انتقائية وسمها بروتينات سطح الخلية باستخدام CyDye DIGE ملونات فلور الحد الأدنى

Summary

وقد تجلى هناك طريقة بسيطة ومحددة لوضع العلامات الفلورسنت وتعزيز اكتشاف بروتينات سطح الخلية دون خطوة التجزئة. وتم تحليل وفرة الفرق في البروتينات سطح الخلية باستخدام الكهربائي ثنائي الأبعاد (2 - D) وEttan التكنولوجيا DIGE ™.

Abstract

البروتينات السطحية هي المركزية لقدرة الخلايا على الاستجابة لبيئتها وتتفاعل مع الخلايا المجاورة. ومن المعروف أن تكون محرضات من الإشارات كلها تقريبا داخل الخلايا. وعلاوة على ذلك ، وأنها تلعب دورا هاما في التكيف مع البيئة والعلاج من تعاطي المخدرات ، وغالبا ما تشارك في التسبب بالمرض والباثولوجيا (1). البروتين البروتين التفاعلات الجوهرية لمسارات الإشارات ، وكسب مزيد من التبصر في هذه العمليات البيولوجية المعقدة ، وهناك حاجة إلى طرق حساسة وموثوق بها لدراسة بروتينات سطح الخلية. يستخدم ثنائي الأبعاد (2 - D) الكهربائي على نطاق واسع للكشف عن المؤشرات الحيوية وغيرها من الاهداف في عينات البروتين معقدة لدراسة التغيرات التفاضلية. بروتينات سطح الخلية ، ويرجع ذلك جزئيا إلى تدني وفرة (1 2 ٪ من البروتينات الخلوية) ، التي يصعب كشفها في هلام 2 - D دون تجزئة أو بعض الأنواع الأخرى من تخصيب اليورانيوم. كما انهم غالبا ما تظهر على استحياء في 2 مد المواد الهلامية نظرا لطبيعتها مسعور والوزن الجزيئي عالية (2). في هذه الدراسة ، فإننا نقدم لبروتوكول جديد للخلايا سليمة باستخدام الأصباغ CyDye DIGE فلور الحد الأدنى لوضع العلامات المحددة والكشف عن هذه المجموعة المهمة من البروتينات. أظهرت النتائج العلامات المحددة لعدد كبير من بروتينات سطح الخلية مع الحد الأدنى من العلامات البروتينات داخل الخلايا. هذا البروتوكول هو سريعة ، سهلة الاستعمال ، ويمكن استخدام كل ثلاثة CyDye DIGE الأصباغ فلور الأدنى (قبرصي 2 ، 3 و [سي] [سي] 5) لتسمية سطح الخلية البروتينات. هذه الميزات تسمح لمضاعفة استخدام 2 - D جل الفرق الإسفار الكهربائي (2 - D DIGE) مع التكنولوجيا DIGE Ettan وتحليل التغييرات باستخدام بروتين تعبير DeCyder 2 - D برمجيات التحليل التفاضلي. وأعقب مستوى سطح الخلية بروتينات المصل خلال تجويع الخلايا CHO لفترات مختلفة من الوقت (أنظر الجدول 1). تم الكشف عن تغيرات صغيرة في وفرة مع دقة عالية ، ويتم اعتماد النتائج وفقا لأساليب إحصائية محددة.

Protocol

خلية ثقافة

1. زراعة خلايا المبيض الهامستر الصيني (CHO - K1) باستخدام معيار إجراءات ثقافة خلية في المتوسط ​​هام F - 12 I مع GlutaMAX تحتوي على 10 ٪ الجنين مصل العجل ، 50 U / مل البنسلين ، و 50 ميكروغرام / مل سلفات الستربتوميسين (Invitrogen).
2. تبادل مستنبت لمصل خالية من وسائل الإعلام. وكانت التسمية بروتينات سطح الخلية عند نقاط زمنية مختلفة مع CyDye DIGE فلور Cy3 Cy5 أو الحد الأدنى من الأصباغ (انظر القسم سطح الخلية وصفها أدناه).
3. تجمع أعداد متساوية من الخلايا من كل نقطة زمنية والتسمية مع فلور CyDye Cy2 DIGE. استخدام هذه كمعيار الداخلية لكل هلام 2 - D.
4. لا يمكن أن يؤديها غالبية التجارب مع CHO - K1 الخلايا ، ولكن الخلايا الليفية جنين الفأر (L1 3T3) وسرطان الغدد الليمفاوية lymphoblasts الماوس استسقاء (EL4) يمكن أن تستخدم أيضا (لا تظهر البيانات).
5. زراعة نوعين الخلية الأخيرة في المتوسط ​​مع DMEM GlutaMAX الثاني ، ولكن على خلاف ذلك ، استخدم ظروف مماثلة للخلايا المستخدمة CHO - K1.

