ الاكتئاب من نقص الدوبامين. منذ ذلك الحين ، جمعت الأدلة من النماذج الحيوانية ، بالإضافة إلى الدراسات الدوائية والتصويرية ، دعما قويا للارتباط بين أعراض الهوس وفرط الدوبامين. أيضا ، يمكن العثور على صلة بين انخفاض إشارات دوبامين ونوبات الاكتئاب ، وإن كان بدرجة أقل⁷. بالإضافة إلى ذلك ، عززت نتائج التحقيقات الجينية فكرة فرضية الدوبامين ل^{BD 8}.

لإلقاء المزيد من الضوء على دور نظام الدوبامين في BD ، يمكن استخدام النماذج الحيوانية للتحقيق في الآليات العصبية الحيوية التي تكمن وراء الأعراض. غالبا ما يتم تقييم تطبيقات وقيود نماذج المرض بناء على ثلاثة معايير للتحقق ، اقترحها في الأصل ويلنر⁹. وتشمل هذه الصلاحية للوجه والبناء والتنبؤ. تصف صلاحية الوجه قدرة النموذج على تقليد الخصائص السلوكية للاضطراب. يتم الوصول إلى صلاحية البناء عندما تكون الفيزيولوجيا المرضية ومسببات الاضطراب هي أساس النموذج ، بينما تشير الصلاحية التنبؤية إلى أنه يمكن إعادة إنتاج العلاج الدوائي للاضطراب داخل النموذج.

حتى الآن ، ساهمت نماذج القوارض المختلفة في فهم¹⁰ دينار بحريني وتشمل مجموعة واسعة من التعديلات الجينية والتدخلات الصيدلانية بالإضافة إلى التلاعب البيئي¹¹.

على سبيل المثال ، ثبت أن التلاعب التجريبي بجين الساعة يحفز نمطا ظاهريا شبيها بالهوس في الفئران. يلعب عامل النسخ CLOCK دورا مهما في تنظيم إيقاعات الساعة البيولوجية ، وتتميز الفئران المعدلة وراثيا ، التي تعبر عن بروتين لا يمكنه تنشيط نسخ الساعة ، بفرط النشاط وزيادة استجابات^{المكافأة 12}. يبدو أن النمط الظاهري الناتج يتم بوساطته بواسطة الجينات المنظمة تفاضليا لإشارات الدوبامين في المنطقة السقيفية البطنية للدماغ¹³.

لقد ثبت أن التأثير المباشر على إشارات الدوبامين عن طريق إعطاء الأدوية التي تزيد من الدوبامين ، مثل الأمفيتامين المنشط النفسي ، يحفز فرط الحركة ، وقد تم ربط الانسحاب اللاحق بأعراض شبيهة بالاكتئاب ، بما في ذلك انعدام^{التلذذ 14}. كما ثبت أن التحديات الدوائية مع الكيتامين أو ناهض مستقبلات الدوبامين D2 / D3 كوينبيرول تحفز السلوك ذي الصلة ب^15،16 دينار بحريني.

بالإضافة إلى التدخل الدوائي ، يمكن استخدام التلاعب بالبيئة ، مثل الحرمان من النوم ، للحث على الأنماط الظاهرية السلوكية ذات الصلة^{ب 17} دينار بحريني. تظهر المحرومة من النوم نمطا ظاهريا يشبه الهوس يتميز بزيادة الحركة وانبعاث الأصوات فوق الصوتية المرتبطة بالتغيرات في إشارات الدوبامين¹⁸.

هناك العديد من نماذج القوارض الأخرى لدراسة سلوك الاكتئاب¹⁹ أو الهوس²⁰ . ومع ذلك ، في حين أن كل هذه النماذج قد ساهمت بقوة في فهم أمراض BD ، إلا أنها محدودة بدراسة حلقة واحدة فقط في كل مرة أو تأثيرات قصيرة المدى. في المقابل ، كان من الصعب تحقيق نمذجة التبديل المميز بين الحالات العاطفية.

هنا ، يتم تقديم بروتوكول لنموذج الفئران الفريد ل BD. إنه يوضح زيادة صلاحية الوجه عن طريق إحداث كلتا الحلقتين في واحد باستخدام معالجة واحدة مستهدفة لنظام الدوبامين ، أي الإفراط في التعبير المشروط عن مستقبل الدوبامين D1 (DRD1) في قشرة الفص الجبهي الإنسي (mPFC) من بنية فيروسات عدسية محفزة بالتتراسيكلين. من خلال قيادة النسخ الجيني تحت سيطرة محفز كالمودولين كيناز II ألفا (CamKIIa) ، يتم التعبير عن DRD1 بشكل أساسي في الخلايا العصبية الجلوتاميتية ، وبالتالي زيادة خصوصية التلاعب الجيني.

