Selektive Markierung von Zelloberflächen-Proteinen unter Verwendung von CyDye DIGE Fluor Minimal Farbstoffe

Zusammenfassung

Eine einfache und spezifische Methode wurde für Fluoreszenzmarkierung und verbesserte Erkennung von Zelloberflächen-Proteine ​​ohne Fraktionierung Schritt demonstriert. Differential Fülle in Zelloberflächenproteine ​​wurde mittels zweidimensionaler (2-D)-Elektrophorese und Ettan ™ DIGE Technologie.

Zusammenfassung

Oberflächen-Proteine ​​sind von zentraler Bedeutung für die Fähigkeit der Zelle auf ihre Umwelt reagieren und mit den benachbarten Zellen zu interagieren. Sie sind dafür bekannt, Induktoren von fast allen intrazelluläre Signalwege werden. Darüber hinaus spielen sie eine wichtige Rolle im Umweltschutz Anpassung und medikamentöse Behandlung, und sind oft in der Krankheitsentstehung und die Pathologie (1) beteiligt. Protein-Protein-Wechselwirkungen sind untrennbar mit Signalwegen, und einen tieferen Einblick in diese komplexe biologische Prozesse zu gewinnen, sind empfindlicher und zuverlässiger Methoden zur Untersuchung von Zelloberflächen-Proteine ​​benötigt werden. Zweidimensionale (2-D)-Elektrophorese wird weitgehend für den Nachweis von Biomarkern und anderen Zielen in komplexen Protein-Proben, um differentielle Änderungen Studie verwendet. Zelloberflächenproteine, teils wegen ihrer geringen Menge (1 2% der zellulären Proteine) sind schwierig, in einem 2-D Gel ohne Fraktionierung oder eine andere Art der Bereicherung zu erkennen. Sie sind auch oft schlecht in 2-D Gelen aufgrund ihrer hydrophoben Natur und mit hohem Molekulargewicht (2) vertreten. In dieser Studie präsentieren wir ein neues Protokoll für intakte Zellen mit CyDye DIGE Fluor minimal Farbstoffe zur spezifischen Markierung und Erkennung von dieser wichtigen Gruppe von Proteinen. Die Ergebnisse zeigten, spezifische Markierung von einer großen Anzahl von Zelloberflächen-Proteine ​​mit minimalen Kennzeichnung von intrazellulären Proteinen. Dieses Protokoll ist eine schnelle, einfach zu bedienen, und alle drei CyDye DIGE Fluor minimal Farbstoffen (Cy 2, Cy 3 und Cy 5) kann verwendet werden, um Zelloberflächen-Proteine ​​zu markieren. Diese Funktionen ermöglichen zum Multiplexen mit der 2-D-Fluoreszenz Difference Gel-Elektrophorese (2-D DIGE) mit Ettan DIGE Technologie und Analyse der Proteinexpression Änderungen mit DeCyder 2-D Differential Analysis Software. Die Höhe der Zelloberfläche Proteine ​​wurde während Serumentzug von CHO-Zellen für verschiedene Zeitspannen (siehe Tabelle 1). Kleine Veränderungen in Hülle und Fülle wurden mit hoher Genauigkeit erfasst und die Ergebnisse sind definiert durch statistische Methoden unterstützt.

Protokoll

Zellkultur

1. Wachsen Ovarialzellen des chinesischen Hamsters (CHO-K1) mit Standard-Zellkultur Verfahren in F-12 Ham Medium mit Glutamax I mit 10% fötalem Kälberserum, 50 U / ml Penicillin und 50 ug / ml Streptomycin-Sulfat (Invitrogen).
2. Austausch des Kulturmediums auf serum-freien Medien. Beschriften Sie die Zelloberfläche Proteine ​​wurden zu verschiedenen Zeitpunkten mit CyDye DIGE Fluor Cy3 oder Cy5 minimal Farbstoffe (siehe Abschnitt Cell Surface Labeling, unten).
3. Pool gleiche Anzahl von Zellen, die aus jedem Zeitpunkt und Etikett mit CyDye DIGE Fluor Cy2. Verwenden Sie diese als interner Standard für die einzelnen 2-D-Gel.
4. Die Mehrzahl der Experimente lassen sich mit CHO-K1-Zellen durchgeführt werden, sondern Maus-Embryo-Fibroblasten (3T3 L1) und Maus-Aszites-Lymphom Lymphoblasten (EL4) können ebenfalls verwendet werden (Daten nicht gezeigt).
5. Wachsen die beiden letzteren Zelltypen in DMEM-Medium mit Glutamax II, aber sonst identische Bedingungen für die CHO-K1-Zellen verwendet.

