ويستند هذا البروتوكول على تقنيات علم في مختبر فرانسيس أندريه ولمان في فرنسا المعهد البيولوجيا الفيزيائية Chimique ، باريس. الكتاب مدينون بالعرفان لBascou جيرارد جاكلين ، الذي قدم أصلا DBS إلى التقنيات الجينية المتلحفة. معتمد المتلحفة البحوث في المختبر والمؤلفين من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم جائزة MCB - 0646350.

الجزء 1 : إعداد سلالات لتكون الأعراس ملاحظة : يجب أن يتم التلاعب بها في كل درجة حرارة الغرفة. وتتراوح درجات الحرارة أعلى أو أقل تؤثر على سرعة إنبات الزيجوت ويمكن أن تؤثر سلبا على قدرتها على البقاء. الاعتبارات المهمة : من الضروري أن يكون لتزاوج سلالات تنمو بقوة وتكون خالية من الفطريات أو البكتيريا الملوثة. إذا كانت سلالات لم نقل بشكل منتظم ، ينبغي المرور على المتوسط ​​الغنية تسبق توليد الأمشاج. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يتم نقل سلالات أن تزاوج على لوحات وات (100 × 15 ملم) ، 1-2 سلالات لكل لوحة. يجب أن تنمو الخلايا في قطاع يتركز حوالي 1 سم في العرض. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وينبغي على لوحات TAP حضانة تستمر حتى طبقة سميكة من الخلايا التي تنمو بقوة هو الحاضر ، مع نقل وسيطة إذا لزم الأمر. قد السلالات التي لم passaged مؤخرا تتطلب واحد ومرور ما مجموعه 1 أسبوع ، في حين أن السلالات البرية من نوع في الاستخدام المنتظم فقط قد يستغرق بضعة أيام والممرات لا. قد المسوخ التي هي حساسة للضوء تتطلب وقتا إضافيا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل كافة الخلايا من لوحات لوحات TAP N10 ، والتي هي قاصرة على النيتروجين وستبدأ للحث على تكون الأعراس. نقل الخلايا كما لوح سميك ، بقدر ما كانت موجودة على لوحة وات. هذا سوف يسهل جمع اللاحقة من الخلايا. بعد 3 أيام على N10 ، على استعداد للخضوع لهذه الخلايا تكون الأعراس. انقسام الخلية سيكون بطيئا على N10 ، ولكن ينبغي أن تظل خلايا خضراء داكنة. يجب التخلص من أي السلالات الملوثة كما لن بيضات ملقحة قابلة للحياة يمكن الحصول عليها. </li></ol> الجزء 2 : التزاوج <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يتم نقل كل سلالة في دورق مخروطي 50 مل ومعلق في ما يقرب من 2.5 مل من الماء المقطر العقيمة. ويمكن القيام بذلك باستخدام إما حلقة سلكية أو عصا العقيمة ؛ ما هو مهم هو أن يتم تعليق جيدا الخلايا وليس في شكل كتل. وينبغي تعديل حجم الدقيق للمياه بحيث تركيز الخلية ، تم قياسه من خلال العين ، هو نفسه تقريبا بالنسبة لكل سلالة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يتم تحريكها الخلايا تحت ضوء قوي (1.260 μ E / م 2 / ثانية) لمدة 2 ساعة ، وخلال الوقت الذي سوف تصبح خلايا الأمشاج متحركة. يجب أن يتم التحقق حركية تحت المجهر الخفيفة. إذا الأمشاج هي السباحة نحو رديء ، التزاوج من المرجح أن تكون غير فعالة. ومع ذلك ، حتى سلالات ضعيفة متحركة رفيقة التردد المنخفض. