양극성 장애에 대한 쥐 모델 개발

요약

이 기사는 조증과 같은 행동과 우울증과 같은 행동을 모두 포착하는 양극성 장애의 독특한 쥐 모델을 유도하기 위한 프로토콜을 제시합니다.

초록

양극성 장애는 감정적 고조(조증)와 최저(우울증)를 포함하여 극심한 기분 변화를 특징으로 하는 정신 건강 상태입니다. 정확한 기저 신경생물학은 아직 완전히 이해되지 않았지만, 신경전달물질 체계의 불균형, 특히 도파민이 중심적인 역할을 하는 것으로 보입니다. 이러한 이유로, 도파민 경로의 조작은 설치류의 조증이나 우울증을 모델링하는 데 사용되었습니다. 그러나 이 두 에피소드 사이의 일반적인 전환을 정확하게 나타내는 모델은 드물기 때문에 얼굴 타당성이 제한됩니다. 독특한 모델에서는 현대 기술을 사용하여 양극성 장애의 병리학과 관련된 도파민 D1 수용체 발현을 일시적으로 증가시킵니다. 칼모듈린 키나아제 II 알파 프로모터의 제어 하에 도파민 D1 수용체를 발현하는 테트라사이클린 유도성 렌티바이러스 구조체를 성체 쥐의 내측 전전두엽 피질에 정위 방식으로 주입합니다. 도파민 D1 수용체 과발현은 동물의 식수에 테트라사이클린 유사체 독시사이클린을 첨가하여 달성되며, 이는 보상 관련 행동, 충동 행동 및 위험 감수 행동의 증가와 불안의 감소로 이어집니다. 이러한 행동은 조증과 같은 표현형과 유사합니다. 식수에서 독시사이클린을 제거함으로써, 무력감과 무쾌감증의 증가를 특징으로 하는 우울증과 같은 표현형이 같은 동물 내에서 유발될 수 있습니다. 이 기사는 수술을 수행하기 위한 단계별 프로토콜과 양극성 장애와 유사한 표현형을 유도하는 절차를 제공합니다. 또한 조증과 유사한 행동 및 우울증과 같은 행동과 관련된 행동 변화를 평가하기 위한 고려 사항에 대해 설명합니다. 좋은 구조와 얼굴 타당성을 보여주는 이 유망한 모델은 양극성 장애의 병태생리학적 메커니즘을 추가로 조사하기 위한 귀중한 도구를 제공합니다.

서문

양극성 장애(Bipolar disorder, BD)는 세계 인구의 약 1%에 영향을 미치는 심각한 기분 장애입니다¹. 그것은 극단적인 기분, 우울증 및 조증의 에피소드와 함께 행복 상태가 특징입니다. BD의 우울 에피소드 증상은 단극성 우울증의 증상과 유사합니다. 환자는 활동에 대한 관심과 즐거움이 감소하고 슬픔, 절망감, 무가치한 느낌이 든다. 또한 식욕, 수면 행동, 인지 장애의 변화가 종종 관찰될 수 있습니다². 조증 삽화는 비정상적으로 고조된 기분, 수면 욕구 감소, 사회적 억제 감소, 자존감 증가, 거만감, 위험 감수 및 짜증 증가를 특징으로 합니다².

BD의 질병 병인은 유전적 요인과 발달적 요인³의 복잡한 상호작용인 것으로 보이지만, BD의 병태생리학에 관여하는 정확한 메커니즘은 아직 완전히 이해되지 않고 있습니다. 증상은 신경전달^{물질 체계의} 불균형으로 인해 발생하는 것으로 생각되며4, 특히 도파민 체계에 초점을 맞춘 연구가 영향을 미쳤다⁵. 예를 들어, Berk 등6은 도파민 가설^{을 가정하여} 도파민 과다 상태가 조증의 기저에 있는 반면 우울증은 도파민 저하증에서 발생한다고 가정했습니다. 그 이후로, 동물 모델의 증거와 약리학 및 영상 연구는 조증 증상과 고도파민증 사이의 연관성에 대한 강력한 지지를 모았습니다. 또한, 도파민 신호 감소와 우울증 삽화 사이의 연관성을 찾을 수 있지만^{, 그 정도}는 덜하지만 7. 또한, 유전자 조사의 결과는 BD⁸의 도파민 가설에 대한 아이디어를 강화했습니다.

BD에서 도파민 시스템의 역할을 더 자세히 밝히기 위해 동물 모델을 사용하여 증상의 기저에 있는 신경생물학적 메커니즘을 조사할 수 있습니다. 질병 모델의 적용 및 한계는 Willner⁹가 처음 제안한 세 가지 검증 기준에 따라 평가되는 경우가 많습니다. 여기에는 얼굴, 구성 및 예측 타당성이 포함됩니다. 얼굴 타당성은 장애의 행동 특성을 모방하는 모델의 능력을 설명합니다. 구성 타당도는 장애의 병태생리학 및 병인이 모델의 기초가 될 때 도달하는 반면, 예측 타당성은 장애의 약리학적 치료가 모델 내에서 재현될 수 있음을 의미합니다.

지금까지 다양한 설치류 모델이 BD¹⁰ 에 대한 이해에 기여했으며 광범위한 유전자 변형, 제약 개입 및 환경 조작을 포함합니다¹¹.