تم توفير العمود الفقري الأصلي للفيروس pRRL.cPPT.WPRE.Sin من قبل الدكتور ديدييه ترونو (Ecole Polytechnique Fédérale de Lausanne ، سويسرا)²¹ وتم تعديله عن طريق استبدال الجين الصغير GFP بموقع متعدد الروابط (ناقل الفيروس العدسي PL13). ثم تم استخدام PL13 لإنتاج PL13.pTRE2.DRD1.CamKIIa.rtTA3 أو PL13.pTRE2.dsRedExpress.CamKIIa.rtTA3. تم الحصول على (كدنا) للفئران DRD1 من الدكتور ديفيد سيبلي (NINDS / NIH) ²² ، والمنشط العكسي الذي يتم التحكم فيه بالتتراسيكلين 3 (rtTA3) (cDNA) من الدكتورين أتزي داس وبن بيرخوت (المركز الطبي الأكاديمي ، جامعة أمستردام) ²³. تم توفير الحمض النووي لمحفز CamKIIa من قبل الدكتور كارل ديسيروث (جامعة ستانفورد ، كاليفورنيا) ، وتم استنساخ تسلسل dsRedExpress وعنصر استجابة التتراسيكلين 2 (pTRE2) من البلازميدات الداخلية pcDNA3.1-dsRedExpress و pcDNA3.1-pTRE2 ، على التوالي. تم إنشاء النواقل الفيروسية عن طريق الاستنساخ الفرعي لتسلسلات الحمض النووي المضخم بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل المحاطة بمواقع التقييد.

أظهر النموذج الذي يستخدم هذا الناقل الفيروسي أن الإفراط في التعبير عن DRD1 في الخلايا العصبية الإيجابية ل mPFC CamKIIa يؤدي إلى نمط ظاهري يشبه الهوس^24،25 ، في حين أن التقليل اللاحق من تنظيم التعبير الجيني يؤدي إلى سلوك شبيه بالاكتئاب²⁶. نظرا لأن النمط الظاهري الشبيه بالمرض يمكن أن يتم إحداثه بشكل متكرر في^{واحد 27} ، فإن النموذج يعكس مستوى عال من صلاحية الوجه. بالإضافة إلى ذلك ، فإن التلاعب بنظام الدوبامين له صلاحية بناء قوية للنماذج الحيوانية ل^{BD 7} ، حيث ارتبطت التغييرات في مستويات DRD1^28،29 أو تعدد الأشكال DRD1 بأمراض BD^30،31،32.

أدت الدراسات الأخرى التي أجريت على أيضا إلى زيادة فهم وظائف DRD1 الفص الجبهي. على سبيل المثال ، كان الانخفاض في DRD1 اكتشافا ثابتا في نماذج الاكتئاب^33،34 ، في حين أن التحفيز البصري الوراثي ل DRD1 في الخلايا العصبية الغلوتاميتية mPFC يقلل من القلق ويسبب تأثيرات مضادة للاكتئاب³⁵. في منشور حديث من قبل Wu et ^al.36 ، تم إثبات دور mPFC DRD1 في انتقالات الحالة العاطفية. تسلط هذه الدراسة الضوء على أن هذه المستقبلات ضرورية للتغيرات الكامنة في مرونة المشبك المثير.

إجمالا ، فإن استخدام نموذج الفئران من BD الذي يتكون من التلاعب المستهدف والمشروط ب DRD1 في الخلايا العصبية الإيجابية ل CamKIIa في mPFC يشكل نظاما نموذجيا ذو بنية عالية وصلاحية للوجه ، وبالتالي ، يظهر إمكانات قوية للبحث الانتقالي حول BD.

في ما يلي ، يتم وصف الإجراءات الجراحية لتوليد النموذج. بالإضافة إلى ذلك ، سيتم تقديم الاعتبارات المنهجية لتحريض النموذج والتقييمات السلوكية جنبا إلى جنب مع النتائج التمثيلية للنمط الظاهري الشبيه بالأمراض الناتجة. تتم مناقشة العقبات المحتملة والعوامل المؤثرة في إنشاء النموذج والتقييم السلوكي ، ويتم إعطاء نظرة مستقبلية للاتجاهات المستقبلية.

Protocol

تمت الموافقة على بروتوكول الحقن التجسيمي الموصوف هنا من قبل LANUV (Landesamt für Natur, Umwelt und Verbraucherschutz, Northrhine-Westfalia, Germany). تم استخدام ذكور فئران Sprague Dawley البالغة (350-650 جم من وزن الجسم). الكواشف والمعدات المستخدمة في هذه الدراسة مدرجة في جدول المواد.

1. التركيبات الفيروسية العدسية

ملاحظة: يتم استخدام نظام الفيروسات العدسية من الجيل الثالث للتعبير الشرطي عن DRD1 أو البروتين الفلوري الأحمر (dsRed) كشرط تحكم^25،27.

1. إنتاج فيروس العدسات بناء على بروتوكول Stewart et ^al.37 مع بلازميدات التعبئة 8454 و 8455 من مستودع Addgene.
   ملاحظة: إذا لم يتم التخطيط لإنتاج الفيروس بشكل مستقل، فإن العديد من المرافق الأساسية توفر فيروس عدسي عالي العيار، مثل شاريتيه برلين بألمانيا.
2. يتركز عيار الفيروسات ويخزنها عند -80 درجة مئوية.
3. تحضير 2 × 10⁷ وحدات تحويل (TU) لكل ميكرولتر للحقن.
4. نقل الفيروسات إلى الجناح الجراحي على الثلج الجاف.

2.

ملاحظة: تم إنشاء نموذج الفئران ل BD في ذكور فئران Sprague Dawley البالغة (350-650 جم من وزن الجسم). للتحقيق في إناث الفئران أو النقاط الزمنية التنموية السابقة ، من الأهمية بمكان مراعاة أن التعبير عن DRD1 في mPFC يتغير أثناء التطور ويمكن أن يتأثر بدورة الشبق^38،39،40.