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> المقبل ، وأحجام متساوية من طن متري + ويتم الجمع بين MT - الأمشاج في قارورة واحدة 50 ملم. يتم ترك الأمشاج تحت ضوء قوي (E μ 1.260 / م 2 / ثانية) من دون الانفعالات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يمكن التحقق التزاوج مباشرة تحت المجهر الضوئي. أزواج من الأمشاج شكل سريع ، وسوف تبدو وكأنها خلايا تتحرك بسرعة وانضم في سياط. إذا يبدو أن التزاوج يكون سريعا للغاية ، ينبغي أن تؤخذ العينات في غضون 30 دقيقة -1 ساعة لتوليد بيضات ملقحة. إن لم يكن ، يمكن التحقق التزاوج كل ساعة ، على الرغم من أن هذا هو اختياري. منذ العصور إعطاء الكثافة المثلى من بيضات ملقحة سوف تختلف على نطاق واسع بين الصلبان ، فمن الأفضل أن تأخذ aliquots من خليط التزاوج في أوقات مختلفة بعد الجمع بين الأمشاج ، على سبيل المثال بعد 1 ساعة ، ساعة 2 و 3 ساعات وساعات 4. يتم ذلك عن طريق تحويل 300 لعينات ميكرولتر TAP - 3 ٪ Difco آغار 60 × 15 مم لوحات ؛ البقع 3-4 في لوحة. يجب الحرص على عدم التحرك من الخليط التزاوج لأن ذلك قد يعطل أزواج التزاوج. يستخدم Difco آغار لأنها أقل من الملوثات ذات الأسعار المنخفضة agars ، وسيكون من السهل أن نرى بيضات ملقحة تحت المجهر. يمكن ترك الخليط التزاوج غير المستخدمة في القارورة بين عشية وضحاها ، ونوعية رد الفعل التزاوج سوف يكون واضحا في اليوم التالي. عند التزاوج غير فعالة ، فإن الالتزام بيضات ملقحة أو الجدار السفلي من القارورة والمتوسطة وسوف تظهر واضحة. وحتى التحريض القارورة تفشل في طرد بيضات ملقحة. إذا لا شيء عصي على الزجاج عندما يتم تحريكها الخليط بقوة معقولة ، ثم تم التزاوج غير فعالة أو لم تتم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يتم تجفيفها لوحات TAP - Difco تحتوي على خليط التزاوج في غطاء عقيمة ، مع أغطية مواربا ، حتى تم استيعاب أي السائل السطح. ويترك عادة لوحات في ضوء (700 شمال شرق / م 2 / ثانية) لمدة 18 ساعة ، ثم لف في احباط ، ومنذ نضوج بوغ لاقحي تبت إلا في الظلام. عبرت السلالات ، التزاوج الوقت والتاريخ على لوحات مكتوبة على حد سواء واحباط. يتم تخزين لوحات 5 إلى 7 أيام ، ويمكن أن تبقى لفترة أطول ، على الرغم من انخفاض إنبات الزيجوت الكفاءة تدريجيا. </li></ol> الجزء 3 : تشريح الرباعيات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يجب كشط الخلايا النباتية قبالة البقع الجافة مزيج التزاوج باستخدام شفرة مملة ، مثل مشرط. ويمكن استخدام شفرة لفضح مساحة بيضات ملقحة ، والتي ستلتزم باحكام آغار 3 ٪. وعادة ما يتم في هذه الخطوة بعد الظهر ، بحيث يكون بيضات ملقحة التي نبتت في صباح اليوم التالي ، ولكن لم يمر في الثانية ، التي من شأنها تقسيم الخضري8 العائد ذرية. المتلحفة البيولوجيين تتعلم بسرعة للاعتراف بيضات ملقحة تحت المجهر ، نظرا لأنها أكبر من الخلايا النباتية ، وميزة جدار سميك بوغ لاقحي الذي يعطي المخطط الأسود. Zygospores غالبا ما تظهر الصفراء ولكنها قد تكون أيضا الخضراء إلى حد ما. الحرف الأكثر أهمية هو أن التمسك آغار ، في حين يتم نقل الخلايا الخضرية بسهولة جانبا. ومع ذلك ، إذا لوحات جافة بشكل مفرط هذا لن يكون كذلك. أيضا ، إذا كان الخليط التزاوج كثيفة جدا ، قد بيضات ملقحة شكل حصيرة الذي سيجعل نقل بيضات ملقحة الفردية صعبا أو مستحيلا. تقام كثافات مناسبة في الخطوة 2.1 ، وسيتم تعلمت بسرعة من ذوي الخبرة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مستعدون لجمع الإبر الزجاج بيضات ملقحة وفصل ذرية الرباعيات. وتعد هذه من خلال سحب قضبان الزجاج 3 مم في لهب صغيرة لتوليد طويلة ، الخيط الرفيع ، والتي يمكن تنقطع. هي مهد نصائح من هذه الغايات مدبب أو عازمة على السنانير ، عن طريق تسخين وجيزة في لهب منخفض (مثل الكحول أو حرق مباراة). تعد