Étiquetage sélective des protéines de surface cellulaire utilisant CyDye DIGE Fluor Colorants Minimal

Résumé

Une méthode simple et spécifique a été démontrée pour le marquage fluorescent et une meilleure détection des protéines de surface cellulaire sans une étape de fractionnement. L'abondance différentielle des protéines de surface cellulaire a été analysée par électrophorèse bidimensionnelle (2-D) et Ettan ™ technologie DIGE.

Résumé

Protéines de surface sont au cœur de la capacité des cellules à réagir à son environnement et d'interagir avec les cellules voisines. Ils sont connus pour être des inducteurs de la quasi-totalité de signalisation intracellulaire. De plus, ils jouent un rôle important dans l'adaptation de l'environnement et le traitement médicamenteux, et sont souvent impliqués dans la pathogenèse de la maladie et de la pathologie (1). Interactions protéine-protéine sont intrinsèques à des voies de signalisation, et de gagner plus de perspicacité dans ces processus biologiques complexes, des méthodes sensibles et fiables sont nécessaires pour étudier les protéines de surface cellulaire. Deux dimensions (2-D) électrophorèse est largement utilisé pour la détection de biomarqueurs et d'autres cibles dans les échantillons de protéines complexes pour étudier l'évolution différentielle. Protéines de surface cellulaire, en partie en raison de leur faible abondance (1 à 2% des protéines cellulaires), sont difficiles à détecter dans un gel 2-D sans fractionnement ou un autre type d'enrichissement. Ils sont aussi souvent mal représentés dans les gels 2-D en raison de leur caractère hydrophobe et de haut poids moléculaire (2). Dans cette étude, nous présentons un nouveau protocole pour les cellules intactes en utilisant des teintures CyDye DIGE Fluor minimale pour un étiquetage spécifique et la détection de cet important groupe de protéines. Les résultats ont montré un étiquetage spécifique d'un grand nombre de protéines de surface cellulaire avec un étiquetage minimum de protéines intracellulaires. Ce protocole est rapide, simple à utiliser, et tous les trois colorants CyDye DIGE Fluor minimes (Cy 2, 3 et Cy Cy 5) peut être utilisé pour étiqueter protéines de surface cellulaire. Ces caractéristiques permettent de multiplexage en utilisant le 2-D électrophorèse de gel de fluorescence Différence (2-D DIGE) avec Ettan DIGE technologie et l'analyse des changements d'expression de protéines en utilisant DeCyder 2-D Logiciel d'analyse différentielle. Le niveau de protéines de surface cellulaire a été suivi pendant la famine de sérum de cellules CHO pour des durées différentes (voir tableau 1). De petits changements dans l'abondance ont été détectés avec une grande précision, et les résultats sont pris en charge par des méthodes statistiques définies.

Protocole

La culture cellulaire

1. Cultivez ovariennes de hamster chinois (CHO-K1) en utilisant les procédures standard de culture de cellules dans un milieu de Ham F-12 avec glutamax I contenant 10% sérum de veau foetal, 50 U / ml de pénicilline, et 50 ug / ml de sulfate de streptomycine (Invitrogen).
2. Bourse du milieu de culture pour un milieu sans sérum. Marquer les protéines de surface de la cellule ont été à des moments différents avec CyDye DIGE Fluor Cy3 ou Cy5 colorants minime (voir la section marquage de surface cellulaire, plus bas).
3. Piscine nombres égaux de cellules provenant de chaque point du temps et de l'étiquette avec CyDye DIGE Cy2 Fluor. Utilisez-les comme une norme interne pour chaque gel 2-D.
4. La majorité des expériences peuvent être réalisées avec des cellules CHO-K1, mais fibroblastes d'embryon de souris (3T3 L1) et les lymphoblastes de lymphome de souris ascite (EL4) peut également être utilisé (données non présentées).
5. Cultivez les deux types cellulaires derniers dans le milieu DMEM avec glutamax II, mais, sinon, utilisez des conditions identiques utilisé pour les cellules CHO-K1.

