Bu protokol, Institut de biologie fiziko-Chimique, Paris, Fransa&#39;da Francis-André Wollman laboratuvarda öğrenilen teknikleri dayanmaktadır. Yazarların aslında Chlamydomonas genetik teknikleri DBS tanıttı Jacqueline Girard-Bascou, şükran borçluyuz. Yazarların laboratuar Chlamydomonas araştırma, Ulusal Bilim Vakfı ödülü MCB-0646350 tarafından destekleniyor .

Bölüm 1: gametogenezis için suşlarının Hazırlık Not: Tüm manipülasyonlar oda sıcaklığında yapılmalıdır. Yüksek veya düşük sıcaklıklarda Zigot çimlenme hızını etkileyebilir ve canlılığını olumsuz yönde etkileyebilir. Önemli göz: evlendirilmeyecek suşları sağlam büyüyen ve kirlenmesine neden olan mantar veya bakteri olduklarını şarttır. Suşları düzenli olarak devredilmiştir varsa, zengin ortamda geçişi gamet nesil önce gerekir. <ol><li> Evlendirilmeyecek Suşlarının TAP levhalar (100 × 15 mm), plaka başına 1-2 suşları üzerine aktarılır. Hücreler, yaklaşık 1 cm genişlikte konsantre bir şerit büyüdü olmalıdır. </li><li> Sağlam büyüyen hücreleri kalın bir tabaka kadar TAP plakalar üzerinde Kuluçka gerekirse ara transferleri ile devam etmelidir. Düzenli kullanım yabani tip suşlar, bir kaç gün ve hiçbir geçişleri sadece sürebilir ancak son zamanlarda geçişli henüz Suşlarının, bir geçit ve 1 hafta olmak üzere toplam gerekebilir. Işığa duyarlı Mutants ek süre isteyebilir. </li><li> Azot eksikliği vardır ve gametogenezis ikna etmek için başlayacak N10 tabak, TAP plakalar tüm hücreleri aktarın. TAP plaka üzerine kadar kalın bir levha gibi hücrelerin aktarın. Bu hücrelerin daha sonraki toplama kolaylaştıracaktır. N10 3 gün sonra, hücreleri gametogenezis geçmesi hazırlanmıştır. Hücre bölünmesi N10 yavaş olur, ancak hücreleri koyu yeşil kalmalıdır. Canlı zigot elde olmayacak gibi herhangi bir kontamine suşları atılmalıdır. </li></ol> Bölüm 2: Çiftleşme <ol><li> Her suş 50 ml erlen aktarılır ve yaklaşık 2,5 ml steril distile su ile yeniden süspanse. Bu, ya bir tel döngü ya da steril bir sopa kullanarak yapılabilir; neyin önemli olduğunu, hücrelerin yığınlarda iyi askıya değildir bu. Kesin su hacmi göz tarafından ölçülür hücre konsantrasyonu, her bir suş için yaklaşık aynı şekilde ayarlanmalıdır. </li><li> Hücreler 2 saat boyunca kuvvetli ışık altında (1.260 μ E / m 2 / sn) telaşlı, heyecanlı, hareketli gamet hücreleri olacak ve bu süre boyunca. Motilite ışık mikroskobu altında kontrol edilmelidir. Gamet kötü yüzme iseniz, çiftleşme verimsiz olması muhtemeldir. Ancak, kötü hareketli suşlar bile daha düşük bir frekans arkadaşı. </li><li> Sonraki eşit hacimleri mt + ve mt-gamet tek bir 50 ml ölçülü balona birleştirilir. Gamet ajitasyon olmadan güçlü ışık (1.260 μ E / m 2 / sn) altında bırakılır. </li><li> Çiftleşme ışık mikroskobu altında hemen kontrol edilebilir. Gametlerin çiftleri hızla formu ve hızlı hareket eden hücreler kamçı olarak katıldı görünecektir. Çiftleşme son derece hızlı olması belirirse, örnekler zigot bir nesil için 30 dakika -1 saat içinde alınması gerekmektedir. Eğer değilse, bu isteğe bağlı olduğu halde, çiftleşme, her saat başı kontrol edilebilir. Zigot optimal yoğunluk vererek kez haç arasında yaygın olarak değişecektir, 1 saat, 2 saat, 3 saat ve 4 saat sonra gametler, örneğin birleştirerek sonra farklı zamanlarda çiftleşme karışımı hacimde almak en iyisidir. Plaka başına 3-4 noktalar; 300 mcL örnekleri TAP-3% Difco agar 60 × 15 mm plakalar aktararak yapılır. Bu çiftleşme çiftleri bozabilir çiftleşme karışımı karıştırma dikkatli olun. Düşük fiyatlı agars daha az kirletici maddeler ve mikroskop altında zigot görmek için daha kolay olacaktır çünkü Difco agar kullanılır. Kullanılmayan çiftleşme karışımı bir gecede balonuna sol ve çiftleşme tepki kalitesi ertesi gün açık olacak. Çiftleşme verimli, zigot balonun veya duvar dibine uyacaktır ve orta net görünecektir. Hatta balonun ajitasyon zigot çıkarmak için başarısız olacaktır. Hiçbir karışımı makul canlılığı ile çalkalanır cam çubukları, daha sonra çiftleşme verimsiz veya yer almadı. </li><li> Çiftleşme karışımı içeren TAP Difco plakaları, her yüzeyde sıvı emilmiş kadar aralık kapaklı, steril bir kaput kurutulur. Zygospore olgunlaşma sadece karanlıkta gerçekleşecek bu yana plakalar genellikle, daha sonra folyoya sarılı, 18 saat ışık (700 nE / m 2 / sn) bırakılır. Suşları, saat ve tarih çiftleşme plakaları ve