1. زوج الفئران المنزلية مع من نفس الحالة مع الطعام والماء المخصص في ظل ظروف درجة حرارة ورطوبة ثابتة (45٪ -65٪ رطوبة نسبية ، درجة حرارة 22 درجة مئوية ± 2 درجة مئوية).
2. احتفظ بالفئران تحت دورة معكوسة مدتها 12 ساعة من الضوء والظلام (تنطفئ الأضواء في الساعة 11 صباحا) ، حيث يجب إجراء التحقيق السلوكي أثناء المرحلة النشطة للحيوانات في الظلام.
3. امنح سبعة أيام على الأقل للتأقلم مع المنشأة والتعامل معها من قبل المجربين قبل بدء أي تجارب.

3. الحقن التجسيمي للبنية الفيروسية

ملاحظة: قم بإجراء الجراحة تحت غطاء أمان (احتياطات للعمل مع فيروس العدس) والظروف المعقمة.

1. اعداد
   1. تأكد من توفر جميع المواد اللازمة وعمليتها (جدول المواد).
   2. قم بإعداد الإطار التجسيمي مع حامل الحقنة المتصل بالذراع التجسيمي. قم بتوصيل حامل الحقنة بمضخة الحقنة.
   3. قم بإعداد مثقاب الأسنان وقم بتركيب لدغ 0.9 مم.
   4. ضع وسادة التسخين واضبطها على 37 درجة مئوية. ارفع وسادة التدفئة إلى ارتفاع مناسب لتسهيل وضع الفئران.
   5. قم بتغطية وسادة التسخين بستنى ماص.
   6. تحضير أدوات جراحية معقمة على سطح معقم.
   7. قم بتركيب حقنة حقن تجسيمية سعة 10 ميكرولتر بإبرة حقن 33 جم على حامل المحقنة.
   8. اسحب 2.3 ميكرولتر من المعلق الفيروسي للحقن الثنائي بسعة 1 ميكرولتر لكل منهما. قم بتأكيد السحب الناجح بصريا. تأكد من تنفيذ هذه الخطوة كخطوة تحضيرية أخيرة لتقليل الوقت الذي يستغرقه الفيروس في درجة حرارة الغرفة.
2. التسكين وتحريض التخدير
   1. في صباح يوم الجراحة ، قم بإعطاء ميلوكسيكام (1 مجم / كجم من وزن الجسم ، ص.o.).
   2. قبل عشرين دقيقة من بدء الإجراءات الجراحية للتسكين ، قم بحقن الجرذ بالبوبرينورفين (0.5 مجم / كجم من وزن الجسم ، SC).
   3. قم بتشغيل جهاز التخدير بتدفق أكسجين 0.8-1 لتر / دقيقة.
   4. غمر غرفة الحث ب 4٪ Isoflurane وضع الجرذ في غرفة الحث.
   5. بعد التحريض الناجح للتخدير ، الذي يمكن رؤيته عن طريق تباطؤ التنفس وفقدان الوعي ، قم بإزالة الجرذ من غرفة الحث وانقله إلى الإطار التجسيمي.
3. تحديد موضع الجرذ
   1. تأكد من تحويل تدفق التخدير إلى قناع الأنف.
   2. انقل الجرذ من غرفة الحث إلى الإطار التجسيمي ، ووضع أسنانه الأمامية في الحامل.
   3. ضع قناع التخدير بشكل صحيح على الأنف وقم بتحويل الأيزوفلوران إلى 1.5-2.3٪ للصيانة.
   4. احمي العينين باستخدام كريم العين المعقم.
   5. قبل إجراء أي شق لمدة 10 دقائق على الأقل ، يتم حقن الجرذ محليا بالليدوكائين (10 مجم / كجم من وزن الجسم ، SC) مباشرة أسفل موقع الشق المخطط له.
   6. قم بتأمين الجرذ في الإطار التجسيمي باستخدام قضبان الأذن. تأكد من أن قضبان الأذن متساوية وفي وضع رأس مستو.
   7. تقليم الفراء حول موقع الشق باستخدام المقص. قم بإزالة قطع الفراء باستخدام وسادة السليلوز المبللة بمطهر للجلد.
   8. تطهير المجال الجراحي باستخدام مطهر للجلد.
4. حج القحف وحقن البناء الفيروسي
   1. تأكد من التخدير المناسب عن طريق التحقق من عدم وجود منعكس إصبع القدم.
   2. قم بتطهير اليدين وانتقل إلى القفازات المعقمة قبل لمس أي معدات.
   3. قم بعمل شق وسطي صغير (~ 1.5 سم) باستخدام شفرة مشرط.
   4. الوصول الآمن إلى المجال الجراحي عن طريق دفع الجلد إلى الجانبين باستخدام مشابك البلدغ.
   5. نظف المجال الجراحي من الدم والأنسجة المتبقية باستخدام مقايضات معقمة. تأكد من الرؤية المناسبة للبريغما والمساحة الأمامية الكافية.
   6. اضبط إحداثيات A / P و M / L على الصفر بناء على bregma.
   7. حرك الذراع التجسيمية لإحداثيات A / P + 2.7 و M / L ± 0.4 وتصورها باستخدام قلم رصاص مطهر.
   8. حفر حفرة بقطر ~ 1 مم ، تغطي جوانب الحقن لنصفي الكرة الأرضية.
   9. قم بإزالة أي دم باستخدام مقايضة معقمة.
   10. اضبط إحداثيات D / V على الصفر على سطح الدماغ وخفض إبرة الحقن ببطء إلى -2.8 للحقن في منطقة ما قبل الحوفي من mPFC.
   11. انتظر لمدة 5 دقائق للسماح باسترخاء الأنسجة.
   12. حقن 1 ميكرولتر من المعلق الفيروسي بمعدل 0.1 ميكرولتر / دقيقة.
   13. اترك 5 دقائق للامتصاص قبل إزالة الإبرة ببطء.
   14. كرر الحقن في نصف الكرة الآخر.
5. الإغلاق ورعاية ما بعد الجراحة
   1. قم بإزالة الإبرة وأغلق الفتحة في الجمجمة باستخدام شمع العظام.
   2. قم بإزالة مشابك البلدغ وخياطة الجلد (خياطة جراحية 3-0).
   3. حقن الجرذ مع ميلوكسيكام (1 ملغم/كغ, s.c.) تسكين بعد الجراحة.
   4. قم بإيقاف تشغيل التخدير ، وإزالة من الإطار التجسيمي ، ووضعه في قفص منزله. تأكد من أن الجرذ يستيقظ تماما.
   5. اشطف المحقنة بالإيثانول بنسبة 100٪ لتعطيل فيروس العدسات المتبقي ، متبوعا ب H₂O المقطر استعدادا للحقنة التالية.
   6. إجراء تسكين ما بعد الجراحة مع ميلوكسيكام (1 مجم / كغم ، ص) كل 24 ساعة على مدار 3 أيام وتسجيل الحالة الصحية للحيوانات لمدة أسبوع واحد.
   7. المنزل الفردي لأول 24 ساعة بعد الجراحة لمنع الآخرين من العبث بالغرز. ضعهم مرة أخرى مع زملائهم في القفص بعد ذلك.