L'étiquetage de la surface cellulaire

1. Détacher soigneusement cellules adhérentes non enzymatique, en comptant et en divisant en aliquots de 5-10 x 106 cellules. Pour les cellules en croissance en suspension, omettre l'étape détacher.
2. Centrifuger les suspensions cellulaires à environ 800 xg pendant 5 minutes. Retirez les surnageants contenant le milieu.
3. Laver les pastilles par resuspendion dans la Solution 1 ml de glace froide saline équilibrée de Hank (HBSS) pH 8,5. Centrifugées à 800 xg à 4 ° C pendant 2 minutes.
4. Enlever le surnageant et remettre en suspension les cellules dans 200 ul de tampon de glace étiquetage froide culot (HBSS pH 8,5, 1 M d'urée).
5. Étiqueter les cellules intactes avec 600 pmol colorants CyDye Fluor DIGE minimale de 20 minutes sur la glace dans l'obscurité.
6. Arrêter la réaction en ajoutant 20 pl 10 mM de lysine. Incuber pendant 10 minutes.
7. Lavez la surface cellules marquées à deux reprises par la remise en suspension dans 500 ul de HBSS pH 7,4, suivie par une centrifugation à 800 xg à 4 ° C pendant 2 minutes.

La lyse cellulaire et le fractionnement

1. Lyse la surface cellules marquées dans 150 ul de tampon de lyse froid (7 M d'urée, 2 M thiourée, CHAPS 4%, 30 mM Tris, 5 mM d'acétate de magnésium pH 8,5). Laisser sur la glace pendant au moins 1 h avec vortex occasionnel.
2. Centrifuger les lysats à 10 000 xg à 4 ° C pendant 5 minutes. Transférer le surnageant dans un nouveau tube. Cet échantillon est l'échantillon non fractionnée contenant toutes les protéines cellulaires.
3. En parallèle, se laver les culots de cellules, comme ci-dessus, puis fractionnent (en utilisant un kit de fractionnement sur membrane, Pierce) dans la membrane et les fractions cytosoliques avant 2-D électrophorèse sur gel. La fraction membranaire des cellules internes et contient des protéines membranaires de surface.
4. A titre de comparaison, suivent la norme Ettan DIGE procédure ^3, et Lyse, l'étiquette, et, enfin, fractionner les cellules. Déterminer la concentration de protéines dans les échantillons en utilisant le 2 - D Quant Kit (GE Healthcare).

Électrophorèse 2-D

1. Réhydrater les gels DryStrip Immobiline, pH 3-11NL (24 cm) en utilisant le bac DryStrip Immobiline Reswelling, 24 cm en 450 solution de réhydratation DeStreak ul (0,5% IPG tampon) pendant la nuit.
2. Appliquer le CyDye échantillons marqués (correspondant à 50 ug de protéines totales) à Immobiline gels DryStrip par le chargement de la Coupe anodique dans le collecteur et d'effectuer la focalisation isoélectrique (IEF) en utilisant Ettan IPGphor II IEF système conformément aux instructions.
3. Après l'IEF, à équilibrer les bandes en deux étapes et placer sur le dessus de la grande (26 x 20 cm) des gels de polyacrylamide 12,5% (SDS-PAGE). Superposition avec 0,5% d'agarose (à vide tampon contenant du bleu de bromophénol). Exécuter électrophorèse 2-D en utilisant Ettan DALTtwelve gros système vertical à 5 ​​W / gel pendant 30 min, puis à 15 W / gel jusqu'à ce que le front atteint le fond du gel.

Imagerie et analyse des données

1. Après avoir terminé électrophorèse 2-D, de numériser les gels pour les Cy2, Cy3 ou Cy5 l'aide d'un typhon 9410 Imager mode Variable.
2. Comparer les cartes place à partir des fractions membranaires, les fractions cytosoliques, et non fractionnée en utilisant des échantillons DeCyder 2-D Logiciel d'analyse différentielle ^4.

Post-coloration

1. Après l'imagerie, coloration à l'argent des gels selon la procédure standard ^5.

L'identification des protéines

1. Cultiver, récolter, laver et Lyse quantités préparative (environ 1 mg de protéines totales de 10 cellules CHO x106) des cellules, comme décrit ci-dessus pour un échantillon non fractionnée. Utilisez un échantillon de surface des cellules étiquetées Cy5 (voir ci-dessus) comme un pic, et appliquer ainsi que les montants non étiquetés préparative des protéines.
2. Effectuer l'électrophorèse 2-D comme décrit ci-dessus, mais cette fois, aplly 600 mg de cellules non étiquetées lysat avec 50 mg de surface des cellules étiquetées par des pointes anodiques tasse de demande. Utilisez des marqueurs de référence pour permettre la cueillette bon endroit, et le lieu serontentre les plaques de verre avant la coulée du gel, conformément aux recommandations ^3.
3. Analyser le gel dans le canal Cy5 pour obtenir la carte Cy5 surface cellulaire au comptant, suivie d'une coloration des protéines totales à l'aide de Deep Purple Stain protéines totales ^3.
4. Match ensemble, les deux cartes utilisant le spot DeCyder 2-D de logiciels et de créer une liste de sélection pour tous les spots correspondant aux 5 Cy étiquetée protéines de surface cellulaire. Choisissez des protéines de surface cellulaire utilisant la station de traitement Ettan repérer, d'extraire à partir des bouchons de gel, et trypsinat utilisant le digesteur Ettan. Identifier par spectrométrie de masse MALDI-TOF.

