Etiquetado selectiva de las proteínas de la superficie celular con CyDye DIGE Colorantes Fluor mínimo

Resumen

Un método sencillo y específico se ha demostrado para el etiquetado fluorescente y mejorar la detección de las proteínas de la superficie celular sin una etapa de fraccionamiento. Abundancia diferencial de proteínas de superficie celular se analizó mediante electroforesis bidimensional (2-D) y Ettan ™ tecnología DIGE.

Resumen

Proteínas de superficie son esenciales para la capacidad de las células para reaccionar a su entorno e interactuar con las células vecinas. Son conocidos por ser inductores de casi toda la señalización intracelular. Además, juegan un papel importante en la adaptación del medio ambiente y tratamiento de drogas, y están a menudo involucrados en la patogénesis de la enfermedad y la patología (1). Interacciones proteína-proteína son intrínsecos a las vías de señalización, y para obtener mayor conocimiento en estos procesos biológicos complejos, los métodos sensibles y fiables son necesarios para el estudio de las proteínas de la superficie celular. De dos dimensiones (2-D) de electroforesis es ampliamente utilizado para la detección de biomarcadores y otras metas, en las muestras de proteínas complejas para estudiar los cambios diferenciales. Proteínas de superficie celular, en parte debido a su baja abundancia (un 2% de las proteínas celulares), son difíciles de detectar en un gel 2-D sin fraccionamiento o algún otro tipo de enriquecimiento. También están a menudo mal representados en geles 2-D, debido a su naturaleza hidrofóbica y de alto peso molecular (2). En este estudio, se presenta un nuevo protocolo para las células intactas utilizando CyDye DIGE tintes Fluor mínimos para el etiquetado específico y la detección de este importante grupo de proteínas. Los resultados mostraron un etiquetado específico para un gran número de proteínas de superficie celular con un mínimo de etiquetado de las proteínas intracelulares. Este protocolo es rápido, fácil de usar, y los tres CyDye DIGE tintes Fluor mínima (Cy 2, 3 y Cy Cy 5) puede ser utilizada para etiquetar las proteínas de la superficie celular. Estas funciones permiten la multiplexación mediante la electroforesis en 2-D de fluorescencia Gel Diferencia (2-D DIGE) con Ettan tecnología DIGE y el análisis de los cambios de expresión de la proteína usando DeCyder 2-D software de análisis diferencial. El nivel de las proteínas de la superficie celular se siguió durante la privación de suero de las células CHO durante distintos períodos de tiempo (ver Tabla 1). Los pequeños cambios en la abundancia se detectaron con gran precisión, y los resultados se definen con el apoyo de métodos estadísticos.

Protocolo

De cultivo celular

1. Crecer las células de ovario de hámster chino (CHO-K1), utilizando los procedimientos estándar de cultivo celular en medio Ham F-12 con glutamax que contiene 10% de suero fetal bovino, 50 U / ml de penicilina y 50 mg / ml de sulfato de estreptomicina (Invitrogen).
2. Cambio del medio de cultivo a medio libre de suero. Etiqueta de proteínas de la superficie de la célula fueron en diferentes momentos con CyDye DIGE Fluor Cy3 o Cy5 tintes mínima (ver sección de etiquetado de superficie celular, a continuación).
3. Piscina igual número de células a partir de cada punto del tiempo y la etiqueta con CyDye DIGE Fluor Cy2. Use esto como un estándar interno para cada gel 2-D.
4. La mayoría de los experimentos pueden realizarse con células CHO-K1, pero los fibroblastos de embrión de ratón (3T3 L1) y la ascitis del ratón linfoblastos linfoma (EL4) también se puede utilizar (datos no mostrados).
5. Crecen los dos tipos de células en este último medio DMEM con glutamax II, pero, de lo contrario, utilice las mismas condiciones utilizadas para las células CHO-K1.