الإبر والزجاج 3 أو أكثر ، نظرا لأنها تتكسر بسهولة إلى حد ما ، خاصة بالنسبة للمستخدمين عديمي الخبرة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نجتمع بيضات ملقحة على لوحة TAP - Difco 3 ٪ باستخدام إبرة في كومة من الزجاج الصغيرة. يتم تشكيل مربع من أجار (تصل إلى 0.5 سم 2) يحتوي على بيضات ملقحة ورفعه باستخدام مشرط مملة. ثم ، يتم وضع كتلة آغار وجهه لأسفل على طبق من ذهب 15 مم TAP - Difco 1.5 ٪ ، وتراجعت على طول خط أفقي نحو 1.5 سم من الجزء العلوي من لوحة ، لتوزيع بيضات ملقحة. وحفرت في السطر العلوي الأفقي ، والشبكة مع ما يقرب من 1.5 سم و 0.5 التباعد الأفقي الطول الرأسي في الجزء الخلفي من لوحات. وستستخدم الشبكة في اليوم التالي كدليل لفصل ذرية الرباعيات (يمكن أيضا أن تكون الشبكة محفورا في اليوم من تشريح). أخيرا ، بيضات ملقحة الفردية الانتقال إلى تقاطعات خطوط أفقية أعلى مع كل خط عمودي ، مع حوالي 2-30 بيضات ملقحة لكل لوحة. بالرغم من أنه سيتم تشريح سوى 12 أو نحو ذلك ، وليس كل اقحة تنبت ، وبعض سوف تقسم مرتين قبل أن تنفجر ، وهناك حاجة بيضات ملقحة خارج ذلك. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد توزيع يتم قتل بيضات ملقحة ، والخلايا النباتية التي تم نقلها عن طريق الخطأ من لوحة آغار 3 ٪ من خلال تعريض لوحة مقلوب لمدة 30 ثانية على طبق من الزجاج تحتوي على رقيقة (1-2 ملم) من طبقة الكلوروفورم. وينبغي أن المسافة بين لوحة وكلوروفورم تكون حوالي 5 سم. إذا تم استخدام الكلوروفورم كثيرا ، أو إذا كانت المسافة كبيرة جدا أو صغيرة ، واحدة من المخاطر قتل إما بيضات ملقحة ، أو أنه لم يقتل الخلايا النباتية. يجب أن يتم العلاج على الفور بعد كلوروفورم تم توزيع zygospores على لوحة الإنبات ، لضمان الانتقائية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إنبات يأخذ 16-20 ساعة بالنسبة لمعظم السلالات ، ولكن سوف تختلف مع التركيب الوراثي ومع عمر بيضات ملقحة. للإنبات ، وتوضع لوحات تحت الضوء المنخفض (239 شمال شرق / م 2 / ثانية) ، أو في ضوء خافتة المتوسطة التي تغطي لوحة بمنديل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ويمكن تحديد بيضات ملقحة نبتت تحت المجهر كخلايا تورم أو الاندفاع في بعض الأحيان مع ابنة الخلايا بداخلها. إذا كان بوغ لاقحي لم تمزق ، وسوف تلمس برفق مع إبرة الزجاج كسر جدار الإنبات إذا حدث. تم سحبها بلطف الخلايا الوليدة إلى نقاط الشبكة تحت الزيجوت. فمن الأسهل القيام بذلك من خلال الكشف عن خلية في كمية صغيرة من السائل المتوسطة التي صدرت من قبل آغار ضغط الإبرة والزجاج ، وسحب هذا &quot;بركة&quot; وراء الإبرة. نموذج واحد من &quot;التأمين&quot; أن على المرء أن تشريح a اقحة وليس الخلية النباتية التي تقسم مرتين ، هو أنه بغض النظر عن الخلايا ابنة الأربعة ، فإن &quot;الجلد&quot; من الجدار بوغ لاقحي لا تزال قائمة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وتزرع على سلالة تشريح تحت الظروف المناسبة حتى يمكن التقاطها clonies مرئية لتحليل لاحقة. وينبغي رصد لوحات اليومية للتلوث. </li></ol> ملاحظة : لا تغطي توليد diploids الخضري هنا ، ولكن ينطوي أساسا الطلاء المخلوط على التزاوج المتوسطة التي لن تدعم نمو إما سلالة الأبوية ، ولكن من شأنها دعم نمو مضاعفا (مثل علامات two auxotropic مختلفة). وتحفظ لوحات في ضوء لتجنب تشكيل بيضات ملقحة.

