Селективный маркировки на поверхности клеток белков, используя CyDye ПГЛП Fluor Минимальная Красители

Резюме

Простой и конкретный метод был продемонстрирован для флуоресцентной маркировки и усовершенствованные функции обнаружения белков клеточной поверхности, без фракционирования шаг. Дифференциальная обилие белков клеточной поверхности, были проанализированы с использованием двумерных (2-D), электрофорез и Ettan ™ ПГЛП технологии.

Аннотация

Поверхностные белки играют центральную роль в способности клеток к реагируют на окружающую среду и взаимодействие с соседними клетками. Они, как известно, индукторы практически всех внутриклеточных сигнальных. Более того, они играют важную роль в экологической адаптации и лечения наркозависимости, и часто участвует в патогенезе заболевания и патологии (1). Белок-белковые взаимодействия присущи сигнальных путей, а также получить более глубокое в этих сложных биологических процессов, чувствительных и надежных методов, необходимых для изучения белков клеточной поверхности. Двумерные (2-D) электрофореза широко используется для обнаружения биомаркеров и другие цели в сложных образцов белков изучать дифференциальные изменения. Сотовые поверхностных белков, частично из-за их низкой численности (1 2% клеточных белков), которые трудно обнаружить в 2-D гель без фракционирования или какой-либо другой тип обогащения. Они также часто слабо представлены в 2-D гелями из-за их гидрофобной природы и высокой молекулярной массой (2). В этом исследовании мы представляем новый протокол для нетронутыми клетки, используя CyDye ПГЛП Fluor минимальным красители для конкретной маркировки и обнаружения этой важной группы белков. Результаты показали, конкретных маркировки большого количества белков клеточной поверхности с минимальной маркировки внутриклеточных белков. Этот протокол является быстрым, простым в использовании, и все три CyDye ПГЛП Fluor минимальным красителей (Су 2, 3 и Су Су 5) может быть использован для обозначения на поверхности клеток белков. Эти функции позволяют мультиплексирования использованием 2-D флуоресцентный гель-электрофореза Разница (2-D ПГЛП) с Ettan ПГЛП технологии и анализ экспрессии белка изменения с помощью DeCyder 2-D Дифференциальный анализ программного обеспечения. Уровень поверхности клеток белков последовало во время сыворотке голодание клеток СНО для различных периодов времени (см. Таблицу 1). Небольшие изменения в изобилии были обнаружены с высокой точностью, и результаты поддерживаются определены статистические методы.

протокол

Клеточные культуры

1. Рост китайского хомячка яичников клеток (СНО-К1) с использованием стандартных процедур культур клеток, в F-12 Хэм среде с GlutaMAX Я, содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки, 50 ед / мл пенициллина, 50 мкг / мл стрептомицина сульфат (Invitrogen).
2. Биржа питательной среды для бессывороточной СМИ. Этикетка белков клеточной поверхности, были в различные моменты времени с CyDye ПГЛП Fluor Cy3 или Cy5 минимальным красителей (см. раздел клеточной поверхности, маркировки, ниже).
3. Бассейн равное количество клеток из каждой точки времени и этикетка с CyDye ПГЛП Fluor Су2. Используйте их в качестве внутреннего стандарта для каждого 2-D геле.
4. Большинство экспериментов могут быть выполнены с СНО-К1 клетки, но мышиных эмбриональных фибробластов (3T3 L1) и мышь асцит лимфомы лимфобластов (EL4) также может использоваться (данные не приведены).
5. Рост последних двух типов клеток в DMEM среде с GlutaMAX II, но, в противном случае используйте одинаковые условия для CHO-K1 клеток.