예를 들어, Clock 유전자의 실험적 조작은 마우스에서 조증과 같은 표현형을 유도하는 것으로 나타났습니다. 전사 인자 CLOCK은 일주기 리듬을 조절하는 데 중요한 역할을 하며, Clock 전사를 활성화할 수 없는 단백질을 발현하는 유전자 변형 마우스는 과잉 행동과 보상 반응 증가를 특징으로 합니다¹². 그 결과로 생긴 표현형은 뇌의 복부 피개(ventral tegmental area)에서 도파민 신호전달을 위해 차등적으로 조절되는 유전자에 의해 매개되는 것으로 보인다¹³.

정신자극제인 암페타민(amphetamine)과 같은 도파민 증가 약물의 투여를 통해 도파민 신호전달에 직접적인 영향을 미치는 것은 과잉운동을 유도하는 것으로 나타났으며, 그 후의 금단 증상은 무쾌감증(anhedonia)을 포함한 우울증과 유사한 증상과 관련이 있었다¹⁴. 케타민 또는 도파민 D2/D3 수용체 작용제 퀸피롤의 약리학적 도전은 또한 BD^15,16과 관련된 행동을 유도하는 것으로 나타났습니다.

약리학적 개입 외에도 수면 박탈과 같은 환경 조작을 사용하여 BD¹⁷과 관련된 행동 표현형을 유도할 수 있습니다. 수면이 부족한 동물은 도파민 신호의 변화와 관련된 초음파 발성의 증가된 운동 및 방출을 특징으로 하는 조증과 같은 표현형을 보여줍니다¹⁸.

우울증¹⁹ 또는 조증 같은²⁰ 행동을 연구하기 위한 수많은 다른 설치류 모델이 있습니다. 그러나 이러한 모든 모델이 BD 병리학에 대한 이해에 크게 기여했지만 한 번에 하나의 에피소드만 연구하거나 단기적인 효과만 연구하는 데 한계가 있습니다. 대조적으로, 정서적 상태 간의 특징적인 전환을 모델링하는 것은 달성하기 어려웠습니다.

여기에서는 BD에 대한 고유한 랫 모델에 대한 프로토콜이 제시됩니다. 이는 도파민 시스템의 단일 표적 조작, 즉 테트라사이클린 유도성 렌티바이러스 구조체로부터 내측 전전두엽 피질(mPFC)의 도파민 D1 수용체(DRD1)를 조건부로 과발현하여 한 동물에서 두 에피소드를 모두 유도함으로써 얼굴 타당성이 증가했음을 보여줍니다. DRD1은 Calmodulin kinase II alpha (CamKIIa) promoter의 제어 하에 유전자 전사를 유도함으로써 주로 글루타메이터성 뉴런에서 발현되어 유전자 조작의 특이성을 증가시킵니다.

원래의 렌티바이러스 백본 pRRL.cPPT.WPRE.Sin은 Didier Trono 박사(Ecole Polytechnique Fédérale de Lausanne, 스위스)²¹ 에 의해 제공되었으며, GFP 미니유전자를 폴리링커 부위(lentivirus vector PL13)로 대체하여 수정되었습니다. 그런 다음 PL13을 사용하여 PL13.pTRE2.DRD1.CamKIIa.rtTA3 또는 PL13.pTRE2.dsRedExpress.CamKIIa.rtTA3을 생성했습니다. 랫드 DRD1의 cDNA는 Dr. David Sibley (NINDS/NIH)²²에서, 역 테트라사이클린 제어 활성제 3 (rtTA3) cDNA는 Atze Das 박사와 Ben Berkhout (암스테르담 대학교 아카데믹 메디컬 센터)에서 얻었다²³. CamKIIa 프로모터 DNA는 Karl Deisseroth 박사(Stanford University, CA)에 의해 제공되었으며, dsRedExpress 및 tetracycline response element 2 (pTRE2) 염기서열은 각각 사내 플라스미드 pcDNA3.1-dsRedExpress 및 pcDNA3.1-pTRE2로부터 subclone되었습니다. 바이러스 벡터는 제한 부위 옆에 있는 PCR 증폭 DNA 염기서열을 서브클로닝하여 생성되었습니다.

이 바이러스 벡터를 사용하는 모델은 mPFC CamKIIa 양성 뉴런에서 DRD1의 과발현이 조증과 같은^표현형을 유발하는 반면^, 유전자 발현의 후속 하향 조절은 우울증과 같은 행동을 유도한다는 것을 보여주었습니다²⁶. 질병과 유사한 표현형은 한 동물에서 반복적으로 유도될 수 있기 때문에⁽²⁷), 이 모델은 높은 수준의 얼굴 타당성을 반영합니다. 또한, DRD1 수준^28,29 또는 DRD1 다형성의 변화가 BD 병리학^30,31,32와 연관되어 있기 때문에 도파민 시스템의 조작은 BD⁷의 동물 모델에 대한 강력한 구성 타당성을 보유합니다.

다른 동물 연구도 전전두엽 DRD1의 기능에 대한 이해를 높였습니다. 예를 들어, DRD1의 감소는 우울증 모델에서 일관되게 발견되었으며, ^33,34 mPFC 글루타메이터성 뉴런에서 DRD1의 광유전학적 자극은 불안을 감소시키고 항우울 효과를 유도한다³⁵. Wu et ^al.36의 최근 간행물에서 정서적 상태 전이에서 mPFC DRD1의 역할이 입증되었습니다. 이 연구는 이러한 수용체가 흥분성 시냅스 가소성의 근본적인 변화에 중요하다는 점을 강조합니다.