Zelloberfläche Kennzeichnung

1. Vorsichtig lösen adhärente Zellen nicht-enzymatisch, Zählung und Einteilung in Aliquots von 5-10 x106 Zellen. Für in Suspension wachsenden Zellen, lassen die Ablösung Schritt.
2. Centrifuge die Zellsuspensionen bei etwa 800 xg für 5 Minuten. Entfernen Sie die Überstände mit dem Medium.
3. Waschen Sie die Pellets durch resuspendion in Balanced Salt 1 ml eiskalter Hanks Solution (HBSS) pH 8,5. Zentrifugiert bei 800 xg bei 4 ° C für 2 Minuten.
4. Entfernen Sie den Überstand und Zellpellet in 200 ul eiskaltem Kennzeichnung Puffer (HBSS pH 8,5, 1 M Harnstoff).
5. Beschriften Sie die intakten Zellen mit 600 pmol CyDye DIGE Fluor minimal Farbstoffe für 20 Minuten auf Eis im Dunkeln.
6. Die Reaktion wird durch Zugabe von 20 ul 10 mM Lysin. Inkubieren für 10 Minuten.
7. Waschen Sie die Oberfläche-markierten Zellen zweimal durch Resuspension in 500 ul HBSS pH 7,4, durch Zentrifugation bei 800 xg bei 4 ° C für 2 Minuten.

Zelllyse und Fraktionierung

1. Lyse der Oberfläche-markierten Zellen in 150 ul kaltem Lysepuffer (7 M Harnstoff, 2 M Thioharnstoff, 4% CHAPS, 30 mM Tris, 5 mM Magnesium-Acetat pH 8,5). Lassen Sie auf dem Eis für mindestens 1 h mit gelegentlichen Vortexen.
2. Centrifuge die Lysate bei 10 000 xg bei 4 ° C für 5 Minuten. Übertragen Sie den Überstand in ein neues Röhrchen. Dieses Beispiel ist die nicht-fraktionierten Probe mit allen zellulären Proteinen.
3. In parallel, waschen Zellpellets, wie oben, dann fraktionieren (unter Verwendung einer Membran-Fraktionierung Kit, Pierce) in Membran-und zytosolischen Fraktionen vor 2-D-Gelelektrophorese. Die Membranfraktion enthält interne und Zelloberfläche Membranproteinen.
4. Zum Vergleich, folgen Sie den Standard-Ettan DIGE Verfahren ³ und lysieren, label, und schließlich Fraktionierung der Zellen. Bestimmen Sie die Protein-Konzentration in den Proben mit den 2 - D Quant Kit (GE Healthcare).

2-D Elektrophorese

1. Rehydrieren Immobiline DryStrip Gele, pH 3-11NL (24 cm) mit Immobiline DryStrip Reswelling Tablett, 24 cm in 450 ul Strichen Rehydration-Lösung (0,5% IPG-Puffer) über Nacht.
2. Übernehmen Sie die CyDye-markierten Proben (entsprechend 50 ug Gesamt-Protein), um DryStrip Gele durch anodische cup loading in die vielfältigen Immobiline und führen isoelektrische Fokussierung (IEF) mit Ettan IPGphor II IEF-System gemäß den Anweisungen.
3. Nach IEF, bringen die Streifen in zwei Schritten und Platz auf der großen (26 x 20 cm) 12,5% igen Polyacrylamidgelen (SDS-PAGE). Overlay mit 0,5% Agarose (in Laufpuffer mit Bromphenolblau). Run 2-D Elektrophorese mit Ettan DALTtwelve Large Vertical-System mit 5 W / Gel für 30 min und dann bei 15 W / Gel bis der Farbstoff vor Erreichen der Unterseite des Gels.

Imaging und Datenanalyse

1. Nach Abschluss 2-D-Elektrophorese, scannen Sie die Gele für Cy2, Cy3 oder Cy5 mit einem Typhoon 9410 Variable Modus Imager.
2. Vergleichen Sie vor Ort Karten von Membranfraktionen, cytosolischen Fraktionen, und nicht-fraktionierten Proben mit DeCyder 2-D Differential Analysis Software ^4.