<ol>
	<li>Harris, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Chlamydomonas+Sourcebook:+Introduction+to+Chlamydomonas+and+Its+Laboratory+Use.">The Chlamydomonas Sourcebook: Introduction to Chlamydomonas and Its Laboratory Use.</a> Conf Proc IEEE Eng Med Biol Soc. , 119-273 (2005).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

التحليل الجيني هو بسيط في المتلحفة ، ولكنه يتطلب تقنيات خاصة لتوليد الأمشاج ومنفصلة ذرية الرباعيات. مع سلالات صحية ، ويتم الحصول بسهولة على التقنيات. مع بعض سلالات متحولة ، يصبح أكثر من فن ، والقراء الرجوع المجلد 1 من المرجع المتلحفة نشرت مؤخرا عن المذكرات ا...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>CC-125</td>
<td>Mating type plus strain</td>
<td>Chlamydomonas Stock Center</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>CC-124</td>
<td>Mating type minus strain</td>
<td>Chlamydomonas Stock Center</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Tris-Acetate-Phosphate (TAP) </td>
<td>Growth medium</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>N10</td>
<td>Growth medium</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Difco agar</td>
<td>Reagent</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Fisherbrand Stainless-Steel Blades</td>
<td>Tools</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>08-916-5B</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>BD Surgical Blade Handles</td>
<td>Tools</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>08-914-5</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Fisherbrand Metal Scalpels</td>
<td>Tools</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>08-920A</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

mating and tetrad separation of chlamydomonas reinhardtii for genetic analysis

وحيدة الخلية الطحالب الخضراء<em&gt; المتلحفة reinhardtii</em&gt; (<em&gt; المتلحفة</em&gt;) أصبح الحي الشعبي للبحث في مختلف مجالات بيولوجيا الخلية والوراثة بسبب دورة حياة بسيطة ، وسهولة التلاعب لتحقيق النمو والتحليل الجيني ، والموارد الجينومية ، وtransformability النواة والعضيات على حد سواء. سلالات التزاوج هو ممارسة شائعة عند استخدام النهج الوراثية في<em&gt; Chlamydomonass</em&gt; ، لإنشاء diploids الخضري لتحليل الهيمنة ، أو بعد تشريح الرباعيات للتأكد من الميراث النووي مقابل organellar ، لاختبار ألالة ، لتحليل قشوة ، أو لتوليد السكان لغرض خريطة القائم على الاستنساخ. بالإضافة إلى ذلك ، تستخدم بشكل روتيني الصلبان على الجمع بين المورثات الجينية organellar مع المورثات النووية بوجه خاص. هنا علينا أن نظهر للطرق القياسية ، تكون الأعراس الإنبات ، وفصل التزاوج اقحة الرباعيات. هذا البروتوكول يتكون من سلسلة من السهل المتابعة من الخطوات التي من شأنها أن تجعل النهج الوراثية قابلة للعلماء الذين هم أقل دراية<em&gt; المتلحفة</em&gt;. وأوضح المعلمات الرئيسية وبؤر التوتر. أخيرا ، يتم توفير الموارد اللازمة لمزيد من المعلومات والطرق البديلة.

Watch this Scientific Journal Video about Mating and Tetrad Separation of Chlamydomonas reinhardtii for Genetic Analysis at JoVE.com

Mating and Tetrad Separation of Chlamydomonas reinhardtii for Genetic Analysis

مطلوبة فصل التزاوج والرباعيات للتحليل الجيني في<em&gt; المتلحفة reinhardtii</em&gt;. هنا علينا أن نظهر للطرق القياسية ، تكون الأعراس الإنبات ، والتزاوج واقحة تشريح الرباعيات. هذا البروتوكول يتكون من سلسلة من السهل المتابعة من الخطوات التي من شأنها أن تجعل النهج الوراثية قابلة للعلماء الذين هم أقل دراية<em&gt; المتلحفة</em&gt;.

وفصل التزاوج من الرباعيات المتلحفة reinhardtii عن التحليل الوراثي

The unicellular green alga Chlamydomonas reinhardtii (Chlamydomonas) has become a popular organism for research in diverse areas of cell biology and ...

mating-tetrad-separation-chlamydomonas-reinhardtii-for-genetic

Research

JoVE Journal

Biology

Mating and Tetrad Separation of Chlamydomonas reinhardtii for Genetic Analysis

19.9K Views.  Cornell University. مطلوبة فصل التزاوج والرباعيات للتحليل الجيني في المتلحفة reinhardtii. هنا علينا أن نظهر للطرق القياسية ، تكون الأعراس الإنبات ، والتزاوج واقحة تشريح الرباعيات. هذا البروتوكول يتكون من سلسلة من السهل المتابعة من الخطوات التي من شأنها أن تجعل النهج الوراثية ق?...