전체적으로 mPFC의 CamKIIa 양성 뉴런에서 DRD1의 표적 및 조건부 조작으로 구성된 BD의 랫트 모델을 사용하면 구조 및 얼굴 타당도가 높은 모델 시스템을 구성하므로 BD에 대한 중개 연구에 대한 강력한 잠재력을 보여줍니다.

다음에서는 모델 생성을 위한 수술 절차에 대해 설명합니다. 또한, 모델 유도 및 행동 평가에 대한 방법론적 고려 사항이 결과 질병 유사 표현형의 대표적인 결과와 함께 제시됩니다. 모델 생성 및 행동 평가에서 가능한 장애물과 영향 요인에 대해 논의하고 향후 방향에 대한 전망을 제공합니다.

프로토콜

여기에 설명된 정위 주입 프로토콜은 LANUV(Landesamt für Natur, Umwelt und Verbraucherschutz, Northrhine-Westfalia, Germany)의 승인을 받았습니다. 성인 수컷 Sprague Dawley 쥐 (체중 350-650g)를 사용했습니다. 이 연구에 사용된 시약 및 장비는 재료 표에 나열되어 있습니다.

1. 렌티바이러스 구조체

참고: 3세대 렌티바이러스 시스템은 제어 조건으로 DRD1 또는 적색 형광 단백질(dsRed)의 조건부 발현에 사용됩니다^25,27.

1. Stewart et ^al.37 의 프로토콜에 따라 Addgene 저장소에서 패키징 플라스미드 8454 및 8455를 사용하여 렌티바이러스를 생산합니다.
   참고: 바이러스 생산이 독립적으로 계획되지 않은 경우 독일의 Charité Berlin과 같은 많은 핵심 시설에서 고역가 렌티바이러스를 제공합니다.
2. 역가 농축 바이러스를 -80 °C에서 보관합니다.
3. 주입을 위해 μL당 2 × 10^{7 transducing} units (TU)를 준비합니다.
4. 드라이아이스를 타고 수술실로 바이러스를 운반합니다.

2. 동물

참고: BD에 대한 쥐 모델은 성인 수컷 Sprague Dawley 쥐(체중 350-650g)에서 확립되었습니다. 암컷 쥐 또는 초기 발달 시점에 대한 조사를 위해서는 mPFC에서 DRD1의 발현이 발달 중 변화하고 발정 주기의 영향을 받을 수 있다는 점을 고려하는 것이 중요합니다 38,39,40.

1. 일정한 온도 및 습도 조건(45%-65% 상대 습도, 온도 22°C ± 2°C )에서 음식과 물을 자유롭게 사용하는 동일한 조건의 동물과 짝을 이룹니다.
2. 쥐를 역으로 12시간의 명암 주기(오전 11시에 불이 꺼짐) 하에 두고, 어둠 속에서 동물의 활동 단계에서 행동 조사가 수행되어야 합니다.
3. 실험을 시작하기 전에 동물들이 시설과 실험자의 취급에 적응할 수 있도록 최소 7일의 시간을 줍니다.

3. 바이러스 구조체의 정위 주입

참고: 안전 후드(렌티바이러스 작업 시 주의사항) 및 무균 상태에서 수술을 수행하십시오.