folyo hem yazılı, geçti. Zigot çimlenme verimliliği giderek azalır rağmen Tabaklar, 5 ila 7 gün saklanır ve daha uzun tutulabilir. </li></ol> Bölüm 3: tetrad Diseksiyon <ol><li> Vejetatif hücreler bir neşter gibi sıkıcı bir bıçak kullanarak çiftleşme karışımı kuru noktalar, kazınmalı. Bıçak% 3 agar sıkıca sadık olacaktır zigot bir alan ortaya çıkarmak için kullanılabilir. Bu adım, genellikle zigot Ertesi sabah çimlenmiş var ki, öğleden sonra yapılır, ama bir ikinci, vejetatif bölünme uğramamış8 döl verimi. Chlamydomonas biyologlar hızla vejetatif hücreler daha büyük ve siyah bir taslak veren kalın bir zygospore duvar özelliği bu yana, mikroskop altında zigot tanımayı öğrenin. Zygospores genellikle sarı görünür ama aynı zamanda biraz yeşil olabilir. Vejetatif hücreler kolayca kenara taşınır en önemli karakteri, agar sopa. Ancak, plakalar halinde aşırı Bu durumda olmayacak kuru. Ayrıca, çiftleşme karışımı çok yoğun ise, zigot bireysel zigot transferi zor veya imkansız hale getirecek bir minder kurabilir. Uygun yoğunlukları adım 2.1 &#39;de kurulan ve tecrübesi ile hızlı bir şekilde öğrenmiş olacak. </li><li> Cam iğneler zigot toplama ve tetrad döl ayıran için hazırlanmıştır. Bu kopmuş olabilir, uzun, ince bir iplik üretmek için küçük bir alev 3 mm cam çubuklar çekerek hazırlanmıştır. Bu sivri uçları ipuçları, kancalar, düşük alev (örneğin alkol ya da yanan bir maç) kısa süreli ısıtma düzeltti veya bükülmüş. Özellikle deneyimsiz kullanıcılar için oldukça kolay kırılabilir, 3 veya daha fazla cam iğneler hazırlayın. </li><li> Zigot küçük bir kazık içine bir bardak iğne kullanılarak% 3 TAP Difco plaka üzerinde toplanmıştır. Zigot içeren agar bir kare (0.5 cm kadar 2) oluşan ve sıkıcı bir neşter kullanılarak eksize edilir. Sonra agar bloğu, 15 mm,% 1.5 TAP-Difco plaka üzerine yüzü aşağı gelecek şekilde yerleştirilir ve zigot dağıtmak için, yaklaşık 1,5 cm plakasının üst yatay bir çizgi boyunca kaydırdı. Üst yatay çizgi, ızgara, yaklaşık 1,5 cm yatay ve 0,5 cm dikey aralık ile plakaların arkasına kazınmış. Grid (ızgara da diseksiyon gün kazınacak) tetrad döl ayırmak için bir kılavuz olarak ertesi gün kullanılacaktır. Son olarak, bireysel zigot plaka başına 20-30 zigot, her bir dikey çizgi ile üst yatay çizgilerin kesişmeleri taşıyın. Disseke sadece 12 ya da olacak her zigot filizlenir değil, ve bazı patlama önce iki kez böleceğiz rağmen, bu kadar ekstra zigot ihtiyaç vardır. </li><li> Dağıtarak sonra yanlışlıkla% 3 agar plaka devredilmiştir zigot ve vejetatif hücreleri kloroform (1-2 mm) ince bir tabaka içeren bir cam tabak üzerinde 30 saniye boyunca ters plaka teşhir ederek öldürdü. Plaka ve kloroform arasındaki mesafe yaklaşık 5 cm olmalıdır. Çok kloroform kullanıldığında ise mesafe çok küçük ya da büyük olup olmadığını, ya da bir riskleri ya zigot öldürme, ya da vejetatif hücreleri öldürerek değil. Zygospores seçiciliği sağlamak için, çimlenme plaka dağıtılmıştır sonra kloroform tedavi hemen yapılmalıdır. </li><li> Çimlenme suşlarının çoğu 16-20 saat sürer, ancak genotip ve zigot yaşı ile değişecektir. Çimlenme için, plakalar düşük ışık (239 nE / m 2 / sn) altında yerleştirilir, ya da orta ışığında bir doku ile plaka kapsayan soluk . </li><li> Çimlendirilmiş zigot, içlerinde kızı hücreleri ile şişmiş ya da bazen patlama hücreler olarak mikroskop altında tespit edilebilir. Zygospore rüptüre değilse çimlenme meydana varsa, bir cam iğne ile hafifçe dokunarak duvarı kıracak. Kızı hücreleri hafifçe zigot altındaki grid noktaları sürüklenebilir. Agar serbest cam iğne basıncı ile sıvı bir ortamda küçük bir miktar hücre yakalama ve iğne arkasında bu &quot;su birikintisi&quot; sürükleyerek bunu kolayıdır. &quot;Sigorta&quot;, tek bir zigot ve iki kez bölünmüş olan bir vejetatif hücre disseke olduğu bir form dışında dört kızı hücreleri, zygospore duvar &quot;deri&quot; olarak kalacaktır. </li><li> Sonraki analiz için görünür clonies alınabilir kadar disseke döl uygun koşullar altında yetiştiriliyor. Tabaklar kirlenme günlük olarak takip edilmelidir. </li></ol> Not: vejetatif diploitler nesil burada ele, ama aslında her iki ebeveyn suşu büyümeyi desteklemek orta çiftleşme karışım kaplama içerir, ancak büyüme diploid (örneğin iki farklı auxotropic belirteçleri) destek verecek değildir. Tabaklar, zigot oluşumunu önlemek için ışık tutulur.