Video: Mating and Tetrad Separation of Chlamydomonas reinhardtii for Genetic Analysis

Light/dark Transition Test for Mice

Although all of the mouse genome sequences have been determined, we do not yet know the functions of most of these genes. Gene-targeting techniques, however, can be used to delete or manipulate a specific gene in mice. The influence of a given gene on a specific behavior can then be determined by conducting behavioral analyses of the mutant mice. As a test for behavioral phenotyping of mutant mice, the light/dark transition test is one of the most widely used tests to measure anxiety-like behavior in mice. The test is based on the natural aversion of mice to brightly illuminated areas and on their spontaneous exploratory behavior in novel environments. The test is sensitive to anxiolytic drug treatment. The apparatus consists of a dark chamber and a brightly illuminated chamber. Mice are allowed to move freely between the two chambers. The number of entries into the bright chamber and the duration of time spent there are indices of bright-space anxiety in mice. To obtain phenotyping results of a strain of mutant mice that can be readily reproduced and compared with those of other mutants, the behavioral test methods should be as identical as possible between laboratories. The procedural differences that exist between laboratories, however, make it difficult to replicate or compare the results among laboratories. Here, we present our protocol for the light/dark transition test as a movie so that the details of the protocol can be demonstrated. In our laboratory, we have assessed more than 60 strains of mutant mice using the protocol shown in the movie. Those data will be disclosed as a part of a public database that we are now constructing.

Visualization of the protocol will facilitate understanding of the details of the entire experimental procedure, allowing for standardization of the protocols used across laboratories and comparisons of the behavioral phenotypes of various strains of mutant mice assessed using this test.

The light/dark transition test is one of the most widely used tests to measure anxiety-like behavior in mice. Here, we present a movie that shows detailed procedures on how we conduct the test.

الضوء / الظلام لاختبار الانتقال الفئران

Although all of the mouse genome sequences have been determined, we do not yet know the functions of most of these genes. Gene-targeting techniques, ...

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo (New Culture)

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying  the formation and patterning of brain, neural tube, somite and heart primordia. Applications of chick embryo culture include electroporation of DNA or RNA constructs in order to analyze gene function, grafts of growth factor coated beads such as FGFs and BMPs , as well as whole mount in situ hybridization and immunohistochemistry. This video demonstrates the different steps in chick embryo culture; First, the embryo is explanted in saline. Then, the embryo is centered on a glass ring. The membranes surrounding the embryo are lifted along the walls of the ring. The ring is then placed in a culture dish containing a pool of albumine. The culture dish is sealed and placed in a humid chamber, where the embryo is cultured for up to 24 hrs. Finally, the embryo is removed from the ring, fixed and processed for further applications. A troubleshooting guide is also presented.

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo New Culture

This video demonstrates New culture, a method by which chick embryos are cultured outside the egg for up to 24 hr. This method enables one to study early development (primitive streak to 14 som.), a period corresponding to E7-9 in mouse. Applications of this technique include electroporation, in situ hybridization and immunohistochemistry.

طريقة لثقافة الفرخ المبكر فيفو السابقين الأجنة (الثقافة الجديدة)

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

Double Whole Mount in situ Hybridization of Early Chick Embryos

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying  gene expression in brain, neural tube, somite and heart primordia formation. This video demonstrates the different steps in 2-color whole mount in situ hybridization; First, the embryo is dissected from the egg and fixed in paraformaldehyde. Second, the embryo is processed for prehybridization. The embryo is then hybridized with two different probes, one coupled to DIG, and one coupled to FITC.  Following overnight hybridization, the embryo is incubated with DIG coupled antibody. Color reaction for DIG substrate is performed, and the region of interest appears blue. The embryo is then incubated with FITC coupled antibody. The embryo is processed for color reaction with FITC, and the region of interest appears red. Finally, the embryo is fixed and processed for phtograph and sectioning. A troubleshooting guide is also presented.

This video demonstrates 2-color whole mount in situ hybridization, a method by which the spatial and temporal expression pattern of 2 different genes can be visualized in young chick embryos. This method was originally introduced by David Wilkinson, Domingos Henrique, Phil Ingham and David Ish -Horowicz.