Células etiquetado superficie

1. Con cuidado, separar las células adherentes no enzimática, a contar y dividir en partes alícuotas de 5.10 x106 células. De las células que crecen en suspensión, omita el paso separando.
2. Se centrifuga la suspensión celular a unos 800 xg durante 5 minutos. Quitar el sobrenadante que contiene el medio.
3. Lavar los pellets por resuspendion en solución salina equilibrada 1 ml de hielo frío de Hank (HBSS) pH 8,5. Centrifugaron a 800 xg a 4 ° C durante 2 minutos.
4. Eliminar el sobrenadante y resuspender el botón celular en 200 buffer etiquetado helada l (HBSS pH 8,5, 1 M urea).
5. Identificar a las células intactas con 600 pmol tintes CyDye DIGE Fluor mínimo durante 20 minutos sobre el hielo en la oscuridad.
6. Detener la reacción añadiendo 20 l 10 mM lisina. Incubar durante 10 minutos.
7. Lave la superficie marcada con células dos veces por resuspensión en 500 l HBSS pH 7,4, seguido por centrifugación a 800 xg a 4 ° C durante 2 minutos.

Lisis celular y fraccionamiento

1. Lisis de la superficie de células marcadas en 150 l buffer de lisis frío (7 M urea, 2 M tiourea, CHAPS 4%, 30 mM Tris, 5 mM de magnesio acetato de pH 8,5). Dejar en hielo durante al menos 1 h con agitación ocasional.
2. Centrifugar los lisados ​​a 10 000 xg a 4 ° C durante 5 minutos. Transferir el sobrenadante a un tubo nuevo. Esta muestra es la muestra no fraccionada que contiene todas las proteínas celulares.
3. Al mismo tiempo, lavar los sedimentos celulares, de arriba, luego fraccionar (con un kit de fraccionamiento de la membrana, Pierce) en la membrana y las fracciones citosólica antes del 2-D electroforesis en gel. La fracción de membrana contiene proteínas de la superficie interna y la membrana celular.
4. Para la comparación, siguen el estándar Ettan procedimiento DIGE ^3, y lisis, la etiqueta y, por último, fraccionar las células. Determinar la concentración de proteínas en las muestras usando el 2 - D Quant Kit (GE Healthcare).

La 2-D

1. Rehidratar geles Immobiline DryStrip, pH 3-11NL (24 cm) con bandeja DryStrip Immobiline Reswelling, 24 cm en 450 l solución de rehidratación DeStreak (0,5% IPG Buffer) durante la noche.
2. Aplicar el CyDye marcado muestras (correspondiente a la proteína 50 mg en total) para Immobiline geles DryStrip por la carga de la taza anódica en el colector y realizar el isoelectroenfoque (IEF) con Ettan IPGphor II Sistema de IEF de acuerdo a las instrucciones.
3. Después de IEF, se equilibran las tiras en dos pasos y el lugar en la parte superior de las grandes (26 x 20 cm) geles de poliacrilamida al 12,5% (SDS-PAGE). Superposición con el 0,5% de agarosa (en el funcionamiento de un tampón que contiene azul de bromofenol). Ejecutar 2-D utilizando Ettan DALTtwelve vertical de Grandes Sistemas de 5 W / gel durante 30 minutos, y luego a los 15 W / gel hasta que el frente tinte llega a la parte inferior del gel.

De imágenes y análisis de datos

1. Después de completar 2-D electroforesis, los geles para la exploración Cy2, Cy3 o Cy5 mediante un tifón 9410 Imager modo variable.
2. Comparar mapas de puntos a partir de fracciones de membrana, las fracciones citosólica, y las muestras no fraccionada con DeCyder 2-D software de análisis diferencial ^4.

Después de la tinción

1. Después de la filmación, la tinción de plata de los geles según el procedimiento estándar de ^5.

La identificación de proteínas

1. Cultivo, la cosecha, lavado y lisis de las cantidades de preparación (aproximadamente 1 mg de proteína total de 10 x106 células CHO) de las células, como se describe más arriba para una muestra no fraccionada. Utilice una muestra de células Cy5 superficie de la etiqueta (ver arriba) como un pico, y aplicar junto con la cantidad de preparación sin etiqueta de proteínas.
2. Llevar a cabo la electroforesis en 2-D como se describió anteriormente, pero esta vez, aplly 600 mg de células sin etiqueta lisado junto con 50 mg de la superficie celular marcado pico anódico por la aplicación de taza. Use marcas de referencia para permitir recoger lugar correcto, y el lugar seentre las placas de vidrio antes de emitir gel de acuerdo con las recomendaciones ^3.
3. Escanear el gel en Cy5 canal para obtener la superficie de la célula Cy5 mapa de puntos, seguido por la tinción de proteínas totales utilizando la proteína total de profundo color púrpura mancha ^3.
4. Partido junto a los dos mapas de puntos con el DeCyder 2-D de software y crear una lista de selección para todos los puntos correspondientes a la Cy 5 etiquetados proteínas de superficie celular. Elija las proteínas de la superficie celular con el lugar Ettan estación de manipulación, extracto de los tapones de gel, y trypsinate con el digestor Ettan. Identificar mediante MALDI-TOF espectrometría de masas.