Tableau 1. Une expérience Ettan DIGE été réalisée en utilisant des échantillons de sérum de cellules appauvri étiquetés selon le protocole de surface cellulaire de protéines d'étiquetage dans la figure 1.

Exemple	Temps d'épuisement du sérum	Etiqueté avec CyDye	Numéro de gel
1	-	Cy 3, Cy 2	1
2	30 minutes	Cy 5, 2 Cy	1
3	2 heures	Cy 3, Cy 2	2
4	4 heures	Cy 5, 2 Cy	2
5	16 heures	Cy 5, 2 Cy	3

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Discussion

La concentration en protéines

Un aperçu des deux flux d'étiquetage est montré dans la figure 1. Puisque les cellules sont encore intactes lorsque étiquetés selon le protocole de surface cellulaire de protéines étiquetage, seules les protéines de surface cellulaire sont exposés à la teinture. Dans le protocole standard Ettan DIGE, les cellules sont lysées avant l'étiquetage et les protéines à l'intérieur comme à l'extérieur de la cellule sont étiquetés (Fig 1...

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matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
CyDye DIGE Kit, 2 nmol	Reagent	GE Healthcare	28-9345-30
2-D Quant Kit	Reagent	GE Healthcare	80-6484-51
IPG Buffer pH 3-11NL	Reagent	GE Healthcare	17-6004-40
Immobiline DryStrip pH 3-11NL, 24 cm	Reagent	GE Healthcare	17-6003-77
IPGbox	Tool	GE Healthcare	28-9334-65
IPGbox kit	Tool	GE Healthcare	28-9334-92
DeStreak Rehydration solution	Reagent	GE Healthcare	17-6003-19
Immobiline DryStrip Cover Fluid	Reagent	GE Healthcare	17-1335-01
Ettan IPGphor 3 IEF Unit	Instrument	GE Healthcare	11-0033-64
Ettan IPGphor Manifold	Instrument component	GE Healthcare	80-6498-38
Ettan DALTtwelve Gel Caster	Tool	GE Healthcare	80-6467-22
Ettan DALTtwelve Separation Unit and Power Supply/Control Unit	Instrument	GE Healthcare	80-6466-46	230 V unit: 80-6466-27
Typhoon 9410 Variable Mode Imager	Instrument	GE Healthcare	63-0055-81
Ettan Spot Picker	Instrument	GE Healthcare	18-1145-28
Ettan Digester	Instrument	GE Healthcare	18-1142-68
Ettan Spotter	Instrument	GE Healthcare	18-1142-67
Ettan MALDI-TOF	Instrument	GE Healthcare	18-1142-33
DeCyder 2-D Differential Analysis Software	Other	GE Healthcare	28-4012-01
ImageQuant Analysis Software	Other	GE Healthcare	28-9236-62
Urea	Reagent	GE Healthcare	17-1319-01
CHAPS	Reagent	GE Healthcare	17-1314-01
PlusOne Dithiothreitol (DTT)	Reagent	GE Healthcare	17-1318-01
Bromophenol Blue	Reagent	GE Healthcare	17-1329-01
Tris	Reagent	GE Healthcare	17-1321-01
Sodium Dodecylsulfate (SDS)	Reagent	GE Healthcare	17-1313-01
PlusOne Glycerol 87%	Reagent	GE Healthcare	17-1325-01
PlusOne ReadySol IEF 40% T, 3% C	Reagent	GE Healthcare	17-1310-01
PlusOne TEMED	Reagent	GE Healthcare	17-1312-01
PlusOne Ammonium Persulfate	Reagent	GE Healthcare	17-1311-01
PlusOne Glycine	Reagent	GE Healthcare	17-1323-01
2-D Sample Prep for membrane proteins	Reagent	Pierce, Thermo Scientific	89864
Streptomycin sulphate	Reagent	Invitrogen	15140-122