الجامعة جبل مزدوجة في الموقع التهجين لافراخ الدجاج في وقت مبكر

Method for Whole Mount Antibody Staining in Chick

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying antibody expression in developing brain, neural tube and somite. This video demonstrates the different steps in whole-mount antibody staining using HRP conjugated secondary antibodies; First, the embryo is dissected from the egg and fixed in paraformaldehyde. Second, endogenous peroxidase is inactivated; The embryo is then exposed to primary antibody. After several washes, the embryo is incubated with secondary antibody conjugated to HRP. Peroxidase activity is revealed using reaction with diaminobenzidine substrate. Finally, the embryo is fixed and processed for photography and sectioning. The advantage of this method over the use of fluorescent antibodies is that embryos can be processed for wax sectioning, thus enabling the study of antigen sites in cross section. This method was originally introduced by Jane Dodd and Tom Jessell 1.

This video demonstrates whole mount immunohistochemistry, a method by which the spatial and temporal expression pattern of an antigen can be visualized in young chick embryos. This method was originally introduced by Jane Dodd and Tom Jessell.

طريقة لتلطيخ جسم الجامع في جبل الفرخ

Assay for Neural Induction in the Chick Embryo

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying the formation and initial patterning of the nervous system. This video demonstrates how to graft organizer tissue into a host, a method by which Hensen s node (the organizer in the chick embryo) is grafted to a host competent ectoderm. The organizer graft instructs overlying na ve tissue to adopt a neural fate via neural inducing signals. This mechanism is referred to as neural induction, and constitutes the initial step in the formation of brain and spinal cord in amniotes. This method is essentially used for the characterization of putative neural inducing molecules in chick. This video demonstrates the different steps in the assay for neural induction; First, the donnor embryo is explanted and pinned on a dish. Then, the host embryo is prepared for New culture. The graft is excised and transplanted to the host area pellucida margin. The host is cultured for 18-22 hrs. The assembly is fixed and processed for further applications (e.g. in situ hybridization). This method was originally devised by Waddington 1,2 and Gallera 3,4.

Neural induction is the first step in the formation of the brain. It is a mechanism by which Hensen's node (organizer), instructs adjacent tissue to adopt a neural fate, i.e. to give rise to the nervous system. This video demonstrates an assay for neural induction in chick embryo.

مقايسة لتحريض العصبية في الأجنة الفرخ

A Neuronal and Astrocyte Co-Culture Assay for High Content Analysis of Neurotoxicity

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing measurement of multiple cellular phenotypes within a single assay. In this study, we utilized HCA to develop a novel assay for neurotoxicity. Neurotoxicity assessment represents an important part of drug safety evaluation, as well as being a significant focus of environmental protection efforts. Additionally, neurotoxicity is also a well-accepted in vitro marker of the development of neurodegenerative diseases such as Alzheimer's and Parkinson's diseases. Recently, the application of HCA to neuronal screening has been reported. By labeling neuronal cells with &beta;III-tubulin, HCA assays can provide high-throughput, non-subjective, quantitative measurements of parameters such as neuronal number, neurite count and neurite length, all of which can indicate neurotoxic effects. However, the role of astrocytes remains unexplored in these models. Astrocytes have an integral role in the maintenance of central nervous system (CNS) homeostasis, and are associated with both neuroprotection and neurodegradation when they are activated in response to toxic substances or disease states. GFAP is an intermediate filament protein expressed predominantly in the astrocytes of the CNS. Astrocytic activation (gliosis) leads to the upregulation of GFAP, commonly accompanied by astrocyte proliferation and hypertrophy. This process of reactive gliosis has been proposed as an early marker of damage to the nervous system. The traditional method for GFAP quantitation is by immunoassay. This approach is limited by an inability to provide information on cellular localization, morphology and cell number. We determined that HCA could be used to overcome these limitations and to simultaneously measure multiple features associated with gliosis - changes in GFAP expression, astrocyte hypertrophy, and astrocyte proliferation - within a single assay. In co-culture studies, astrocytes have been shown to protect neurons against several types of toxic insult and to critically influence neuronal survival. Recent studies have suggested that the use of astrocytes in an in vitro neurotoxicity test system may prove more relevant to human CNS structure and function than neuronal cells alone. Accordingly, we have developed an HCA assay for co-culture of neurons and astrocytes, comprised of protocols and validated, target-specific detection reagents for profiling &beta;III-tubulin and glial fibrillary acidic protein (GFAP). This assay enables simultaneous analysis of neurotoxicity, neurite outgrowth, gliosis, neuronal and astrocytic morphology and neuronal and astrocytic development in a wide variety of cellular models, representing a novel, non-subjective, high-throughput assay for neurotoxicity assessment. The assay holds great potential for enhanced detection of neurotoxicity and improved productivity in neuroscience research and drug discovery.