4. علاج الدوكسيسيكلين لتحريض النموذج

ملاحظة: ابدأ تحريض النموذج بمجرد 24 ساعة بعد الحقن. يمكن للمرء أيضا الانتظار فترات زمنية أطول بين الحقن والتحريض تصل إلى عدة أشهر ، على سبيل المثال ، لاختبار مجموعات أكبر من في نفس الوقت. لقد ثبت أن هذا لا يؤثر على وظيفة البنية الفيروسية.

1. تحريض نوبة تشبه الهوس
   1. للحث على نمط ظاهري يشبه الهوس ، أعط 0.5 جم / لتر من الدوكسيسيكلين عن طريق إضافته إلى مياه الشرب. يؤدي هذا إلى النسخ الفيروسي والإفراط في التعبير عن DRD1 الإضافي.
   2. قم بإعداد الماء المحتوي على الدوكسيسيكلين طازجا كل 48 ساعة إلى 72 ساعة ، وهي فترة زمنية لا يتأثر فيها استقرار الدوكسيسيكلين ، حتى في زجاجات المياه غير المعتمة⁴¹.
      ملاحظة: بعد العلاج بالدوكسيسيكلين لمدة سبعة أيام ، سيصل الإفراط في التعبير بوساطة الفيروس إلى الحد الأقصى ، ويمكن للمرء إجراء تحقيق سلوكي أثناء النوبة الشبيهة بالهوس.
2. تحريض نوبة شبيهة بالاكتئاب
   1. أعد إلى مياه الشرب العادية ، للحث على نوبة تشبه الاكتئاب.
   2. انتظر لمدة 4 أيام حتى يتوقف النسخ الفيروسي ، ثم قم بإجراء تقييم سلوكي للنوبة الشبيهة بالاكتئاب.
   3. قم بإجراء تحريض النوبات اللاحقة باتباع نفس النمط.

5. التقييم السلوكي

ملاحظة: بعد تحريض النموذج ، يمكن للمرء تقييم السلوك الشبيه بالقطب ثنائي القطب. تم اقتراح أطر مختلفة للترجمة من الأعراض السريرية إلى الأنماط السلوكية التي يمكن ملاحظتها في القوارض. أحد أكثرها تأثيرا هو معايير مجال^{البحث 42} ، حيث يتم فحص التغييرات في مجالات الأداء والسلوك ، التي قد تتأثر بالاضطرابات النفسية. ومع ذلك ، من المهم ملاحظة أنه بسبب حاجز الأنواع ، لا يمكن التحقيق في بعض الأعراض ، على سبيل المثال ، الانتحار ، في القوارض⁴³. نظرا لقدراتها المعرفية والعاطفية المتقدمة ، تتمتع نماذج الفئران بإمكانيات قوية بشكل خاص لتقييم الأعراض الانتقالية⁴⁴ ، مما يسمح بإجراءات اختبار أكثر تفصيلا. اعتبارات التقييم السلوكي موصوفة في الجدول 1.

