פרוטוקול זה מבוסס על הטכניקות שנלמדו במעבדה של פרנסיס, אנדרה וולמן על צרפת Institut de Biologie פיסיקלי Chimique, פריז. המחברים חבים חוב של הכרת תודה ז&#39;קלין Girard-Bascou, אשר במקור הציג DBS טכניקות Chlamydomonas גנטית. Chlamydomonas מחקר במעבדה של המחברים הוא נתמך על ידי הקרן הלאומית למדע פרס MCB-0646350.

חלק 1: הכנת זנים עבור gametogenesis הערה: כל המניפולציות צריך להתבצע בטמפרטורת החדר. טמפרטורות גבוהות או נמוכות ישפיע על מהירות של נביטה הזיגוטה ועלול להשפיע לרעה על יכולת הקיום. שיקול חשוב: זה חיוני כי הזנים להיות הזדווגו גדלים וחסונה הם ללא זיהום פטריות או חיידקים. אם זנים לא הועברו באופן קבוע, מעבר על מדיום עשיר צריך להקדים דור של גמטות. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זנים להיות הזדווגו מועברים על גבי צלחות TAP (100 × 15 מ&quot;מ), 1-2 זנים לכל צלחת. התאים צריכים להיות בוגרים ברצועה מרוכז על 1 ס&quot;מ רוחב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה על צלחות TAP צריך להמשיך עד שכבה עבה של וחסונה גידול תאים קיים, עם העברות ביניים במידת הצורך. זנים שלא היה passaged לאחרונה עשויים לדרוש מעבר וכן סך של שבוע 1, בעוד wild-type זנים בשימוש רגיל יכול לקחת רק כמה ימים ולא מעברים. מוטציות כי הם רגישים לאור עשויה לדרוש זמן נוסף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת כל התאים מהצלחות הברז צלחות N10, אשר חסרים עבור חנקן יתחילו לגרום gametogenesis. העברת התאים כמו פרוסה עבה, כמה שהם היו נוכחים על הצלחת TAP. זה יקל אוסף הבאים של התאים. אחרי 3 ימים על N10, התאים מוכנים לעבור gametogenesis. חלוקת התא תהיה איטית על N10, לעומת זאת תאים צריך להישאר בצבע ירוק כהה. כל הזנים מזוהמים אמור להיות מושלך כמו zygotes קיימא לא תושג. </li></ol> חלק 2: הזדווגות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כל זן מועבר לתוך בקבוק erlenmeyer 50 מ&quot;ל ו resuspended במים כ -2.5 מ&quot;ל סטרילי מזוקקים. ניתן לעשות זאת גם באמצעות לולאה חוט או מקל סטרילי, מה שחשוב הוא כי התאים מושעים טוב ולא גושים. הנפח המדויק של המים צריך להיות מותאם כך ריכוז התא, נמדד לפי העין, הוא בערך אותו דבר עבור כל זן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאים הם נסערים תחת אור חזק (1.260 E μ / m 2 / sec) למשך 2 שעות, שבמהלכן התאים יהפכו הגמטות ניעתי. תנועתיות צריך להיבדק תחת מיקרוסקופ אור. אם הגמטות הם שוחים גרוע, ההזדווגות עשוי להיות יעיל. עם זאת, אפילו גרוע זנים ניעתי יהיה בן זוג בתדירות מופחתת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשלב הבא, כרכים שווה של הר + ו-MT-הגמטות משולבים לתוך בקבוק אחד 50 מ&quot;ל. הגמטות נותרים תחת אור חזק (1.260 E μ / m 2 / sec) ללא תסיסה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזדווגות ניתן לבדוק מיד תחת מיקרוסקופ אור. זוגות