Маркировки на поверхности клетки

1. Аккуратно отделить прилипшие клетки неферментативно, подсчета и деления на аликвоты 5-10 x106 клеток. Для клеток, растущих в виде суспензии, опустите отсоединения шаг.
2. Центрифуга клеточные суспензии около 800 мкг в течение 5 минут. Удалить надосадочную жидкость содержащие среды.
3. Вымойте окатышей resuspendion в Сбалансированный Соль 1 мл ледяной Хэнка Решение (HBSS) рН 8,5. Центрифугировали при 800 мкг при 4 ° С в течение 2 минут.
4. Удалить супернатант и ресуспендируют осадок клеток в 200 мкл буфера ледяной маркировки (HBSS рН 8,5, 1 М мочевина).
5. Этикетка неповрежденных клетках с 600 пмоль CyDye ПГЛП Fluor минимальным красителей в течение 20 минут на льду в темноте.
6. Quench реакцию добавлением 20 мкл 10 мМ лизина. Инкубируйте в течение 10 минут.
7. Вымойте поверхность-меченых клеток дважды ресуспендирования в 500 мкл HBSS рН 7,4, с последующим центрифугированием при 800 мкг при 4 ° С в течение 2 минут.

Лизису клеток и фракционирования

1. Lyse поверхностно-меченых клеток в 150 мкл холодного буфера для лизиса (7 М мочевины, 2 М тиомочевины, 4% CHAPS, 30 мМ Трис, 5 мМ ацетат магния рН 8,5). Оставьте на льду в течение не менее 1 ч с редкими вортексе.
2. Центрифуга лизатов при 10 000 мкг при 4 ° С в течение 5 минут. Передача супернатант в новую пробирку. Этот образец не-фракционированного образца, содержащего всех клеточных белков.
3. Параллельно с этим, мыть ячейки гранул, как и выше, то фракционирования (при использовании комплекта мембраны фракционирования, Пирс) в мембране и цитоплазме фракций до 2-D электрофореза геля. Мембранной фракции содержит внутренние и клеточных поверхностных белков мембран.
4. Для сравнения, следуйте стандартной процедуре Ettan ПГЛП ³ и лизировать, этикетки, и, наконец, фракционирования клеток. Определить концентрацию белка в образцах с помощью 2 - D Квант Kit (GE Healthcare).

2-D электрофореза

1. Увлажняет Immobiline DryStrip гели, рН 3-11NL (24 см) с использованием Immobiline DryStrip Reswelling лоток, 24 см в 450 мкл раствора Регидратация DeStreak (0,5% IPG буфера) в течение ночи.
2. Применить CyDye меченные образцы (соответствует 50 мкг общего белка), чтобы Immobiline DryStrip гелей анодной загрузки кубок в многообразии и выполнять изоэлектрофокусировки (МЭФ), используя Ettan IPGphor II МЭФ системы в соответствии с инструкциями.
3. После МЭФ, равновесие полосы в два этапа и место на вершине большой (26 х 20 см) 12,5% полиакриламидном геле (SDS-PAGE). Наложение с 0,5% агарозы (в беге буфер, содержащий бромфенола синий). Выполнить 2-D электрофореза использованием Ettan DALTtwelve Большие вертикальные системы на 5 Вт / геля в течение 30 минут, а затем на 15 Вт / гель, пока краситель фронт достигнет нижней части геля.

Изображений и анализа данных

1. После завершения 2-D электрофореза, сканирования гелей для Су2, Cy3 или Cy5 использованием Тайфун 9410 Переменная Imager режиме.
2. Сравните месте карты из мембранных фракций, цитозольного фракций, а не-фракционированного образцов с использованием DeCyder 2-D Дифференциальный анализ программного обеспечения ^4.

После окрашивания

1. После обработки изображений, серебряные пятна гели согласно стандартной процедуре ^5.

Белки идентификации

1. Расти, урожай, мойки и лизировать препаративных количествах (примерно 1 мг общего белка от 10 x106 клетки СНО) клеток, как описано выше для не-фракционированного образца. Используйте Cy5 поверхности клетки помечены образца (см. выше), шип, а также применять вместе с немеченого препаративных количествах белка.
2. Проведение 2-D электрофореза, как описано выше, но на этот раз, aplly 600 мкг немеченого Клеточный лизат вместе с 50 мкг поверхности клетки помечены шип с применением анодного чашку. Используйте ссылки маркеров, чтобы правильный выбор места, и место бытьмежду стеклянными пластинами, прежде чем гель литья в соответствии с рекомендациями ^3.
3. Сканирование геля в Cy5 канала для получения Cy5 поверхности клетки месте карты, после чего общая окраска белка использованием Deep Purple белка общего пятно ^3.
4. Матч вместе второе место карты, используя DeCyder 2-D программное обеспечение и создать список выбора для всех пятен, соответствующих Cy 5 меченых белков клеточной поверхности. Pick поверхности клеток белков, используя обработку Ettan месте станции, выписка из геля пробок и trypsinate использованием реактора Ettan. Определить использованием MALDI-TOF масс-спектрометрии.