This article describes a novel protocol and reagent set designed for sensitive measurement of neurotoxic effects of compounds and treatments on co-cultures of neurons and astrocytes using high content analysis. Results demonstrate that high content analysis represents an exciting novel technology for neurotoxicity assessment.

والخلايا العصبية ونجمية المشارك الثقافة الفحص لتحليل محتوى عال من العصبية

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing ...

Dissection of Hippocampal Dentate Gyrus from Adult Mouse

The hippocampus is one of the most widely studied areas in the brain because of its important functional role in memory processing and learning, its remarkable neuronal cell plasticity, and its involvement in epilepsy, neurodegenerative diseases, and psychiatric disorders. The hippocampus is composed of distinct regions; the dentate gyrus, which comprises mainly granule neurons, and Ammon's horn, which comprises mainly pyramidal neurons, and the two regions are connected by both anatomic and functional circuits. Many different mRNAs and proteins are selectively expressed in the dentate gyrus, and the dentate gyrus is a site of adult neurogenesis; that is, new neurons are continually generated in the adult dentate gyrus. To investigate mRNA and protein expression specific to the dentate gyrus, laser capture microdissection is often used. This method has some limitations, however, such as the need for special apparatuses and complicated handling procedures. In this video-recorded protocol, we demonstrate a dissection technique for removing the dentate gyrus from adult mouse under a stereomicroscope. Dentate gyrus samples prepared using this technique are suitable for any assay, including transcriptomic, proteomic, and cell biology analyses. We confirmed that the dissected tissue is dentate gyrus by conducting real-time PCR of dentate gyrus-specific genes, tryptophan 2,3-dioxygenase (TDO2) and desmoplakin (Dsp), and Ammon's horn enriched genes, Meis-related gene 1b (Mrg1b) and TYRO3 protein tyrosine kinase 3 (Tyro3). The mRNA expressions of TDO2 and Dsp in the dentate gyrus samples were detected at obviously higher levels, whereas Mrg1b and Tyro3 were lower levels, than those in the Ammon's horn samples. To demonstrate the advantage of this method, we performed DNA microarray analysis using samples of whole hippocampus and dentate gyrus. The mRNA expression of TDO2 and Dsp, which are expressed selectively in the dentate gyrus, in the whole hippocampus of alpha-CaMKII+/- mice, exhibited 0.037 and 0.10-fold changes compared to that of wild-type mice, respectively. In the isolated dentate gyrus, however, these expressions exhibited 0.011 and 0.021-fold changes compared to that of wild-type mice, demonstrating that gene expression changes in dentate gyrus can be detected with greater sensitivity. Taken together, this convenient and accurate dissection technique can be reliably used for studies focused on the dentate gyrus.

A dissection technique for removal of the dentate gyrus from adult mouse under a stereomicroscope was demonstrated in this video-recorded protocol.

تشريح التلفيف المسنن من الحصين ماوس الكبار

The hippocampus is one of the most widely studied areas in the brain because of its important functional role in memory processing and learning, its ...

Agarose Gel Electrophoresis for the Separation of DNA Fragments

Agarose gel electrophoresis is the most effective way of separating DNA fragments of varying sizes ranging from 100 bp to 25 kb1. Agarose is isolated from the seaweed genera Gelidium and Gracilaria, and consists of repeated agarobiose (L- and D-galactose) subunits2. During gelation, agarose polymers associate non-covalently and form a network of bundles whose pore sizes determine a gel&#39;s molecular sieving properties. The use of agarose gel electrophoresis revolutionized the separation of DNA. Prior to the adoption of agarose gels, DNA was primarily separated using sucrose density gradient centrifugation, which only provided an approximation of size. To separate DNA using agarose gel electrophoresis, the DNA is loaded into pre-cast wells in the gel and a current applied. The phosphate backbone of the DNA (and RNA) molecule is negatively charged, therefore when placed in an electric field, DNA fragments will migrate to the positively charged anode. Because DNA has a uniform mass/charge ratio, DNA molecules are separated by size within an agarose gel in a pattern such that the distance traveled is inversely proportional to the log of its molecular weight3. The leading model for DNA movement through an agarose gel is &#34;biased reptation&#34;, whereby the leading edge moves forward and pulls the rest of the molecule along4. The rate of migration of a DNA molecule through a gel is determined by the following: 1) size of DNA molecule; 2) agarose concentration; 3) DNA conformation5; 4) voltage applied, 5) presence of ethidium bromide, 6) type of agarose and 7) electrophoresis buffer. After separation, the DNA molecules can be visualized under uv light after staining with an appropriate dye. By following this protocol, students should be able to: 
 
1. Understand the mechanism by which DNA fragments are separated within a gel matrix 
2. Understand how conformation of the DNA molecule will determine its mobility through a gel matrix 
3. Identify an agarose solution of appropriate concentration for their needs 
4. Prepare an agarose gel for electrophoresis of DNA samples 
5. Set up the gel electrophoresis apparatus and power supply 
6. Select an appropriate voltage for the separation of DNA fragments 
7. Understand the mechanism by which ethidium bromide allows for the visualization of DNA bands 
8. Determine the sizes of separated DNA fragments 
&#160;

A basic protocol for the separation of DNA fragments using agarose gel electrophoresis is described.