1. 준비
   1. 필요한 모든 재료가 사용 가능하고 기능하는지 확인합니다(재료 표).
   2. 주사기 홀더가 정위 암에 부착된 정위 프레임을 설정합니다. 주사기 홀더를 주사기 펌프에 연결합니다.
   3. 치과용 드릴을 설치하고 0.9mm 버를 장착합니다.
   4. 가열 패드를 놓고 37 °C로 설정합니다. 쥐를 더 쉽게 배치할 수 있도록 가열 패드를 적절한 높이로 올리십시오.
   5. 흡수성 드레이프로 가열 패드를 덮으십시오.
   6. 멸균 표면에 오토클레이브 수술 기구를 준비합니다.
   7. 33G 주입 바늘이 있는 10μL 입체식 주입 주사기를 주사기 홀더에 장착합니다.
   8. 각각 1μl의 양측 주사를 위해 2.3μL의 바이러스 현탁액을 회수합니다. 성공적인 출금을 육안으로 확인합니다. 렌티바이러스가 실온에 도달하는 데 걸리는 시간을 최소화하기 위해 이 단계를 마지막 준비 단계로 수행해야 합니다.
2. 진통제와 마취 유도
   1. 수술 당일 아침에 멜록시캠(체중 1mg/kg, p.o.)을 투여합니다.
   2. 진통 수술 시작 20분 전에 쥐에게 부프레노르핀(체중 0.5mg/kg, s.c.)을 주사합니다.
   3. 0.8-1 L/min의 산소 흐름으로 마취 기계를 켭니다.
   4. 유도실에 4% 이소플루란을 주입하고 쥐를 유도실에 넣습니다.
   5. 호흡 둔화와 의식 상실로 보이는 마취를 성공적으로 유도한 후, 유도실에서 쥐를 제거하고 정위 프레임으로 옮깁니다.
3. 쥐의 위치 지정
   1. 마취 흐름이 코 마스크로 전환되었는지 확인하십시오.
   2. 쥐를 유도 챔버에서 정위 프레임으로 옮기고 앞니를 홀더에 놓습니다.
   3. 마취 마스크를 코에 올바르게 대고 유지 관리를 위해 이소플루란을 1.5-2.3%로 돌립니다.
   4. 멸균 아이크림으로 눈을 보호해 주세요.
   5. 절개를 하기 최소 10분 전에 계획된 절개 부위 바로 아래에 리도카인(체중 10mg/kg, s.c.)을 쥐에게 국부적으로 주사합니다.
   6. 이어바를 사용하여 정위 프레임에 쥐를 고정합니다. 이어바가 평평하고 머리 위치가 평평한지 확인하십시오.
   7. 가위를 사용하여 절개 부위 주변의 털을 다듬습니다. 피부 소독제를 적신 셀룰로오스 패드를 사용하여 털 조각을 제거합니다.
   8. 피부 소독제를 사용하여 수술 부위를 소독하십시오.
4. 개두술 및 바이러스 구조물 주입
   1. 발가락 반사가 없는지 확인하여 적절한 마취를 보장합니다.
   2. 장비를 만지기 전에 손을 소독하고 멸균 장갑으로 교체하십시오.
   3. 메스 날을 사용하여 작은 내측 절개(~1.5cm)를 만듭니다.
   4. 불독 클램프로 피부를 옆으로 밀어 수술 부위에 안전하게 접근할 수 있습니다.
   5. 멸균 스왑을 사용하여 혈액과 남아 있는 조직에서 수술 부위를 청소합니다. 브레그마의 적절한 시력과 충분한 전방 공간을 확보하십시오.
   6. 브레그마를 기준으로 A/P 및 M/L 좌표를 0으로 설정합니다.
   7. 정위 팔을 A/P + 2.7 및 M/L ± 0.4 좌표로 이동하고 소독된 연필을 사용하여 시각화합니다.
   8. 직경 ~1mm의 구멍을 뚫어 양쪽 반구의 주입면을 덮습니다.
   9. 멸균 스왑을 사용하여 모든 혈액을 제거합니다.
   10. 뇌 표면에서 D/V 좌표를 0으로 설정하고 주사 바늘을 -2.8로 천천히 내려 mPFC의 변연계 전 영역에 주입합니다.
   11. 조직이 이완될 때까지 5분 동안 기다립니다.
   12. 0.1μL/min의 속도로 1μL의 바이러스 현탁액을 주입합니다.
   13. 바늘을 천천히 제거하기 전에 흡수될 때까지 5분 동안 기다립니다.
   14. 다른 반구에서 주입을 반복합니다.
5. 봉합 및 수술 후 관리
   1. 바늘을 제거하고 뼈 왁스를 사용하여 두개골의 구멍을 닫습니다.
   2. 불독 클램프를 제거하고 피부를 봉합합니다(3-0 수술 봉합사).
   3. 수술 후 진통제를 위해 쥐에게 meloxicam(1mg/kg, s.c.)을 주사합니다.
   4. 마취를 끄고 정위 프레임에서 동물을 제거한 다음 가정용 케이지에 넣습니다. 쥐가 완전히 깨어나는지 확인하십시오.
   5. 주사기를 100% 에탄올로 헹구어 남아 있는 렌티바이러스를 비활성화한 다음 증류된 H₂O를 사용하여 다음 주사를 준비합니다.
   6. 3일 동안 24시간마다 meloxicam(1mg/kg, p.o.)으로 수술 후 진통제를 수행하고 1주일 동안 동물의 건강 상태를 점수화합니다.
   7. 다른 사람이 봉합사를 조작하는 것을 방지하기 위해 수술 후 처음 24시간 동안 단독 사육 동물. 나중에 케이지 동료와 함께 다시 놓습니다.

4. 모델 유도를 위한 독시사이클린 치료

참고: 주입 후 24시간 이내에 모델 유도를 시작하십시오. 또한 주입과 유도 사이에 최대 몇 개월의 더 긴 기간을 기다릴 수 있습니다(예: 동시에 더 큰 동물 코호트를 테스트하기 위해). 이는 바이러스 구조의 기능에 영향을 미치지 않는 것으로 나타났습니다.

1. 매니아 같은 에피소드의 유도
   1. 조증과 같은 표현형을 유도하려면 식수에 첨가하여 동물에게 0.5g/L 독시사이클린 하이클레이트를 제공하십시오. 이는 바이러스 전사와 추가적인 DRD1의 과발현을 유도합니다.
   2. 독시사이클린이 함유된 물을 48시간에서 72시간마다 신선하게 준비하며, 이는 불투명하지 않은 물병에서도 독시사이클린의 안정성에 영향을 미치지 않는 기간입니다⁴¹.
      참고: 7일 동안 독시사이클린을 치료한 후에는 바이러스에 의한 과발현이 최대치에 도달하게 되며, 조증과 유사한 에피소드 동안 행동 조사를 수행할 수 있습니다.
2. 우울증과 유사한 에피소드의 유도
   1. 동물들을 정상적인 식수로 다시 바꿔서 우울증과 같은 에피소드를 유도합니다.
   2. 바이러스 전사가 멈출 때까지 4일 동안 기다린 다음 우울증과 유사한 에피소드에 대한 행동 평가를 수행합니다.
   3. 동일한 패턴에 따라 후속 에피소드 유도를 수행합니다.