<ol>
	<li>Harris, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Chlamydomonas+Sourcebook:+Introduction+to+Chlamydomonas+and+Its+Laboratory+Use.">The Chlamydomonas Sourcebook: Introduction to Chlamydomonas and Its Laboratory Use.</a> Conf Proc IEEE Eng Med Biol Soc. , 119-273 (2005).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Genetik analiz Chlamydomonas basit, ama özellikle teknikleri gamet ve ayrı tetrad döl oluşturmak için gereklidir. Sağlıklı soylarının teknikleri kolayca elde edilir. Bazı mutant suşları ile bir sanat daha fazla olur ve okuyucular, tarihsel notlar ve pratik ipuçları yakın zamanda yayınlanan Chlamydomonas Kaynak Kitabı, Cilt 1 bakmalıdır. Ayrıca, bu temel tema çok varyasyon Zigot dağıtım ve diseksiyon desen, indükleyici gametogenezis yöntemi arasında değişen, yukarıda açı...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>CC-125</td>
<td>Mating type plus strain</td>
<td>Chlamydomonas Stock Center</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>CC-124</td>
<td>Mating type minus strain</td>
<td>Chlamydomonas Stock Center</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Tris-Acetate-Phosphate (TAP) </td>
<td>Growth medium</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>N10</td>
<td>Growth medium</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Difco agar</td>
<td>Reagent</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Fisherbrand Stainless-Steel Blades</td>
<td>Tools</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>08-916-5B</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>BD Surgical Blade Handles</td>
<td>Tools</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>08-914-5</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Fisherbrand Metal Scalpels</td>
<td>Tools</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>08-920A</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