الاغاروز الكهربائي للهلام لفصل أجزاء الحمض النووي

Agarose gel electrophoresis is the most effective way of separating DNA fragments of varying sizes ranging from 100 bp to 25 kb1. Agarose is isolated from ...

Rapid Genetic Analysis of Epithelial-Mesenchymal Signaling During Hair Regeneration

Hair follicle morphogenesis, a complex process requiring interaction between epithelia-derived keratinocytes and the underlying mesenchyme, is an attractive model system to study organ development and tissue-specific signaling. Although hair follicle development is genetically tractable, fast and reproducible analysis of factors essential for this process remains a challenge. Here we describe a procedure to generate targeted overexpression or shRNA-mediated knockdown of factors using lentivirus in a tissue-specific manner. Using a modified version of a hair regeneration model 5, 6, 11, we can achieve robust gain- or loss-of-function analysis in primary mouse keratinocytes or dermal cells to facilitate study of epithelial-mesenchymal signaling pathways that lead to hair follicle morphogenesis. We describe how to isolate fresh primary mouse keratinocytes and dermal cells, which contain dermal papilla cells and their precursors, deliver lentivirus containing either shRNA or cDNA to one of the cell populations, and combine the cells to generate fully formed hair follicles on the backs of nude mice. This approach allows analysis of tissue-specific factors required to generate hair follicles within three weeks and provides a fast and convenient companion to existing genetic models.

Tissue-specific analysis of a hair follicle regeneration model using lentivirus to mediate gain- or loss-of-function.

تحليل سريع لالوراثية طلائي-الوسيطة اشارة خلال تجديد الشعر

Hair follicle morphogenesis, a complex process requiring interaction between epithelia-derived keratinocytes and the underlying mesenchyme, is an ...

Alternative Cultures for Human Pluripotent Stem Cell Production, Maintenance, and Genetic Analysis

Human pluripotent stem cells (hPSCs) hold great promise for regenerative medicine and biopharmaceutical applications. Currently, optimal culture and efficient expansion of large amounts of clinical-grade hPSCs are critical issues in hPSC-based therapies. Conventionally, hPSCs are propagated as colonies on both feeder and feeder-free culture systems. However, these methods have several major limitations, including low cell yields and generation of heterogeneously differentiated cells. To improve current hPSC culture methods, we have recently developed a new method, which is based on non-colony type monolayer (NCM) culture of dissociated single cells. Here, we present detailed NCM protocols based on the Rho-associated kinase (ROCK) inhibitor Y-27632. We also provide new information regarding NCM culture with different small molecules such as Y-39983 (ROCK I inhibitor), phenylbenzodioxane (ROCK II inhibitor), and thiazovivin (a novel ROCK inhibitor). We further extend our basic protocol to cultivate hPSCs on defined extracellular proteins such as the laminin isoform 521 (LN-521) without the use of ROCK inhibitors. Moreover, based on NCM, we have demonstrated efficient transfection or transduction of plasmid DNAs, lentiviral particles, and oligonucleotide-based microRNAs into hPSCs in order to genetically modify these cells for molecular analyses and drug discovery. The NCM-based methods overcome the major shortcomings of colony-type culture, and thus may be suitable for producing large amounts of homogeneous hPSCs for future clinical therapies, stem cell research, and drug discovery.

Here, we present human pluripotent stem cell (hPSC) culture protocols, based on non-colony type monolayer (NCM) growth of dissociated single cells. This new method, utilizing Rho-associated kinase inhibitors or the laminin isoform 521 (LN-521), is suitable for producing large amounts of homogeneous hPSCs, genetic manipulation, and drug discovery.

الثقافات البديلة لافرة القوة البشرية الجذعية إنتاج الخلية، الصيانة، والتحليل الوراثي

Human pluripotent stem cells (hPSCs) hold great promise for regenerative medicine and biopharmaceutical applications. Currently, optimal culture and ...