1. خطط للتحقيق السلوكي كمجموعة من الاختبارات السلوكية⁴⁵ ، لتقديم صورة شاملة للنمط الظاهري الناتج.
2. انتبه لإجراء المزيد من الاختبارات الغازية أخيرا.
3. ضع في اعتبارك التغييرات في السلوك التي يحتمل أن تكون ناتجة عن تجربة اختبار سابقة عند محاولة اختبار واحد في كلتا النوبات الشبيهة بالمرض.
   ملاحظة: اعتمادا على السؤال المطروح ، قد يكون من المفيد اختبار مجموعات مختلفة من الفئران إما أثناء الهوس أو النوبة الشبيهة بالاكتئاب ، مما يسمح أيضا بجمع الأنسجة أثناء الحلقة المعنية. أظهرت التجربة أن اختبار الساذجة سلوكيا يمكن أن يؤدي إلى نمط ظاهري أكثر بروزا في بعض الاختبارات السلوكية.
4. أيضا ، ضع في اعتبارك عوامل أخرى مثل ظروف السكن⁴⁶ أو جنس المجرب⁴⁷.
5. اعتماد جميع التدابير الممكنة لتقليل الإجهاد غير المقصود للحيوانات ، ليس فقط من أجل رعاية ، ولكن أيضا لاستبعاد التفاعلات المحتملة للأنماط الظاهرية النفسية مع الإجهاد⁴⁸.
6. انتبه بشكل خاص لإيقاع الساعة البيولوجية ، حيث أن اضطرابات إيقاع الساعة البيولوجية هي أحد أعراض¹⁷ دينار بحريني. نظرا لأن الفئران تكون أكثر نشاطا أثناء الغسق والفجر ، يجب على المرء أن يختبر تحت الضوء الأحمر الخافت مع الموجودة تحت دورة عكسية للضوء والظلام⁴⁹.
   ملاحظة: تم جمع معظم النتائج التمثيلية المعروضة هنا وفقا لهذا النهج. ومع ذلك ، لا يزال من الممكن ملاحظة النمط الظاهري الشبيه بالمرض إذا تم إجراء التقييم السلوكي دون تبديل دورة النهار والليل للحيوانات²⁷.
7. قم دائما بالتسجيل المسبق للتجربة والسلوك ووصف إرشادات PREPARE⁵⁰ و ARRIVE⁵¹ التالية.

النتائج

عند إضافة الدوكسيسيكلين إلى مياه الشرب للحيوانات ، سيتم التعبير عن DRD1 إضافي ، وبعد 7 أيام ، سيكون هناك تعبير مفرط كاف لاختبار بحثا عن سلوك يشبه الهوس. حتى الآن ، تم إثبات زيادة في السلوكيات المتعلقة بالمكافأة. تشرب الشبيهة بالهوس المزيد من محلول السكروز فيما يتعلق بالماء في اختبار اختيار زجاجتين عند مقارنتها بعناصر التحكم²⁵. عند وضعها في صندوق مراقبة مع أنثى متقبلة ومراقبتها لمدة 25 دقيقة ، تظهر الشبيهة بالهوس المزيد من الحوامل الجنسية مقارنة بعناصر التحكم²⁷ (الشكل 1 أ). في نموذج الإدارة الذاتية للكوكايين ، يتناولون المزيد من الكوكايين بموجب جدول زمني ثابت ويظهرون نقطة توقف أعلى في جدول النسبة التدريجية. يتحول منحنى الاستجابة للجرعة نحو حساسية أعلى للجرعات المنخفضة²⁵. لوحظ هذا التحول في الحساسية أيضا في زيادة البروز التحفيزي في العديد من نماذج تكييف الأماكن. أمضت الشبيهة بالهوس وقتا أطول في الجوانب المكيفة للنيكوتين والكحول والكوكايين مقارنة بأدوات التحكم²⁵. كما تم العثور على زيادة البحث عن الجدة وخيارات أكثر اندفاعا في اختبار قائم على متاهة T على الخصم المتأخر²⁵. في نسخة الفئران الفعالة من مهمة المقامرة في ولاية أيوا ، تقرر الشبيهة بالهوس في كثير من الأحيان الخيارات غير المواتية (عالية المخاطر ، المكاسب العالية) مقارنة بعناصر التحكم²⁴ (الشكل 1 ب). يتم تقليل القلق لدى الشبيهة بالهوس ، كما يتضح من الوقت الذي يقضيه المزيد من الوقت في الأذرع المفتوحة في المتاهة المرتفعة^{زائد 25}.

يمكن إحداث نمط ظاهري يشبه الاكتئاب عن طريق إنهاء الإفراط في التعبير عن DRD1. في النوبة الشبيهة بالاكتئاب ، يمكن ملاحظة زيادة في العجز. في نموذج ثلاثي للعجز ، كانت المجموعة التي تعرضت لأول مرة لصدمة كهربائية (الشكل 1 ج) ، وكذلك المجموعة التي تعلمت التحكم في الصدمة ، أكثر عجزا مع زيادة زمن انتقال الهروب عند مقارنتها بعناصر التحكم^{الخاصة بها 27}. المجموعات التي تم فيها إحداث العجز ، لم تظهر أي اختلافات بين التجربة والضابطة. تم العثور على انعدام التلذذ في اختبار اختيار الزجاجتين للسكروز²⁷ وفي السلوك الجنسي (بيانات غير منشورة). في اختبار دفن الرخام ، كانت الشبيهة بالاكتئاب أكثر قلقا²⁶ (الشكل 1 د).