mating and tetrad separation of chlamydomonas reinhardtii for genetic analysis

Tek hücreli yeşil alg<em&gt; Chlamydomonas reinhardtii</em&gt; (<em&gt; Chlamydomonas</em&gt;), Basit bir yaşam döngüsü nedeniyle, hücre biyolojisi ve genetik çeşitli alanlarda araştırma için popüler bir organizma haline gelmiştir, genetik analiz, genomik kaynakları ve çekirdeğinde, transformability ve her iki organelleri büyüme ve manipülasyon kolaylığı. Çiftleşme suşlarının genetik yaklaşımlar kullanıldığında yaygın bir uygulamadır<em&gt; Chlamydomonass</em&gt; Hâkimiyet analizi için vejetatif diploitler oluşturmak ya da tespit nükleer vs organel miras tetrad diseksiyonu aşağıdaki allelism test etmek, epistasy analiz etmek veya harita tabanlı klonlama amaçlı nüfus oluşturmak için. Ayrıca, genetik haçlar rutin organel genotipleri özellikle nükleer genotipleri ile birleştirmek için kullanılır. Burada gametogenezis, çiftleşme, zigot çimlenme ve tetrad ayrılması için standart yöntemler göstermektedir. Bu protokol daha az aşina olan bilim adamları genetik yaklaşımlar müsait hale getirecek adımların takip edilmesi kolay bir serisi<em&gt; Chlamydomonas</em&gt;. Temel parametreleri ve sorunlu noktalar açıklanmıştır. Son olarak, daha fazla bilgi ve alternatif yöntemleri için kaynaklar sağlanmaktadır.

Watch this Scientific Journal Video about Mating and Tetrad Separation of Chlamydomonas reinhardtii for Genetic Analysis at JoVE.com

Mating and Tetrad Separation of Chlamydomonas reinhardtii for Genetic Analysis

Çiftleşme ve tetrad ayrılması genetik analiz için gerekli olan<em&gt; Chlamydomonas reinhardtii</em&gt;. Burada gametogenezis, çiftleşme, zigot çimlenme ve tetrad diseksiyon için standart yöntemler göstermektedir. Bu protokol daha az aşina olan bilim adamları genetik yaklaşımlar müsait hale getirecek adımların takip edilmesi kolay bir serisi<em&gt; Chlamydomonas</em&gt;.

Çiftleşme ve tetrad Ayırma Chlamydomonas reinhardtii Genetik Analiz

The unicellular green alga Chlamydomonas reinhardtii (Chlamydomonas) has become a popular organism for research in diverse areas of cell biology and ...

mating-tetrad-separation-chlamydomonas-reinhardtii-for-genetic

Research

JoVE Journal

Biology

Mating and Tetrad Separation of Chlamydomonas reinhardtii for Genetic Analysis

19.9K Görüntüleme.  Cornell University. Çiftleşme ve tetrad ayrılması genetik analiz için gerekli olan Chlamydomonas reinhardtii. Burada gametogenezis, çiftleşme, zigot çimlenme ve tetrad diseksiyon için standart yöntemler göstermektedir. Bu protokol daha az aşina olan bilim adamları genetik yaklaşımlar müsait hale getirecek adımların takip edilmesi kolay bir serisi Chlamydomonas.