5. 행동 평가

참고: 모델 귀납 후에는 양극성과 같은 행동을 평가할 수 있습니다. 임상 증상에서 설치류에서 관찰할 수 있는 행동 패턴에 이르기까지 다양한 번역 프레임워크가 제안되었습니다. 가장 영향력 있는 것 중 하나는 정신 장애에 영향을 미칠 수 있는 기능 및 행동 영역의 변화를 조사하는 연구 영역^{기준 42}입니다. 그러나 종 장벽으로 인해 자살 충동과 같은 일부 증상은 설치류에서 조사할 수 없다는 점에 유의하는 것이 중요하다⁴³. 그들의 진보된 인지 및 정서적 능력으로 인해, 쥐 모델은 특히 번역 증상 평가에 대한 강력한 잠재력을 가지고 있으며⁴⁴, 보다 정교한 검사 절차를 가능하게 한다. 행동 평가에 대한 고려 사항은 표 1에 설명되어 있습니다.

1. 행동 검사를 행동 테스트⁴⁵의 배터리로 계획하여 결과 표현형에 대한 포괄적인 그림을 제공합니다.
2. 마지막에 더 침습적인 테스트를 수행하는 데 주의하십시오.
3. 두 질병과 유사한 에피소드에서 한 동물을 테스트하려고 할 때 이전 테스트 경험으로 인해 발생할 수 있는 행동 변화를 고려하십시오.
   참고: 당면한 질문에 따라, 조증 또는 우울증과 같은 에피소드 동안 다른 그룹의 쥐를 테스트하는 것이 도움이 될 수 있으며, 이는 또한 각 에피소드 동안 조직을 수집할 수 있도록 합니다. 경험에 따르면 행동적으로 순진한 동물을 테스트하면 특정 행동 테스트에서 더 두드러진 표현형을 얻을 수 있습니다.
4. 또한, 주거 조건⁴⁶ 또는 실험자의 성별⁴⁷과 같은 다른 요인들도 고려한다.
5. 동물에 대한 의도하지 않은 스트레스를 줄이기 위해 가능한 모든 조치를 취해야 하며, 이는 동물 복지뿐만 아니라 정신의학적 표현형과 스트레스의 가능한 상호 작용을 배제하기 위해서이다⁴⁸.
6. 일주기 리듬의 붕괴는 BD¹⁷의 증상이므로 일주기 리듬에 특히 주의하십시오. 쥐는 황혼과 새벽에 가장 활동적이기 때문에 역명암 주기⁴⁹ 아래에 있는 동물과 함께 희미한 적색 조명 아래에서 테스트해야 합니다.
   참고: 여기에 제시된 대부분의 대표 결과는 이 접근 방식에 따라 수집되었습니다. 그러나 질병과 유사한 표현형은 동물의 낮과 밤 주기를 전환하지 않고 행동 평가가 수행되는 경우 여전히 관찰할 수 있습니다²⁷.
7. 항상 실험을 사전 등록하고 수행하며 PREPARE⁵⁰ 및 ARRIVE⁵¹ 지침에 따라 설명합니다.

결과

동물의 식수에 독시사이클린을 첨가하면 DRD1이 추가로 발현되고 7일 후에는 동물의 조증과 같은 행동을 테스트하기에 충분한 과발현이 있을 것입니다. 지금까지는 보상 관련 행동이 증가한 것으로 나타났습니다. 조증과 같은 동물은 대조군과 비교했을 때 두 병 선택 테스트에서 물과 관련하여 자당 용액을 더 많이 마신다²⁵. 수용적인 암컷과 함께 관찰 상자에 넣고 25분 동안 관찰했을 때, 조증과 같은 동물은 대조군²⁷ 에 비해 더 많은 성적 탈것을 보였다(그림 1A). 코카인 자가 투여 패러다임에서, 그들은 고정된 비율 일정에 따라 더 많은 코카인을 투여하고 누진 비율 일정에서 더 높은 중단점을 보여줍니다. 이들의 용량-반응 곡선은 저용량에 대한 높은 민감도로 이동한다²⁵. 이러한 민감도의 변화는 여러 장소 조건화 패러다임에서 증가된 동기 부여 현저성에서도 관찰됩니다. 조증을 보이는 동물은 대조군에 비해 니코틴, 알코올, 코카인을 조절하는 쪽에서 더 많은 시간을 보냈다(²⁵). 지연된 할인에 대한 T-미로 기반 테스트에서 증가된 참신함 추구와 더 충동적인 선택도 발견되었다²⁵. 아이오와 도박 과제의 조작적 쥐 버전에서, 조증과 같은 동물은 대조군에 비해 불리한(고위험, 고이득) 선택을 더 자주 내립니다²⁴ (그림 1B). 조증과 같은 동물의 불안은 감소하며, 이는 높은 미로와^{미로 25}에서 팔을 벌리고 더 많은 시간을 보내는 것으로 나타납니다.