لا يوفر النموذج الحيواني الموصوف إمكانية التحقيق في السلوك الشبيه بالهوس أو الاكتئاب فحسب ، بل يوفر أيضا فرصة فريدة لملاحظة تحول في السلوك عند إنهاء الإفراط في التعبير عن DRD1 ، يشبه التحول من الهوس إلى الاكتئاب لدى المرضى. هنا ، من المهم أن تضع في اعتبارك التعود على سلوكيات معينة واختيار الاختبارات بأقل قدر من الاعتياد. على سبيل المثال ، زيادة السلوك الجنسي في الحلقة الشبيهة بالهوس وفي النوبة الشبيهة بالاكتئاب ، تم عرض انخفاض في هذا السلوك إلى مستويات مثل ما شوهدت في التحكم. في هذه التجربة ، تم إحداث ثلاث دورات شبيهة بالهوس / الاكتئاب داخل نفس²⁷. بالنسبة لشرب السكروز ، لم يتم تقليل تفضيل محلول السكروز في الحالة الشبيهة بالهوس إلى مستويات التحكم عند التحول إلى الحالة الشبيهة بالاكتئاب فحسب ، بل انخفض²⁷. في نسخة الفئران من مهمة المقامرة في ولاية أيوا ، زاد عدد الخيارات غير المواتية في الشبيهة بالهوس ولكنها لا تختلف اختلافا كبيرا عن الضوابط عندما كانت في حالة تشبه الاكتئاب. في الحالة الأخيرة ، تم تقليل عدد الكريات المكتسبة الإجمالية مقارنة بحيوانات المكافحة²⁴.

بشكل عام ، تظهر نمطا ظاهريا قويا يشبه ثنائي القطب ، يمكن ملاحظته في مجالات سلوكية مختلفة خلال كلتا الحلقتين. يساهم التبديل بين الحلقات في هذا النموذج في تحسين صلاحية الوجه. يتم إعطاء نظرة عامة على المجالات السلوكية المتأثرة في الشكل 2.

الشكل 1: التغيرات السلوكية في الحالات الشبيهة بالهوس والاكتئاب بعد الإفراط في التعبير الفيروسي DRD1. أثناء الإفراط في التعبير الفيروسي DRD1 ، في الحالة الشبيهة بالهوس ، تظهر المزيد من الحوامل الجنسية (A) وزيادة في الخيارات المحفوفة بالمخاطر في مهمة المقامرة في ولاية أيوا (B) مقارنة بالضوابط. بعد إنهاء الإفراط في التعبير ، تتحول إلى حالة تشبه الاكتئاب. يظهرون زيادة في العجز (C) والقلق (D). * ص < 0.05 ؛ ** ص < 0.01 ؛ تشير أشرطة الخطأ إلى الخطأ المعياري للمتوسط. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2: النمط الظاهري السلوكي للنموذج. في الحلقة الشبيهة بالهوس ، هناك زيادة في السلوكيات المتعلقة بالمكافأة (على سبيل المثال ، السلوك الجنسي) والاندفاع والمخاطرة. تم تقليل القلق في اختبار المتاهة المرتفعة. خلال النوبة الشبيهة بالاكتئاب ، زاد القلق في اختبار دفن الرخام ، وانخفض السلوك الجنسي ، وأظهرت المزيد من العجز. صورة الجرذ في الشكل مأخوذة من Servier Medical Art وهي مرخصة بموجب CC BY 4.0. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الجدول 1: اعتبارات التقييم السلوكي. يسلط الجدول الضوء على اعتبارات مهمة للخطوات التجريبية الرئيسية أثناء التقييم السلوكي. الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الجدول.

Discussion

هنا ، يتم تقديم نموذج فئران جديد ل BD مع زيادة صلاحية الوجه. يسمح التلاعب المستهدف ل DRD1 في mPFC بتحريض نمط ظاهري يشبه الهوس والاكتئاب في نفس. تسلط النتائج التمثيلية الضوء على نمط ظاهري شبيه بمرض يمكن ملاحظته في كلتا الحلقتين. النموذج سهل التطبيق نسبيا. هناك حاجة إلى ناقلين للفيروسات العدسية المحفزة يعبران عن DRD1 أو dsRed كمراقبة. لإنتاج واستخدام أنظمة الفيروسات العدسية في ، يلزم وجود مستويات أمان معينة ، والتي يجب أن تكون في مكانها الصحيح. إذا لم تكن المعدات اللازمة لإنتاج الفيروسات متوفرة ، فإن تجربة العمل مع المرافق الأساسية كانت إيجابية.

الخطوة الأكثر أهمية لإنشاء النموذج هي الحقن التجسيمي لنظام الفيروسات العدسية. العمليات الجراحية التجسيمية هي إجراءات راسخة في علم الأعصاب ، ومعدلات النجاح بين الباحثين المدربين مرتفعة. هناك مصدران رئيسيان محتملان للخطأ. يمكن أن تؤدي مشاكل التخدير إلى وفيات أثناء العملية الجراحية. هنا ، أثبت استخدام التخدير الاستنشاقي بالأيزوفلوران ، كما هو موضح في البروتوكول ، أنه أفضل نهج ، حيث تشكل مستويات الدواء القابلة للتعديل بسهولة فائدة واضحة مقارنة بالتخدير عن طريق الحقن. نظرا لأن الأيزوفلوران لا يوفر أي آثار مسكنة وأن مستقبلات الألم السحائية حساسة للتحفيز⁵² ، فمن المستحسن استخدام مادة أفيونية للتسكين أثناء الجراحة. إلى جانب الأدوية المناسبة بعد الجراحة ، كما هو موضح في البروتوكول ، لا توجد علامات ملحوظة للألم بعد الجراحة. ومع ذلك ، يجب دائما النظر في التأثيرات المحتملة على أسئلة البحث ، على سبيل المثال ، فيما يتعلق بتفاعلات الدوبامين مع نظام المواد الأفيونية ، ويجب اختيار نظام دوائي مناسب وفقا لذلك⁵³. إذا تم إجراء الجراحة في ظل ظروف معقمة ، فإن حدوث التهابات أو ضعف التئام الجروح أمر نادر الحدوث. في حالة حدوث مشكلات أثناء الجراحة أو التعافي، يجب أن تركز استكشاف الأخطاء وإصلاحها على التنفيذ الصحيح للبروتوكول الموصوف. من الضروري ضمان ظروف عمل معقمة وجرعات دقيقة من الأدوية. يمكن أن يساعد إعطاء محاليل السوائل أو الجلوكوز أيضا في التعافي. في حالة حدوث عدوى ، يجب ألا يشمل العلاج أي تتراسيكلين لأنها ستتفاعل مع نسخ الأنظمة الفيروسية. سيكون علاج الخط الأول لالتهابات الجروح بعد الجراحة هو الإنروفلوكساسين ، وربما يقترن بالكاربروفين.