Video: Mating and Tetrad Separation of Chlamydomonas reinhardtii for Genetic Analysis

Light/dark Transition Test for Mice

Although all of the mouse genome sequences have been determined, we do not yet know the functions of most of these genes. Gene-targeting techniques, however, can be used to delete or manipulate a specific gene in mice. The influence of a given gene on a specific behavior can then be determined by conducting behavioral analyses of the mutant mice. As a test for behavioral phenotyping of mutant mice, the light/dark transition test is one of the most widely used tests to measure anxiety-like behavior in mice. The test is based on the natural aversion of mice to brightly illuminated areas and on their spontaneous exploratory behavior in novel environments. The test is sensitive to anxiolytic drug treatment. The apparatus consists of a dark chamber and a brightly illuminated chamber. Mice are allowed to move freely between the two chambers. The number of entries into the bright chamber and the duration of time spent there are indices of bright-space anxiety in mice. To obtain phenotyping results of a strain of mutant mice that can be readily reproduced and compared with those of other mutants, the behavioral test methods should be as identical as possible between laboratories. The procedural differences that exist between laboratories, however, make it difficult to replicate or compare the results among laboratories. Here, we present our protocol for the light/dark transition test as a movie so that the details of the protocol can be demonstrated. In our laboratory, we have assessed more than 60 strains of mutant mice using the protocol shown in the movie. Those data will be disclosed as a part of a public database that we are now constructing.

Visualization of the protocol will facilitate understanding of the details of the entire experimental procedure, allowing for standardization of the protocols used across laboratories and comparisons of the behavioral phenotypes of various strains of mutant mice assessed using this test.

The light/dark transition test is one of the most widely used tests to measure anxiety-like behavior in mice. Here, we present a movie that shows detailed procedures on how we conduct the test.

Fareler için açık / koyu Geçiş Testi

Although all of the mouse genome sequences have been determined, we do not yet know the functions of most of these genes. Gene-targeting techniques, ...

Biyoloji

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo (New Culture)

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying  the formation and patterning of brain, neural tube, somite and heart primordia. Applications of chick embryo culture include electroporation of DNA or RNA constructs in order to analyze gene function, grafts of growth factor coated beads such as FGFs and BMPs , as well as whole mount in situ hybridization and immunohistochemistry. This video demonstrates the different steps in chick embryo culture; First, the embryo is explanted in saline. Then, the embryo is centered on a glass ring. The membranes surrounding the embryo are lifted along the walls of the ring. The ring is then placed in a culture dish containing a pool of albumine. The culture dish is sealed and placed in a humid chamber, where the embryo is cultured for up to 24 hrs. Finally, the embryo is removed from the ring, fixed and processed for further applications. A troubleshooting guide is also presented.

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo New Culture

This video demonstrates New culture, a method by which chick embryos are cultured outside the egg for up to 24 hr. This method enables one to study early development (primitive streak to 14 som.), a period corresponding to E7-9 in mouse. Applications of this technique include electroporation, in situ hybridization and immunohistochemistry.

Erken Civciv Embriyolar ex vivo (Kültür) Kültür Yöntemi

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

Double Whole Mount in situ Hybridization of Early Chick Embryos

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying  gene expression in brain, neural tube, somite and heart primordia formation. This video demonstrates the different steps in 2-color whole mount in situ hybridization; First, the embryo is dissected from the egg and fixed in paraformaldehyde. Second, the embryo is processed for prehybridization. The embryo is then hybridized with two different probes, one coupled to DIG, and one coupled to FITC.  Following overnight hybridization, the embryo is incubated with DIG coupled antibody. Color reaction for DIG substrate is performed, and the region of interest appears blue. The embryo is then incubated with FITC coupled antibody. The embryo is processed for color reaction with FITC, and the region of interest appears red. Finally, the embryo is fixed and processed for phtograph and sectioning. A troubleshooting guide is also presented.

This video demonstrates 2-color whole mount in situ hybridization, a method by which the spatial and temporal expression pattern of 2 different genes can be visualized in young chick embryos. This method was originally introduced by David Wilkinson, Domingos Henrique, Phil Ingham and David Ish -Horowicz.