DRD1 과발현을 종료함으로써 우울증과 유사한 표현형이 유도될 수 있습니다. 우울증과 유사한 삽화에서는 무력감의 증가가 관찰될 수 있었다. 무력감의 삼중적 패러다임에서, 처음으로 전기 충격을 받은 그룹(그림 1C)과 충격을 조절하는 방법을 배운 그룹은 각각의 대조군과 비교했을 때 탈출 지연 시간이 증가하여 더 무력했습니다²⁷. 무력감이 유발된 집단은 실험 동물과 대조 동물 사이에 어떠한 차이도 보이지 않았다. 무쾌감증은 자당²⁷ 에 대한 2병 선택 테스트와 성적 행동(미발표 데이터)에서 발견되었습니다. 대리석 매장 테스트에서 우울증을 앓는 동물은 또한 더 불안해했다²⁶ (그림 1D).

설명된 동물 모델은 조증 또는 우울증과 유사한 행동을 조사할 수 있는 가능성을 제공할 뿐만 아니라 환자의 조증에서 우울증으로의 전환과 유사한 DRD1 과발현을 종결할 때 행동의 전환을 관찰할 수 있는 독특한 기회를 제공합니다. 여기서 특정 행동에 대한 습관화를 염두에 두고 최소한의 습관화로 테스트를 선택하는 것이 중요합니다. 예를 들어, 조증과 같은 에피소드와 우울증과 같은 에피소드에서 증가된 성적 행동은 대조 동물에서 볼 수 있는 것과 같은 수준으로 감소하는 것으로 나타났습니다. 이 실험에서는 동일한 동물 내에서 세 번의 조증/우울증과 유사한 주기가 유도되었습니다²⁷. 자당 음주의 경우, 조증과 같은 상태에서 자당 용액에 대한 선호도는 우울증과 같은 상태로 전환되었을 때 대조 수준으로 감소했을 뿐만 아니라 감소했다²⁷. 아이오와 도박 과제의 쥐 버전에서, 조증과 같은 동물에서 불리한 선택의 수가 증가했지만 동물이 우울증과 같은 상태에 있을 때 대조군과 크게 다르지 않았습니다. 후자의 상태에서, 전체적으로 획득된 펠릿의 수는 대조 동물에 비해 감소했다²⁴.

전반적으로 동물은 강력한 양극성과 같은 표현형을 보이며, 두 에피소드 동안 서로 다른 행동 영역에서 관찰할 수 있습니다. 이 모델에서는 에피소드 간의 전환이 얼굴 타당성을 향상시키는 데 기여합니다. 영향을 받는 행동 영역에 대한 개요는 그림 2에 나와 있습니다.

그림 1: 바이러스 DRD1 과발현 후 조증 및 우울증 유사 상태에서의 행동 변화. 바이러스성 DRD1 과발현 동안, 조증과 같은 상태에서, 동물들은 대조군에 비해 아이오와 갬블링 태스크(B)에서 더 많은 성적 탈것(A)과 위험한 선택의 증가를 보입니다. 과잉 발현이 끝난 후 동물은 우울증과 같은 상태로 전환됩니다. 그들은 무력감(C)과 불안(D)의 증가를 보여줍니다. *P < 0.05; **p < 0.01; 오차 막대는 평균의 표준 오차를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2: 모델의 행동 표현형. 조증과 같은 에피소드에서는 보상 관련 행동(예: 성적 행동), 충동성, 위험 감수가 증가합니다. 높은 미로 테스트와 고도 미로 테스트에서 불안이 감소했습니다. 우울증과 유사한 에피소드 동안, 대리석 묻기 테스트에서 불안이 증가했고, 성적 행동이 감소했으며, 동물들은 더 많은 무력감을 보였다. 그림의 쥐 이미지는 Servier Medical Art에서 가져왔으며 CC BY 4.0에 따라 라이센스가 부여되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

표 1: 행동 평가에 대한 고려 사항. 이 표는 행동 평가 중 주요 실험 단계에 대한 중요한 고려 사항을 강조합니다. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

토론

여기에서는 얼굴 타당성이 증가된 BD에 대한 새로운 랫트 모델을 제시합니다. mPFC에서 DRD1의 표적 조작은 동일한 동물에서 조증 및 우울증과 유사한 표현형의 유도를 가능하게 합니다. 대표적인 결과는 두 에피소드 모두에서 관찰 가능한 질병과 유사한 표현형을 강조합니다. 이 모델은 비교적 쉽게 적용할 수 있습니다. DRD1 또는 dsRed를 대조군으로 발현하는 두 개의 유도성 렌티바이러스 벡터가 필요합니다. 동물에서 렌티바이러스 시스템을 생산하고 사용하려면 특정 안전 수준이 필요하며, 이는 적절한 조치를 취해야 합니다. 바이러스 생산에 필요한 장비를 사용할 수 없는 경우 핵심 시설에서 작업한 경험은 긍정적입니다.