مصدر آخر محتمل للخطأ أثناء الجراحة هو وضع الحقن خارج المنطقة المستهدفة. ومع ذلك ، نادرا ما يحدث هذا عندما يتم اتباع البروتوكول بشكل صحيح وضمان الوضع الصحيح لرأس. يجب دائما التحقق من التنسيب الناجح. في حين أن وضع الفيروس المعبر عن dsRed يمكن اكتشافه بسهولة في التحكم ، فإن التحقق من وضع الفيروسات التي تعبر عن DRD1 يتطلب خطوات إضافية. لم يؤد إجراء تلطيخ الأجسام المضادة ضد أجزاء مختلفة من البنية الفيروسية إلى نتائج مرضية. يوصى بالتحقق من وضع الفيروس عن طريق تشريح mPFC وإجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل للكشف عن نصوص rtTA3 كما هو موضح في Beyer et ^al.24. من المهم أيضا ملاحظة أن حقن الفيروس يجب أن يكون ثنائيا بكميات متساوية من الفيروس. ثبت أن التحول الجانبي الدماغي والسلوكي يختلف في المرضى الذين يعانون من الاضطراب ثنائي القطب^54،55 ، وقد لا تحفز الحقن الفيروسية أحادية الجانب النمط الظاهري السلوكي المطلوب.

يعمل تحريض تعبير DRD1 الفيروسي والحلقة الشبيهة بالهوس عن طريق إضافة الدوكسيسيكلين إلى مياه الشرب بشكل جيد للغاية. ثبت أن استبدال مياه الشرب العادية بالدوكسيسيكلين لا يسبب تغييرات ملحوظة في سلوك الشرب. ومع ذلك ، يجب مراقبة استهلاك السوائل. التعديلات ممكنة ، إذا كانت المواد الأخرى ، مثل الأدوية ، مخصصة ليتم إعطاؤها عن طريق مياه الشرب. يمكن أيضا إجراء إعطاء الدوكسيسيكلين عن طريق الكريات الغذائية. لكن لم يتم التحقق من صحة ذلك بعد.

للتحقيق السلوكي ، يتم سرد العديد من الاعتبارات في الجدول 1. يجب تقييم المتطلبات الخاصة بالنموذج بشكل خاص عند التخطيط لتجربة. على سبيل المثال ، يجب تحديد ما إذا كان سيتم اختبار مجموعتين من ، أو ما إذا كان واحد سيخضع لتقييم سلوكي خلال كلتا الحلقتين ، الأمر الذي قد يتطلب إعادة الاختبار. إذا لم يكن النمط الظاهري الشبيه بالقطب ثنائي القطب قابلا للاكتشاف أثناء التحقيق السلوكي، على الرغم من أنه يمكن التحقق من التنسيب، يمكن أن يركز استكشاف الأخطاء وإصلاحها على عوامل مختلفة قد تؤثر على النتيجة السلوكية. يجب تقييم التغييرات في المجربين أو إيقاع الساعة البيولوجية بشكل نقدي أثناء العملية ، حيث يمكن أن تؤثر الظروف العصيبة في البيئة على النتائج السلوكية.

بينما يوضح النموذج بنية جيدة وصلاحية الوجه ، لا تزال الصلاحية التنبؤية بحاجة إلى تقييم. يجب أن يكون إعطاء الليثيوم المزمن ، باعتباره علاج الخط الأول ل⁵⁶ دينار بحريني ، ناجحا في منع التغييرات التي يسببها النموذج في السلوك. يمكن التحقيق في الاستجابات للأدوية الأخرى المستخدمة في مرض بدين، مثل الأدوية المضادة للذهان أو الأدوية المضادة للاختلاج، لاختبار الصلاحية التنبؤية للنموذج بشكل كامل.