Erken Civciv Embriyolar in situ Hibridizasyon Çift Tüm Dağı

Method for Whole Mount Antibody Staining in Chick

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying antibody expression in developing brain, neural tube and somite. This video demonstrates the different steps in whole-mount antibody staining using HRP conjugated secondary antibodies; First, the embryo is dissected from the egg and fixed in paraformaldehyde. Second, endogenous peroxidase is inactivated; The embryo is then exposed to primary antibody. After several washes, the embryo is incubated with secondary antibody conjugated to HRP. Peroxidase activity is revealed using reaction with diaminobenzidine substrate. Finally, the embryo is fixed and processed for photography and sectioning. The advantage of this method over the use of fluorescent antibodies is that embryos can be processed for wax sectioning, thus enabling the study of antigen sites in cross section. This method was originally introduced by Jane Dodd and Tom Jessell 1.

This video demonstrates whole mount immunohistochemistry, a method by which the spatial and temporal expression pattern of an antigen can be visualized in young chick embryos. This method was originally introduced by Jane Dodd and Tom Jessell.

Chick Tüm Dağı Antikor Boyama Yöntemi

Assay for Neural Induction in the Chick Embryo

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying the formation and initial patterning of the nervous system. This video demonstrates how to graft organizer tissue into a host, a method by which Hensen s node (the organizer in the chick embryo) is grafted to a host competent ectoderm. The organizer graft instructs overlying na ve tissue to adopt a neural fate via neural inducing signals. This mechanism is referred to as neural induction, and constitutes the initial step in the formation of brain and spinal cord in amniotes. This method is essentially used for the characterization of putative neural inducing molecules in chick. This video demonstrates the different steps in the assay for neural induction; First, the donnor embryo is explanted and pinned on a dish. Then, the host embryo is prepared for New culture. The graft is excised and transplanted to the host area pellucida margin. The host is cultured for 18-22 hrs. The assembly is fixed and processed for further applications (e.g. in situ hybridization). This method was originally devised by Waddington 1,2 and Gallera 3,4.

Neural induction is the first step in the formation of the brain. It is a mechanism by which Hensen's node (organizer), instructs adjacent tissue to adopt a neural fate, i.e. to give rise to the nervous system. This video demonstrates an assay for neural induction in chick embryo.

Civciv Embriyo Sinir İndüksiyon için Testi

A Neuronal and Astrocyte Co-Culture Assay for High Content Analysis of Neurotoxicity

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing measurement of multiple cellular phenotypes within a single assay. In this study, we utilized HCA to develop a novel assay for neurotoxicity. Neurotoxicity assessment represents an important part of drug safety evaluation, as well as being a significant focus of environmental protection efforts. Additionally, neurotoxicity is also a well-accepted in vitro marker of the development of neurodegenerative diseases such as Alzheimer's and Parkinson's diseases. Recently, the application of HCA to neuronal screening has been reported. By labeling neuronal cells with &beta;III-tubulin, HCA assays can provide high-throughput, non-subjective, quantitative measurements of parameters such as neuronal number, neurite count and neurite length, all of which can indicate neurotoxic effects. However, the role of astrocytes remains unexplored in these models. Astrocytes have an integral role in the maintenance of central nervous system (CNS) homeostasis, and are associated with both neuroprotection and neurodegradation when they are activated in response to toxic substances or disease states. GFAP is an intermediate filament protein expressed predominantly in the astrocytes of the CNS. Astrocytic activation (gliosis) leads to the upregulation of GFAP, commonly accompanied by astrocyte proliferation and hypertrophy. This process of reactive gliosis has been proposed as an early marker of damage to the nervous system. The traditional method for GFAP quantitation is by immunoassay. This approach is limited by an inability to provide information on cellular localization, morphology and cell number. We determined that HCA could be used to overcome these limitations and to simultaneously measure multiple features associated with gliosis - changes in GFAP expression, astrocyte hypertrophy, and astrocyte proliferation - within a single assay. In co-culture studies, astrocytes have been shown to protect neurons against several types of toxic insult and to critically influence neuronal survival. Recent studies have suggested that the use of astrocytes in an in vitro neurotoxicity test system may prove more relevant to human CNS structure and function than neuronal cells alone. Accordingly, we have developed an HCA assay for co-culture of neurons and astrocytes, comprised of protocols and validated, target-specific detection reagents for profiling &beta;III-tubulin and glial fibrillary acidic protein (GFAP). This assay enables simultaneous analysis of neurotoxicity, neurite outgrowth, gliosis, neuronal and astrocytic morphology and neuronal and astrocytic development in a wide variety of cellular models, representing a novel, non-subjective, high-throughput assay for neurotoxicity assessment. The assay holds great potential for enhanced detection of neurotoxicity and improved productivity in neuroscience research and drug discovery.