모델을 생성하기 위한 가장 중요한 단계는 렌티바이러스 시스템의 정위 주입입니다. 정위 수술은 신경 과학에서 잘 확립된 절차이며 훈련된 연구자들의 성공률이 높습니다. 오류의 원인은 크게 두 가지로 나타날 수 있습니다. 마취 문제는 수술 중 사망으로 이어질 수 있습니다. 여기서, 프로토콜에 설명된 대로 이소플루란 흡입 마취를 사용하는 것이 약물 수준을 쉽게 조절할 수 있기 때문에 주사 마취에 비해 분명한 이점이 있기 때문에 최선의 접근 방식임이 입증되었습니다. 이소플루란은 진통 효과를 제공하지 않고 수막 통각 수용기는 자극에 민감하기 때문에⁵², 수술 중 진통제를 위해 오피오이드를 사용하는 것이 좋다. 프로토콜에 설명된 대로 적절한 수술 후 약물 치료와 병행하면 수술 후 통증의 눈에 띄는 징후가 없습니다. 그러나 도파민과 오피오이드 체계의 상호작용과 같은 연구 질문에 미칠 수 있는 영향은 항상 고려되어야 하며, 그에 따라 적절한 약물 요법을 선택해야 한다⁵³. 무균 상태에서 수술을 수행하는 경우 감염이나 상처 치유 장애가 발생하는 경우는 드뭅니다. 수술 또는 회복 중 문제가 발생하는 경우 문제 해결은 설명된 프로토콜의 올바른 실행에 중점을 두어야 합니다. 무균 작업 조건과 정확한 약물 투여를 보장하는 것이 필수적입니다. 수액 또는 포도당 용액을 투여하면 회복에 추가로 도움이 될 수 있습니다. 감염이 발생하면 바이러스 시스템의 전사와 상호 작용하기 때문에 치료에 테트라사이클린을 포함해서는 안 됩니다. 수술 후 상처 감염에 대한 1차 치료는 엔로플록사신(enrofloxacin)이며, 카프로펜(carprofen)과 병용할 수 있다.

수술 중 발생할 수 있는 또 다른 실수는 주사를 목표 부위 밖에 배치하는 것입니다. 그러나 이것은 프로토콜이 올바르게 준수되고 동물의 머리가 적절하게 배치되는 경우 거의 발생하지 않습니다. 성공적인 배치는 항상 검증되어야 합니다. dsRed-발현 바이러스의 배치는 대조 동물에서 쉽게 검출할 수 있지만, DRD1 발현 바이러스의 배치 검증에는 추가 단계가 필요합니다. 바이러스 구조체의 다른 부분에 대해 항체 염색을 수행했지만 만족스러운 결과를 얻지 못했습니다. Beyer et ^al.24에 기술된 바와 같이 mPFC를 해부하고 PCR을 수행하여 rtTA3 전사체를 검출하여 바이러스 배치를 확인하는 것이 좋습니다. 또한 바이러스 주입은 동일한 양의 바이러스와 양측으로 이루어져야 한다는 점에 유의하는 것이 중요합니다. 양극성 장애 환자에서 대뇌 및 행동 측방화가 다른 것으로 나타났으며,^54,55 편측 바이러스 주사는 원하는 행동 표현형을 유도하지 못할 수 있습니다.

바이러스성 DRD1 발현의 유도와 식수에 독시사이클린을 첨가하여 조증과 같은 에피소드를 유발하는 것이 매우 효과적입니다. 일반 식수를 독시사이클린으로 대체하면 음용 행동에 뚜렷한 변화를 일으키지 않는 것으로 입증되었습니다. 그러나 유체 소비량을 모니터링해야 합니다. 약물과 같은 다른 물질을 식수를 통해 투여하려는 경우 조절이 가능합니다. 독시사이클린 투여는 식품 펠릿을 통해 서도 수행할 수 있습니다. 그러나 이것은 아직 검증되지 않았습니다.

행동 조사의 경우 몇 가지 고려 사항이 표 1에 나열되어 있습니다. 특히 실험을 계획할 때 모델별 요구 사항을 평가해야 합니다. 예를 들어, 두 그룹의 동물을 대상으로 실험을 할 것인지, 아니면 한 동물이 두 에피소드 모두에서 행동 평가를 받을 것인지를 결정해야 하며, 이는 재검사가 필요할 수 있습니다. 행동 조사 중에 양극성과 같은 표현형을 감지할 수 없는 경우, 배치를 확인할 수 있지만 문제 해결은 행동 결과에 영향을 미칠 수 있는 다양한 요인에 초점을 맞출 수 있습니다. 실험자나 생체 리듬의 변화는 스트레스가 많은 환경 조건이 행동 결과에 영향을 미칠 수 있으므로 프로세스 중에 비판적으로 평가해야 합니다.

모델이 양호한 구성 및 얼굴 타당성을 보여주지만 예측 타당성은 여전히 평가되어야 합니다. BD⁵⁶의 1차 치료제인 만성 리튬 투여는 모델에 의한 행동 변화를 예방하는 데 성공적이어야 합니다. 항정신병 약물 또는 항경련제와 같이 BD에 사용되는 다른 약물에 대한 반응을 조사하여 모델의 예측 타당성을 완전히 테스트할 수 있습니다.