Таблица 1. Эксперимент Ettan ПГЛП проводилось с использованием образцов сыворотки обедненного клетки помечены в соответствии с поверхности клеток белков маркировки протокола на рисунке 1.

Образец	Время сыворотке истощения	Маркируется CyDye	Гель номер
1	-	Cy 3, Cy 2	1
2	30 минут	Cy 5, Су 2	1
3	2-х часов	Cy 3, Cy 2	2
4	4 часа	Cy 5, Су 2	2
5	16 часов	Cy 5, Су 2	3

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Концентрация белка

Обзор двух рабочих процессов маркировки показан на рисунке 1. Поскольку клетки остаются нетронутыми, когда маркированный в соответствии со клеточной поверхности протокол маркировки белка, только белки клеточной поверхности, подвержены красителя. В с...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
CyDye DIGE Kit, 2 nmol	Reagent	GE Healthcare	28-9345-30
2-D Quant Kit	Reagent	GE Healthcare	80-6484-51
IPG Buffer pH 3-11NL	Reagent	GE Healthcare	17-6004-40
Immobiline DryStrip pH 3-11NL, 24 cm	Reagent	GE Healthcare	17-6003-77
IPGbox	Tool	GE Healthcare	28-9334-65
IPGbox kit	Tool	GE Healthcare	28-9334-92
DeStreak Rehydration solution	Reagent	GE Healthcare	17-6003-19
Immobiline DryStrip Cover Fluid	Reagent	GE Healthcare	17-1335-01
Ettan IPGphor 3 IEF Unit	Instrument	GE Healthcare	11-0033-64
Ettan IPGphor Manifold	Instrument component	GE Healthcare	80-6498-38
Ettan DALTtwelve Gel Caster	Tool	GE Healthcare	80-6467-22
Ettan DALTtwelve Separation Unit and Power Supply/Control Unit	Instrument	GE Healthcare	80-6466-46	230 V unit: 80-6466-27
Typhoon 9410 Variable Mode Imager	Instrument	GE Healthcare	63-0055-81
Ettan Spot Picker	Instrument	GE Healthcare	18-1145-28
Ettan Digester	Instrument	GE Healthcare	18-1142-68
Ettan Spotter	Instrument	GE Healthcare	18-1142-67
Ettan MALDI-TOF	Instrument	GE Healthcare	18-1142-33
DeCyder 2-D Differential Analysis Software	Other	GE Healthcare	28-4012-01
ImageQuant Analysis Software	Other	GE Healthcare	28-9236-62
Urea	Reagent	GE Healthcare	17-1319-01
CHAPS	Reagent	GE Healthcare	17-1314-01
PlusOne Dithiothreitol (DTT)	Reagent	GE Healthcare	17-1318-01
Bromophenol Blue	Reagent	GE Healthcare	17-1329-01
Tris	Reagent	GE Healthcare	17-1321-01
Sodium Dodecylsulfate (SDS)	Reagent	GE Healthcare	17-1313-01
PlusOne Glycerol 87%	Reagent	GE Healthcare	17-1325-01
PlusOne ReadySol IEF 40% T, 3% C	Reagent	GE Healthcare	17-1310-01
PlusOne TEMED	Reagent	GE Healthcare	17-1312-01
PlusOne Ammonium Persulfate	Reagent	GE Healthcare	17-1311-01
PlusOne Glycine	Reagent	GE Healthcare	17-1323-01
2-D Sample Prep for membrane proteins	Reagent	Pierce, Thermo Scientific	89864
Streptomycin sulphate	Reagent	Invitrogen	15140-122