بالإضافة إلى ذلك ، فإن القيد الحالي هو أن صلاحية النموذج في إناث لا تزال بحاجة إلى تقييم في الدراسات المستقبلية. في حين أن هناك اتجاها لإدراج إناث في الأبحاث قبل السريرية ، إلا أن هذا لا يزال مهملا في كثير من الأحيان. بالنسبة للنموذج المقدم ، من المتوقع حدوث تفاعلات لنظام الدوبامين مع دورة الشبق. ومع ذلك ، من غير الواضح إلى أي مدى ستحدث. من المهم أيضا مراعاة القيود العامة لنماذج النفسية. في حين أن إمكانية إحداث كلتا النوبات الشبيهة بالمرض في فأر واحد توفر زيادة في صلاحية الوجه ، إلا أن التغييرات المستحثة خارجيا لا تزال تختلف عن الحدوث التلقائي ودورة نوبات المرض لدى مرضى التهاب الأبعاد. نظرا لأن النموذج يعتمد فقط على التلاعب المستهدف بنظام الدوبامين ، فإن التأثيرات الرئيسية ستحدث بسبب التغيرات في انتقال الدوبامين والتأثيرات الثانوية ذات الصلة. وبالتالي لا يتم احتساب مساهمات الأنظمة الأخرى في أعراض مرض بيد.

في الختام ، يتمتع النموذج المقدم بإمكانيات قوية للتحقيق في مرض بيدنج ، حيث يمكن دراسة كلتا النوبات المرضية في واحد. يقدم هذا إمكانيات فريدة للتحقيق في التحولات بين الحلقات مقارنة بمعظم النماذج الراسخة. يتطلب البروتوكول المقدم معدات ومهارات فنية متوفرة في معظم مختبرات الأبحاث قبل السريرية ، مما يجعله قابلا للتطبيق على نطاق واسع. حتى الآن ، كان النمط الظاهري السلوكي الناتج قويا عبر السلوكيات المختلفة. لم يتم بعد استكشاف مجالات أخرى مثل السلوك الاجتماعي⁵⁷ أو الوظائف المعرفية. بينما ركز البروتوكول المقدم على النتائج السلوكية ، هناك إمكانيات مختلفة للتطبيقات المستقبلية للتحقيق في الآليات الجزيئية بشكل أكبر. قد يؤدي توسيع التحقيقات لفهم الآليات الكامنة في التسبب في مرض BD ، خاصة فيما يتعلق بالانتقال بين النوبات ، إلى تحديد الأهداف العلاجية التي يمكن ترجمتها في النهاية إلى تطبيقات سريرية مستقبلية.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.9 mm burr	FST	19007-09	Burr for craniotomy
10 µl Neuros Syringe	Hamilton	65460-06	Mounted to syringe pump for injection
1ml single use Syringes	Braum	9166017V	Administration of medication
33 G Needles	Hamilton	65461-02	Replacement needles for neuros syringe
4-way valve	UNO	180000259	For simultaneous connection of induction chamber and face mask
Absorbent Drape	Sabanindas	1834014	Covering equipment before placing the animal
Anaesthetic Gas Filter	UNO	180000140	Anesthesia fume collection
Anasthesia mask for stereotactic	Hugo Sachs Electronic	73-4922	Administering anesthesia during surgery
Anesthesia vaporiser	UNO	180000002	Provide and adjust levels of vaporised isoflurane
Bone wax	SMI	Z046	Closing the hole in the skull
Bulldog clamps	FST	18038-45	To retain skin and allow access to the surgical field
Buprenorphine	Elanco	18760711	Interoperative analgesia
Cannula	Tegler	T138339	Administration of medication
Cellulose swabs	Meditrade	1177	Cleaning Skin
Connector	UNO	180000005	Connecting anesthesia tubing to face mask
Control Unit for heating pad	UNO	180000122	Controlling heating pad
Dental Dril	Saeyang	SMT K-38	Dental drill for craniotomy; equipable with fine dental burrs
Desktop digital stereotaxic instrument	RWD	E03135-002	Fully equipped stereotactic frame with digital manipulator
Destilled H2O	-	-	Rinsing the syringe
Doxycycline hyclate	Sigma aldrich	D9891	For model induction
Dry ice	-	-	Transporting viral suspension
Earbars	RWD	68302	Head fixation in the stereotactic frame
Ethanol	-	-	Rinsing the syringe and deactivating virus
Flowmeter	UNO	CM2	Verify and adjust flow rate
Forceps - anatomical	FST	11000-12	Holding skin
Forceps - surgical	FST	11027-12	Holding skin
Heating pad	UNO	180000028	Heating pad for keeping the animal warm during surgery
Induction chamber	UNO	180000233	Chamber for initial induction of anesthesia
Isoflurane	CP Pharma	V7005232.00.00	Anesthesia
Lentiviral suspension	-	-	Lentiviral construct coding for DRD1 or dsRed for model induction
Lidocaine	Combustin	8780701	Local analgesia
Meloxicam	Boehringer Ingelheim	7578423	Pre- and postoperative analgesia
Needle holder	FST	91201-13	Sutering
Oxygen concentrator	UNO	180000399	Providing oxygen for anesthesia
PE Tubing	-	-	Connecting components of the anesthesia machine to induction chamber & face mask
Pencil	-	-	Marking the correct side for craniotomy
Scalpel blade holder	FST	10003-12	To hold scalpel blade
Scapel blades	FST	10011-00	Fine surgical blade for incision
Scavenger Unit	UNO	180000260	Controlling capacity of fume collector
Skin disinfectant	Bode	975042	Disinfacting skin before incision
Sterile cotton swabs	Boettger	1102241	Cleaning surgical field
Sterile eye cream	Bayer	1578675	Protect eyes during surgery
Surgical Scissors	FST	14000-12	Trimming fur and cutting suture material
Suture 3-0 polyglycolic acid	SMI	11201519	Suturing skin
Syringe pump	KdScientific	788130	Syring pump with connectable holder