This article describes a novel protocol and reagent set designed for sensitive measurement of neurotoxic effects of compounds and treatments on co-cultures of neurons and astrocytes using high content analysis. Results demonstrate that high content analysis represents an exciting novel technology for neurotoxicity assessment.

Nörotoksisite Yüksek İçerik Analizi Nöronal ve Astrosit Hücre Co-Kültür Testi

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing ...

Dissection of Hippocampal Dentate Gyrus from Adult Mouse

The hippocampus is one of the most widely studied areas in the brain because of its important functional role in memory processing and learning, its remarkable neuronal cell plasticity, and its involvement in epilepsy, neurodegenerative diseases, and psychiatric disorders. The hippocampus is composed of distinct regions; the dentate gyrus, which comprises mainly granule neurons, and Ammon's horn, which comprises mainly pyramidal neurons, and the two regions are connected by both anatomic and functional circuits. Many different mRNAs and proteins are selectively expressed in the dentate gyrus, and the dentate gyrus is a site of adult neurogenesis; that is, new neurons are continually generated in the adult dentate gyrus. To investigate mRNA and protein expression specific to the dentate gyrus, laser capture microdissection is often used. This method has some limitations, however, such as the need for special apparatuses and complicated handling procedures. In this video-recorded protocol, we demonstrate a dissection technique for removing the dentate gyrus from adult mouse under a stereomicroscope. Dentate gyrus samples prepared using this technique are suitable for any assay, including transcriptomic, proteomic, and cell biology analyses. We confirmed that the dissected tissue is dentate gyrus by conducting real-time PCR of dentate gyrus-specific genes, tryptophan 2,3-dioxygenase (TDO2) and desmoplakin (Dsp), and Ammon's horn enriched genes, Meis-related gene 1b (Mrg1b) and TYRO3 protein tyrosine kinase 3 (Tyro3). The mRNA expressions of TDO2 and Dsp in the dentate gyrus samples were detected at obviously higher levels, whereas Mrg1b and Tyro3 were lower levels, than those in the Ammon's horn samples. To demonstrate the advantage of this method, we performed DNA microarray analysis using samples of whole hippocampus and dentate gyrus. The mRNA expression of TDO2 and Dsp, which are expressed selectively in the dentate gyrus, in the whole hippocampus of alpha-CaMKII+/- mice, exhibited 0.037 and 0.10-fold changes compared to that of wild-type mice, respectively. In the isolated dentate gyrus, however, these expressions exhibited 0.011 and 0.021-fold changes compared to that of wild-type mice, demonstrating that gene expression changes in dentate gyrus can be detected with greater sensitivity. Taken together, this convenient and accurate dissection technique can be reliably used for studies focused on the dentate gyrus.

A dissection technique for removal of the dentate gyrus from adult mouse under a stereomicroscope was demonstrated in this video-recorded protocol.

Yetişkin Mouse Hipokampal dentat girus diseksiyonu

The hippocampus is one of the most widely studied areas in the brain because of its important functional role in memory processing and learning, its ...

Rapid Genetic Analysis of Epithelial-Mesenchymal Signaling During Hair Regeneration

Hair follicle morphogenesis, a complex process requiring interaction between epithelia-derived keratinocytes and the underlying mesenchyme, is an attractive model system to study organ development and tissue-specific signaling. Although hair follicle development is genetically tractable, fast and reproducible analysis of factors essential for this process remains a challenge. Here we describe a procedure to generate targeted overexpression or shRNA-mediated knockdown of factors using lentivirus in a tissue-specific manner. Using a modified version of a hair regeneration model 5, 6, 11, we can achieve robust gain- or loss-of-function analysis in primary mouse keratinocytes or dermal cells to facilitate study of epithelial-mesenchymal signaling pathways that lead to hair follicle morphogenesis. We describe how to isolate fresh primary mouse keratinocytes and dermal cells, which contain dermal papilla cells and their precursors, deliver lentivirus containing either shRNA or cDNA to one of the cell populations, and combine the cells to generate fully formed hair follicles on the backs of nude mice. This approach allows analysis of tissue-specific factors required to generate hair follicles within three weeks and provides a fast and convenient companion to existing genetic models.