سطح الخلية الوسم

1. فصل الخلايا الملتصقة بعناية غير إنزيمي ، والفرز وتقسيمها الى aliquots الخلايا x106 5-10. للخلايا النمو في التعليق ، بحذف فصل الخطوة.
2. الطرد المركزي للتعليق في الخلية حوالي 800 x ج لمدة 5 دقائق. إزالة supernatants تحتوي على المتوسط.
3. غسل الكريات بواسطة resuspendion في الحل 1 مل من الجليد الباردة هانك سولت المتوازن (HBSS) الرقم الهيدروجيني 8.5. طرد 800 XG عند 4 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة.
4. إزالة وطاف resuspend الكرية الخلية في 200 العازلة الجليد الباردة العلامات ميكرولتر (HBSS الحموضة 8.5 ، 1 م اليوريا).
5. تسمية الخلايا سليمة مع 600 بمول الأصباغ CyDye فلور DIGE الحد الأدنى لمدة 20 دقيقة على الجليد في الظلام.
6. إخماد ردة الفعل من خلال إضافة 20 ميكرولتر 10 ملي يسين. احتضان لمدة 10 دقيقة.
7. يغسل سطح الخلايا المسمى إعادة تعليق مرتين من قبل في 500 درجة الحموضة HBSS ميكرولتر 7.4 ، تليها الطرد المركزي في 800 XG عند 4 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة.

تحلل الخلايا والتجزيء

1. ليز سطح الخلايا التي تحمل علامات في 150 ميكرولتر العازلة تحلل الباردة (7 M اليوريا ، 2 M ثيويوريا ، الفصلان 4 ٪ ، 30 ملم تريس ، 5 المغنيسيوم خلات الرقم الهيدروجيني 8.5 ملي مول). يترك على الجليد لمدة لا تقل عن 1 ساعة مع vortexing في بعض الأحيان.
2. أجهزة الطرد المركزي في lysates في XG 000 10 في 4 لمدة 5 دقائق درجة مئوية. طاف لنقل أنبوب جديد. هذا النموذج هو نموذج غير مجزأة تحتوي على جميع البروتينات الخلوية.
3. في موازاة ذلك ، يغسل الكريات الخلية ، على النحو الوارد أعلاه ، ثم يجزئ (باستخدام عدة تجزيء الغشاء ، بيرس) في الغشاء والكسور عصاري خلوي قبل هلام إستشراد 2 - D. كسر غشاء الخلية الداخلية ويحتوي على بروتينات غشاء السطح.
4. للمقارنة ، اتبع الإجراء القياسي DIGE Ettan ³ ، وليز ، والتسمية ، وأخيرا ، يجزئ الخلايا. تحديد تركيز البروتين في عينات باستخدام 2 -- مد كوانت كيت (جنرال الكتريك للرعاية الصحية).

2 - D الكهربائي

1. ترطيب المواد الهلامية DryStrip Immobiline ، ودرجة الحموضة 3 11NL (24 سم) باستخدام علبة Immobiline DryStrip Reswelling ، 24 سم في 450 ميكرولتر DeStreak محلول معالجة الجفاف (0.5 ٪ IPG العازلة) بين عشية وضحاها.
2. تطبيق CyDye المسمى عينات (الموافق 50 ميكروغرام البروتين الكلي) لImmobiline المواد الهلامية DryStrip عن طريق تحميل الكأس انوديك في مشعب وتنفيذ التركيز كهرساوي (IEF) باستخدام نظام Ettan IPGphor IEF الثاني وفقا للتعليمات.
3. بعد IEF ، يوازن الشرائط في خطوتين ومكان على رأس كبير (26 × 20 سم) 12.5 ٪ بولي أكريلاميد المواد الهلامية (SDS - PAGE). تراكب مع agarose 0.5 ٪ (في إدارة العازلة التي تحتوي على bromophenol الزرقاء). تشغيل 2 مد الكهربائي باستخدام Ettan DALTtwelve نظام عمودي كبيرة في 5 واط / هلام لمدة 30 دقيقة ، ثم في 15 واط / هلام حتى تصل الجبهة صبغ الجزء السفلي من هلام.

تصوير وتحليل البيانات

1. بعد إكمال 2 - D الكهربي ، لتفحص المواد الهلامية Cy3 ، أو Cy2 Cy5 باستخدام اعصار 9410 تصوير الوضع المتغير.
2. مقارنة خرائط بقعة من الكسور الغشاء ، الكسور عصاري خلوي ، والعينات غير مجزأة باستخدام DeCyder 2 - D برمجيات التحليل التفاضلي ^4.

بعد التلوين

1. بعد التصوير ، والفضة وصمة عار في المواد الهلامية وفقا للإجراءات القياسية ^5.

