使用CyDye DIGE Fluor公司最小染料的细胞表面蛋白的选择性标签

摘要

一个简单的和具体的方法是没有分馏步骤细胞表面蛋白的荧光标记和增强检测证明。差分在细胞表面的蛋白质丰度使用的二维（2 - D）电泳和Ettan™DIGE技术进行了分析。

摘要

表面蛋白是细胞的反应能力，它的环境，与邻近的细胞相互作用的核心。它们是已知的几乎所有的细胞内信号诱导。此外，他们在环境适应和药物治疗发挥重要作用，而且往往在疾病的发病机制和病理（1）参与。蛋白质 - 蛋白质相互作用的内在信号通路，并获得更深入地了解这些复杂的生物过程，需要敏感和可靠的方法是研究细胞表面的蛋白质。二维电泳（2 - D）是广泛用于复杂的蛋白质样品中的生物标志物和其他目标的检测，研究差的变化。细胞表面蛋白，部分原因是由于他们的低丰度（1 2％的细胞蛋白），是很难检测到，没有分馏或一些其他类型的浓缩在一个2 - D凝胶。他们也往往不佳的2 - D凝胶，由于其疏水性和超高分子量（2）表示。在这项研究中，我们提出一个新的协议为使用这种蛋白质的重要​​的一组特定的标签和检测CyDye DIGE Fluor公司最小的染料的完整细胞。结果表明：大量的细胞表面蛋白与细胞内蛋白质的最小标签的具体标注。此协议是快速，简单易用，所有三个CyDye DIGE Fluor公司（赛扬2，赛扬3和CY 5）最小的染料，可用于标记细胞表面蛋白。这些特性允许复用的2 - D荧光差异凝胶电泳（2 - D DIGE）Ettan DIGE技术和使用DeCyder的2 - D差异分析软件蛋白表达变化的分析。随后在CHO细胞中不同的时间长度（见表1）血清饥饿的细胞表面蛋白的水平。丰富的小变化，具有精度高，检测结果是由定义的统计方法的支持。

研究方案

细胞培养

1. 种植中国仓鼠卵巢细胞（CHO - K1）使用标准细胞培养过程中的F - 12火腿中含10％小牛血清，50 U / ml青霉素，50μg/ ml的硫酸链霉素（Invitrogen公司）与GlutaMAX我。
2. 交易所培养基，无血清培养基。标签的细胞表面蛋白CyDye DIGE Fluor公司Cy3标记或Cy5最小的染料（见部分细胞表面标记 ，下面）在不同的时间点。
3. 从各时间点和CyDye DIGE Fluor公司CY2标签细胞的数目相等的池。使用这些内部标准为每一个2 - D凝胶。
4. CHO - K1细胞进行的实验都可以，但小鼠胚胎成纤维细胞（3T3 L1）和小鼠腹水淋巴瘤淋巴母细胞（EL4）也可以使用（数据未显示）。
5. 成长与GlutaMAX第二DMEM培养基中的两个后一种类型的细胞，但是，否则，使用相同的条件下使用的CHO - K1细胞。

细胞表面的标签

1. 仔细非酶解，分离贴壁细胞计数和到5-10 x106细胞等份划分。对于悬浮液中生长的细胞，省略了分离步骤。
2. 离心5分钟，约800 XG的细胞悬液。含介质取出上清液。
3. 1毫升冰冷的Hanks平衡盐溶液（HBSS）pH值8.5 resuspendion洗净颗粒。离心800 XG在4 ° C时2分钟。
4. 去除上清，悬浮细胞沉淀（pH值8....

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讨论

蛋白质浓度

概述两个标签工作流程如图1所示。根据细胞表面蛋白标签协议标记时，由于细胞仍然完好，只在细胞表面的蛋白质暴露的染料。在标准Ettan DIGE协议，细胞裂解之前，标签和内以及在细胞外的蛋白质标记（图1）。染料相对量的蛋白质在细胞表面的蛋白标记协议是不知道，因为细胞表面蛋白无法具体定量分析。然而，它是已知的细胞表面蛋白²细胞蛋白构成的?.......

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材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
CyDye DIGE Kit, 2 nmol	Reagent	GE Healthcare	28-9345-30
2-D Quant Kit	Reagent	GE Healthcare	80-6484-51
IPG Buffer pH 3-11NL	Reagent	GE Healthcare	17-6004-40
Immobiline DryStrip pH 3-11NL, 24 cm	Reagent	GE Healthcare	17-6003-77
IPGbox	Tool	GE Healthcare	28-9334-65
IPGbox kit	Tool	GE Healthcare	28-9334-92
DeStreak Rehydration solution	Reagent	GE Healthcare	17-6003-19
Immobiline DryStrip Cover Fluid	Reagent	GE Healthcare	17-1335-01
Ettan IPGphor 3 IEF Unit	Instrument	GE Healthcare	11-0033-64
Ettan IPGphor Manifold	Instrument component	GE Healthcare	80-6498-38
Ettan DALTtwelve Gel Caster	Tool	GE Healthcare	80-6467-22
Ettan DALTtwelve Separation Unit and Power Supply/Control Unit	Instrument	GE Healthcare	80-6466-46	230 V unit: 80-6466-27
Typhoon 9410 Variable Mode Imager	Instrument	GE Healthcare	63-0055-81
Ettan Spot Picker	Instrument	GE Healthcare	18-1145-28
Ettan Digester	Instrument	GE Healthcare	18-1142-68
Ettan Spotter	Instrument	GE Healthcare	18-1142-67
Ettan MALDI-TOF	Instrument	GE Healthcare	18-1142-33
DeCyder 2-D Differential Analysis Software	Other	GE Healthcare	28-4012-01
ImageQuant Analysis Software	Other	GE Healthcare	28-9236-62
Urea	Reagent	GE Healthcare	17-1319-01
CHAPS	Reagent	GE Healthcare	17-1314-01
PlusOne Dithiothreitol (DTT)	Reagent	GE Healthcare	17-1318-01
Bromophenol Blue	Reagent	GE Healthcare	17-1329-01
Tris	Reagent	GE Healthcare	17-1321-01
Sodium Dodecylsulfate (SDS)	Reagent	GE Healthcare	17-1313-01
PlusOne Glycerol 87%	Reagent	GE Healthcare	17-1325-01
PlusOne ReadySol IEF 40% T, 3% C	Reagent	GE Healthcare	17-1310-01
PlusOne TEMED	Reagent	GE Healthcare	17-1312-01
PlusOne Ammonium Persulfate	Reagent	GE Healthcare	17-1311-01
PlusOne Glycine	Reagent	GE Healthcare	17-1323-01
2-D Sample Prep for membrane proteins	Reagent	Pierce, Thermo Scientific	89864
Streptomycin sulphate	Reagent	Invitrogen	15140-122