Tissue-specific analysis of a hair follicle regeneration model using lentivirus to mediate gain- or loss-of-function.

Saç Rejenerasyon sırasında epitelyal-mezenkimal Sinyal Rapid Genetik Analizi

Hair follicle morphogenesis, a complex process requiring interaction between epithelia-derived keratinocytes and the underlying mesenchyme, is an ...

Alternative Cultures for Human Pluripotent Stem Cell Production, Maintenance, and Genetic Analysis

Human pluripotent stem cells (hPSCs) hold great promise for regenerative medicine and biopharmaceutical applications. Currently, optimal culture and efficient expansion of large amounts of clinical-grade hPSCs are critical issues in hPSC-based therapies. Conventionally, hPSCs are propagated as colonies on both feeder and feeder-free culture systems. However, these methods have several major limitations, including low cell yields and generation of heterogeneously differentiated cells. To improve current hPSC culture methods, we have recently developed a new method, which is based on non-colony type monolayer (NCM) culture of dissociated single cells. Here, we present detailed NCM protocols based on the Rho-associated kinase (ROCK) inhibitor Y-27632. We also provide new information regarding NCM culture with different small molecules such as Y-39983 (ROCK I inhibitor), phenylbenzodioxane (ROCK II inhibitor), and thiazovivin (a novel ROCK inhibitor). We further extend our basic protocol to cultivate hPSCs on defined extracellular proteins such as the laminin isoform 521 (LN-521) without the use of ROCK inhibitors. Moreover, based on NCM, we have demonstrated efficient transfection or transduction of plasmid DNAs, lentiviral particles, and oligonucleotide-based microRNAs into hPSCs in order to genetically modify these cells for molecular analyses and drug discovery. The NCM-based methods overcome the major shortcomings of colony-type culture, and thus may be suitable for producing large amounts of homogeneous hPSCs for future clinical therapies, stem cell research, and drug discovery.

Here, we present human pluripotent stem cell (hPSC) culture protocols, based on non-colony type monolayer (NCM) growth of dissociated single cells. This new method, utilizing Rho-associated kinase inhibitors or the laminin isoform 521 (LN-521), is suitable for producing large amounts of homogeneous hPSCs, genetic manipulation, and drug discovery.

İnsan Pluripotent için alternatif Kültürleri Hücre Üretim, Bakım ve Genetik Analizi Kök

Human pluripotent stem cells (hPSCs) hold great promise for regenerative medicine and biopharmaceutical applications. Currently, optimal culture and ...

DNA Electroporation, Isolation and Imaging of Myofibers

Mature muscle has a unique structure that is amenable to live cell imaging. Herein, we describe the experimental protocol for expressing fluorescently labeled proteins in the flexor digitorum brevis (FDB) muscle. Conditions have been optimized to provide a large number of high quality myofibers expressing the electroporated plasmid while minimizing muscle damage. The method employs fluorescent tags on various proteins. Combining this expression method with high resolution confocal microscopy permits live cell imaging, including imaging after laser-induced damage. Fluorescent dyes combined with imaging of fluorescently-tagged proteins provides information regarding the basic structure of muscle and its response to stimuli.

This protocol utilizes electroporation to introduce and express fluorescently labeled proteins in mouse muscle fibers. Following recovery after electroporation, fibers are isolated. Individual fibers are then imaged using high resolution confocal microscopy to visualize muscle structure.

DNA Elektroporasyon, Myofibers İzolasyon ve Görüntüleme

Mature muscle has a unique structure that is amenable to live cell imaging. Herein, we describe the experimental protocol for expressing fluorescently ...