تحديد بروتين

1. تنمو ، والحصاد ، وغسل وليز المبالغ التحضيرية (ما يقرب من 1 ملغ من البروتين الكلي 10 خلايا CHO x106) من الخلايا ، كما هو موضح أعلاه للحصول على عينة غير مجزأة. استخدام سطح الخلية Cy5 عينة المسمى (انظر أعلاه) ، وارتفاعا ، وتطبيق جنبا إلى جنب مع كميات لا تحمل علامات التحضيرية للبروتين.
2. تنفيذ الكهربائي 2 - D كما هو موضح أعلاه ، ولكن هذه المرة ، aplly 600 ميكروغرام غير المسماة الخلية lysate جنبا إلى جنب مع 50 ميكروغرام سطح الخلية المسمى ارتفاع الطلب من قبل كوب انوديك. استخدام علامات مرجعية للسماح للاختيار الصحيح المكان ، والمكان يمكن أن يكونتوين لوحات من الزجاج قبل صب جل وفقا لتوصيات ^3.
3. مسح الجل في Cy5 القناة للحصول على سطح الخلية Cy5 خريطة الموقع ، تليها تلطيخ البروتين الكلي العميق باستخدام البروتين الكلي الأرجواني صمة ^3.
4. المباراة معا خرائط المرتبة الثانية باستخدام DeCyder 2 - D البرمجيات وإنشاء قائمة اختيار لجميع البقع المقابلة ل5 قبرصي بروتينات سطح الخلية المسمى. اختيار بروتينات سطح الخلية باستخدام محطة معالجة البقعة Ettan ، مستخرج من المقابس هلام ، وtrypsinate باستخدام هاضم Ettan. تحديد باستخدام - TOF MALDI مطياف الكتلة.

الجدول 1. أجري تجربة DIGE Ettan باستخدام عينات من مصل الخلايا المسمى المنضب وفقا لبروتوكول بروتين سطح الخلية الوسم في الشكل 1.

عينة	زمن نضوب المصل	صفتها مع CyDye	عدد هلام
1	--	قبرصي 3 ، 2 قبرصي	1
2	30 دقيقة	قبرصي 5 ، 2 قبرصي	1
3	2 ساعة	قبرصي 3 ، 2 قبرصي	2
4	4 ساعات	قبرصي 5 ، 2 قبرصي	2
5	16 ساعة	قبرصي 5 ، 2 قبرصي	3

Discussion

تركيز البروتين

ويظهر لمحة عامة عن سير العمل وضع العلامات اثنين في الشكل 1. منذ خلايا لا تزال على حالها عند المسمى وفقا للبروتوكول بروتين سطح الخلية الوسم ، يتعرض فقط سطح الخلية البروتينات إلى صبغ. في بروتوكول قياسي DIGE Ettan ، يتم lysed ا?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
CyDye DIGE Kit, 2 nmol	Reagent	GE Healthcare	28-9345-30
2-D Quant Kit	Reagent	GE Healthcare	80-6484-51
IPG Buffer pH 3-11NL	Reagent	GE Healthcare	17-6004-40
Immobiline DryStrip pH 3-11NL, 24 cm	Reagent	GE Healthcare	17-6003-77
IPGbox	Tool	GE Healthcare	28-9334-65
IPGbox kit	Tool	GE Healthcare	28-9334-92
DeStreak Rehydration solution	Reagent	GE Healthcare	17-6003-19
Immobiline DryStrip Cover Fluid	Reagent	GE Healthcare	17-1335-01
Ettan IPGphor 3 IEF Unit	Instrument	GE Healthcare	11-0033-64
Ettan IPGphor Manifold	Instrument component	GE Healthcare	80-6498-38
Ettan DALTtwelve Gel Caster	Tool	GE Healthcare	80-6467-22
Ettan DALTtwelve Separation Unit and Power Supply/Control Unit	Instrument	GE Healthcare	80-6466-46	230 V unit: 80-6466-27
Typhoon 9410 Variable Mode Imager	Instrument	GE Healthcare	63-0055-81
Ettan Spot Picker	Instrument	GE Healthcare	18-1145-28
Ettan Digester	Instrument	GE Healthcare	18-1142-68
Ettan Spotter	Instrument	GE Healthcare	18-1142-67
Ettan MALDI-TOF	Instrument	GE Healthcare	18-1142-33
DeCyder 2-D Differential Analysis Software	Other	GE Healthcare	28-4012-01
ImageQuant Analysis Software	Other	GE Healthcare	28-9236-62
Urea	Reagent	GE Healthcare	17-1319-01
CHAPS	Reagent	GE Healthcare	17-1314-01
PlusOne Dithiothreitol (DTT)	Reagent	GE Healthcare	17-1318-01
Bromophenol Blue	Reagent	GE Healthcare	17-1329-01
Tris	Reagent	GE Healthcare	17-1321-01
Sodium Dodecylsulfate (SDS)	Reagent	GE Healthcare	17-1313-01
PlusOne Glycerol 87%	Reagent	GE Healthcare	17-1325-01
PlusOne ReadySol IEF 40% T, 3% C	Reagent	GE Healthcare	17-1310-01
PlusOne TEMED	Reagent	GE Healthcare	17-1312-01
PlusOne Ammonium Persulfate	Reagent	GE Healthcare	17-1311-01
PlusOne Glycine	Reagent	GE Healthcare	17-1323-01
2-D Sample Prep for membrane proteins	Reagent	Pierce, Thermo Scientific	89864
Streptomycin sulphate	Reagent	Invitrogen	15140-122