또한, 암컷 동물에 대한 모델 타당성은 향후 연구에서 여전히 평가해야 한다는 현재의 한계가 있습니다. 전임상 연구에 암컷 동물을 포함시키는 추세가 있지만 여전히 무시되는 경우가 많습니다. 제시된 모델의 경우, 도파민 시스템과 발정 주기의 상호 작용이 예상됩니다. 그러나 어느 정도까지 발생할지는 불분명합니다. 또한 정신의학적 동물 모델의 일반적인 한계를 염두에 두는 것이 중요하다. 한 마리의 쥐에서 두 가지 질병과 유사한 에피소드를 모두 유도할 수 있는 가능성은 얼굴 타당성을 증가시키지만, 외부적으로 유도된 변화는 BD 환자에서 질병 에피소드의 자연 발생 및 순환과는 여전히 다릅니다. 이 모델은 전적으로 도파민 시스템의 표적 조작을 기반으로 하기 때문에 주요 효과는 도파민 전달의 변화 및 관련 2차 효과에 의해 발생합니다. 따라서 BD의 증상에 대한 다른 시스템의 기여는 고려되지 않습니다.

결론적으로, 제시된 모델은 두 질병 에피소드 모두 단일 동물에서 연구될 수 있기 때문에 BD를 조사할 수 있는 강력한 잠재력을 가지고 있습니다. 이것은 대부분의 확립된 모델과 비교하여 에피소드 간의 전환을 조사할 수 있는 독특한 가능성을 제시합니다. 제시된 프로토콜은 대부분의 전임상 연구 실험실에서 사용할 수 있는 장비와 기술을 필요로 하므로 널리 적용할 수 있습니다. 지금까지 결과 행동 표현형은 다양한 행동에서 강력했습니다. 사회적 행동⁵⁷ 이나 인지 기능과 같은 다른 영역은 아직 연구되지 않았다. 제시된 프로토콜은 행동 결과에 초점을 맞추었지만 향후 응용 프로그램에서 분자 메커니즘을 더 자세히 조사할 수 있는 다양한 가능성이 있습니다. BD 발병의 기저에 깔린 기전을 이해하기 위한 연구를 확대하는 것, 특히 에피소드 사이의 전이와 관련하여, 궁극적으로 미래의 임상 응용으로 전환될 수 있는 치료 표적의 식별로 이어질 수 있습니다.

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.9 mm burr	FST	19007-09	Burr for craniotomy
10 µl Neuros Syringe	Hamilton	65460-06	Mounted to syringe pump for injection
1ml single use Syringes	Braum	9166017V	Administration of medication
33 G Needles	Hamilton	65461-02	Replacement needles for neuros syringe
4-way valve	UNO	180000259	For simultaneous connection of induction chamber and face mask
Absorbent Drape	Sabanindas	1834014	Covering equipment before placing the animal
Anaesthetic Gas Filter	UNO	180000140	Anesthesia fume collection
Anasthesia mask for stereotactic	Hugo Sachs Electronic	73-4922	Administering anesthesia during surgery
Anesthesia vaporiser	UNO	180000002	Provide and adjust levels of vaporised isoflurane
Bone wax	SMI	Z046	Closing the hole in the skull
Bulldog clamps	FST	18038-45	To retain skin and allow access to the surgical field
Buprenorphine	Elanco	18760711	Interoperative analgesia
Cannula	Tegler	T138339	Administration of medication
Cellulose swabs	Meditrade	1177	Cleaning Skin
Connector	UNO	180000005	Connecting anesthesia tubing to face mask
Control Unit for heating pad	UNO	180000122	Controlling heating pad
Dental Dril	Saeyang	SMT K-38	Dental drill for craniotomy; equipable with fine dental burrs
Desktop digital stereotaxic instrument	RWD	E03135-002	Fully equipped stereotactic frame with digital manipulator
Destilled H2O	-	-	Rinsing the syringe
Doxycycline hyclate	Sigma aldrich	D9891	For model induction
Dry ice	-	-	Transporting viral suspension
Earbars	RWD	68302	Head fixation in the stereotactic frame
Ethanol	-	-	Rinsing the syringe and deactivating virus
Flowmeter	UNO	CM2	Verify and adjust flow rate
Forceps - anatomical	FST	11000-12	Holding skin
Forceps - surgical	FST	11027-12	Holding skin
Heating pad	UNO	180000028	Heating pad for keeping the animal warm during surgery
Induction chamber	UNO	180000233	Chamber for initial induction of anesthesia
Isoflurane	CP Pharma	V7005232.00.00	Anesthesia
Lentiviral suspension	-	-	Lentiviral construct coding for DRD1 or dsRed for model induction
Lidocaine	Combustin	8780701	Local analgesia
Meloxicam	Boehringer Ingelheim	7578423	Pre- and postoperative analgesia
Needle holder	FST	91201-13	Sutering
Oxygen concentrator	UNO	180000399	Providing oxygen for anesthesia
PE Tubing	-	-	Connecting components of the anesthesia machine to induction chamber & face mask
Pencil	-	-	Marking the correct side for craniotomy
Scalpel blade holder	FST	10003-12	To hold scalpel blade
Scapel blades	FST	10011-00	Fine surgical blade for incision
Scavenger Unit	UNO	180000260	Controlling capacity of fume collector
Skin disinfectant	Bode	975042	Disinfacting skin before incision
Sterile cotton swabs	Boettger	1102241	Cleaning surgical field
Sterile eye cream	Bayer	1578675	Protect eyes during surgery
Surgical Scissors	FST	14000-12	Trimming fur and cutting suture material
Suture 3-0 polyglycolic acid	SMI	11201519	Suturing skin
Syringe pump	KdScientific	788130	Syring pump with connectable holder