Post-Färbung

1. Nach der Bebilderung Silberfärbung der Gele nach Standardverfahren ^5.

Protein Identifikation

1. Anbauen, ernten, waschen und zu lysieren präparativen Mengen (etwa 1 mg Gesamt-Protein von 10 x106 CHO-Zellen) von Zellen, wie oben für eine nicht-fraktionierten Probe beschrieben. Verwenden Sie ein Cy5 Zelloberfläche markierten Probe (siehe oben) als Spitze und gelten zusammen mit dem unmarkierten präparative Mengen an Protein.
2. Führen Sie 2-D-Elektrophorese, wie oben beschrieben, aber dieses Mal, aplly 600 ug unmarkierte Zellen zusammen Lysat mit 50 ug Zelloberfläche gekennzeichnet Spike durch anodische cup Anwendung. Verwenden Sie Referenzmarken zu richtigen Stelle Kommissionierung zu ermöglichen, und legen Sie werdenzwischen den Glasplatten vor Gelgießen nach Empfehlungen ^3.
3. Scannen Sie das Gel in Cy5 Kanal zum Cy5 Zelloberfläche Spotkarten von insgesamt Proteinanfärbung mit Deep purple Gesamtprotein Fleck ^3, gefolgt erhalten.
4. Spiel zusammen die beiden vor Ort Karten mit dem DeCyder 2-D-Software und erstellen Sie eine Auswahlliste für alle Flecken entsprechend der Cy 5 beschriftet Zelloberflächenproteine. Wählen Zelloberflächenproteine ​​mit dem Ettan Ort Handling-Station, aus dem Gel-Stecker herausziehen und abtrypsinieren mit dem Ettan digester. Identifizieren mittels MALDI-TOF-Massenspektrometrie.

Tabelle 1. Ein Ettan DIGE Experiment wurde durchgeführt unter Verwendung von Proben aus dem Serum verbraucht Zellen markiert nach der Zelloberfläche Proteinmarkierung Protokoll in Abb. 1 dargestellt.

Probe	Die Zeit des Serum-Depletion	Labelled mit CyDye	Gel-Nummer
1	-	Cy 3, Cy 2	1
2	30 Minuten	Cy 5, Cy 2	1
3	2 Stunden	Cy 3, Cy 2	2
4	4 Stunden	Cy 5, Cy 2	2
5	16 Stunden	Cy 5, Cy 2	3

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Diskussion

Protein-Konzentration

Eine Übersicht über die beiden Kennzeichnung Workflows ist in Abbildung 1 dargestellt. Da die Zellen noch intakt sind, wenn sie gemäß der Zelloberfläche Proteinmarkierung Protokoll bezeichnet, werden nur die Zelloberflächenproteine, um den Farbstoff ausgesetzt. In der Standard-Ettan DIGE-Protokoll werden die Zellen lysiert vor der Etikettierung und Proteinen sowohl innerhalb als auch außerhalb der Zelle gekennzeichnet sind (Abb. 1). Die relative Menge des Farbstoff...

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Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
CyDye DIGE Kit, 2 nmol	Reagent	GE Healthcare	28-9345-30
2-D Quant Kit	Reagent	GE Healthcare	80-6484-51
IPG Buffer pH 3-11NL	Reagent	GE Healthcare	17-6004-40
Immobiline DryStrip pH 3-11NL, 24 cm	Reagent	GE Healthcare	17-6003-77
IPGbox	Tool	GE Healthcare	28-9334-65
IPGbox kit	Tool	GE Healthcare	28-9334-92
DeStreak Rehydration solution	Reagent	GE Healthcare	17-6003-19
Immobiline DryStrip Cover Fluid	Reagent	GE Healthcare	17-1335-01
Ettan IPGphor 3 IEF Unit	Instrument	GE Healthcare	11-0033-64
Ettan IPGphor Manifold	Instrument component	GE Healthcare	80-6498-38
Ettan DALTtwelve Gel Caster	Tool	GE Healthcare	80-6467-22
Ettan DALTtwelve Separation Unit and Power Supply/Control Unit	Instrument	GE Healthcare	80-6466-46	230 V unit: 80-6466-27
Typhoon 9410 Variable Mode Imager	Instrument	GE Healthcare	63-0055-81
Ettan Spot Picker	Instrument	GE Healthcare	18-1145-28
Ettan Digester	Instrument	GE Healthcare	18-1142-68
Ettan Spotter	Instrument	GE Healthcare	18-1142-67
Ettan MALDI-TOF	Instrument	GE Healthcare	18-1142-33
DeCyder 2-D Differential Analysis Software	Other	GE Healthcare	28-4012-01
ImageQuant Analysis Software	Other	GE Healthcare	28-9236-62
Urea	Reagent	GE Healthcare	17-1319-01
CHAPS	Reagent	GE Healthcare	17-1314-01
PlusOne Dithiothreitol (DTT)	Reagent	GE Healthcare	17-1318-01
Bromophenol Blue	Reagent	GE Healthcare	17-1329-01
Tris	Reagent	GE Healthcare	17-1321-01
Sodium Dodecylsulfate (SDS)	Reagent	GE Healthcare	17-1313-01
PlusOne Glycerol 87%	Reagent	GE Healthcare	17-1325-01
PlusOne ReadySol IEF 40% T, 3% C	Reagent	GE Healthcare	17-1310-01
PlusOne TEMED	Reagent	GE Healthcare	17-1312-01
PlusOne Ammonium Persulfate	Reagent	GE Healthcare	17-1311-01
PlusOne Glycine	Reagent	GE Healthcare	17-1323-01
2-D Sample Prep for membrane proteins	Reagent	Pierce, Thermo Scientific	89864
Streptomycin sulphate	Reagent	Invitrogen	15140-122