Tabla 1. Un experimento Ettan DIGE se realizó con muestras de suero de las células agotadas etiquetados de acuerdo con el protocolo de la proteína de la superficie celular de etiquetado en la figura 1.

Muestra	Momento de agotamiento de suero	Etiquetado por CyDye	Gel número
1	-	Cy 3, Cy 2	1
2	30 minutos	Cy 5, Cy 2	1
3	2 horas	Cy 3, Cy 2	2
4	4 horas	Cy 5, Cy 2	2
5	16 horas	Cy 5, Cy 2	3

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Discusión

Concentración de proteínas

Una visión general de los dos flujos de trabajo de etiquetado se muestra en la Figura 1. Dado que las células están intactas cuando una etiqueta según el protocolo de la proteína de la superficie celular de etiquetado, sólo las proteínas de superficie de las células son expuestas a la tintura. En el protocolo estándar Ettan DIGE, las células se lisan antes de su etiquetado y las proteínas dentro como fuera de la célula están etiquetados (Fig. 1). La ca...

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Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
CyDye DIGE Kit, 2 nmol	Reagent	GE Healthcare	28-9345-30
2-D Quant Kit	Reagent	GE Healthcare	80-6484-51
IPG Buffer pH 3-11NL	Reagent	GE Healthcare	17-6004-40
Immobiline DryStrip pH 3-11NL, 24 cm	Reagent	GE Healthcare	17-6003-77
IPGbox	Tool	GE Healthcare	28-9334-65
IPGbox kit	Tool	GE Healthcare	28-9334-92
DeStreak Rehydration solution	Reagent	GE Healthcare	17-6003-19
Immobiline DryStrip Cover Fluid	Reagent	GE Healthcare	17-1335-01
Ettan IPGphor 3 IEF Unit	Instrument	GE Healthcare	11-0033-64
Ettan IPGphor Manifold	Instrument component	GE Healthcare	80-6498-38
Ettan DALTtwelve Gel Caster	Tool	GE Healthcare	80-6467-22
Ettan DALTtwelve Separation Unit and Power Supply/Control Unit	Instrument	GE Healthcare	80-6466-46	230 V unit: 80-6466-27
Typhoon 9410 Variable Mode Imager	Instrument	GE Healthcare	63-0055-81
Ettan Spot Picker	Instrument	GE Healthcare	18-1145-28
Ettan Digester	Instrument	GE Healthcare	18-1142-68
Ettan Spotter	Instrument	GE Healthcare	18-1142-67
Ettan MALDI-TOF	Instrument	GE Healthcare	18-1142-33
DeCyder 2-D Differential Analysis Software	Other	GE Healthcare	28-4012-01
ImageQuant Analysis Software	Other	GE Healthcare	28-9236-62
Urea	Reagent	GE Healthcare	17-1319-01
CHAPS	Reagent	GE Healthcare	17-1314-01
PlusOne Dithiothreitol (DTT)	Reagent	GE Healthcare	17-1318-01
Bromophenol Blue	Reagent	GE Healthcare	17-1329-01
Tris	Reagent	GE Healthcare	17-1321-01
Sodium Dodecylsulfate (SDS)	Reagent	GE Healthcare	17-1313-01
PlusOne Glycerol 87%	Reagent	GE Healthcare	17-1325-01
PlusOne ReadySol IEF 40% T, 3% C	Reagent	GE Healthcare	17-1310-01
PlusOne TEMED	Reagent	GE Healthcare	17-1312-01
PlusOne Ammonium Persulfate	Reagent	GE Healthcare	17-1311-01
PlusOne Glycine	Reagent	GE Healthcare	17-1323-01
2-D Sample Prep for membrane proteins	Reagent	Pierce, Thermo Scientific	89864
Streptomycin sulphate	Reagent	Invitrogen	15140-122