של הגמטות צורה במהירות, יופיע התאים נע במהירות הצטרף ב שוטונים. אם הזיווג נראה מהיר מאוד, יש לקחת דגימות בתוך שעות 30 דקות -1 עבור הדור של zygotes. אם לא, הזדווגות ניתן לבדוק בכל שעה, אם כי זו היא אופציונלית. מאז פעמים נותן את צפיפות אופטימלי של zygotes ישתנו נרחב בין צלבים, עדיף לקחת aliquots של התערובת ההזדווגות בזמנים שונים לאחר שילוב גמטות, למשל לאחר 1 שעה, 2 שעות, 3 שעות ו - 4 שעות. הדבר נעשה על ידי העברת 300 דגימות μL לברז-3% אגר Difco 60 × 15 צלחות מ&quot;מ; 3-4 נקודות לכל צלחת. היזהר שלא להתסיס את תערובת הזדווגות מכיוון שהדבר עלול לשבש זוגות מזדווגים. אגר Difco משמש כי יש מזהמים פחות במחיר נמוך agars, וזה יהיה יותר קל לראות zygotes מתחת למיקרוסקופ. התערובת ההזדווגות בשימוש ניתן להשאיר את הבקבוק בלילה, ואיכות התגובה ההזדווגות יהיה ברור למחרת. לאחר ההזדווגות הוא יעיל, zygotes תדבק לקיר או התחתון של הבקבוק ובינוניים יופיעו ברור. גם תסיסה של הבקבוק ייכשל כדי לסלק את zygotes. אם מקלות שום הזכוכית כאשר התערובת הוא נסער בעוצמה סבירה, אז הזיווג היה לא יעיל או לא התקיימה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> TAP-Difco צלחות המכילות תערובת ההזדווגות הם מיובשים במנדף סטרילי, עם מכסים פתוחה, עד כל נוזל משטח נקלטה. הצלחות נותרים בדרך כלל לאור (700 NE / m 2 / sec) עבור 18 שעות, אז עטוף בנייר כסף, שכן התבגרות zygospore תתבצע רק בחושך. זנים חצתה, הזדווגות השעה והתאריך נכתבים על שתי צלחות את נייר הכסף. פלטות מאוחסנות 5 עד 7 ימים והוא יכול להישמר זמן רב יותר, למרות היעילות יורדת בהדרגה הזיגוטה נביטה. </li></ol> חלק 3: Dissection הטטרדה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בתאי צמח יש לגרד נקודות מיובש של תערובת הזדווגות באמצעות סכין קהה, כמו אזמל. הלהב יכול לשמש כדי לחשוף שטח של zygotes, אשר מקל בחוזקה אגר 3%. צעד זה נעשה בדרך כלל בשעות אחר הצהריים, כך zygotes יש מונבטים על ידי למחרת בבוקר, אבל לא עברו חלוקה השני, צמח אשרתשואה 8 צאצאים. ביולוגים Chlamydomonas במהירות ללמוד לזהות zygotes תחת המיקרוסקופ, כיוון שהם גדולים יותר מאשר התאים הצמחיים, והם כוללים קיר zygospore סמיך אשר נותן קו מתאר שחור. Zygospores לעתים קרובות מופיעים צהוב אבל יכול להיות גם קצת ירוק. הדמות החשובה ביותר היא שהם לדבוק אגר, בעוד התאים הצמחיים מועברים בקלות הצידה. עם זאת, אם הצלחות הם יבשים מדי זה לא יהיה המקרה. כמו כן, אם את התערובת ההזדווגות היה צפוף מדי, עלול להיווצר zygotes מחצלת שיאפשרו העברת zygotes אדם קשה או בלתי אפשרי. צפיפות מתאים מבוססים בשלב 2.1, ויהיה למדו מהר עם ניסיון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחטים זכוכית מוכנים לאיסוף zygotes הפרדת צאצאים הטטרדה. אלה מוכנים על ידי משיכת מוטות זכוכית 3 מ&quot;מ אש קטנה כדי ליצור חוטים ארוכים, דקים, אשר יכול להיות שבור. טיפים אלה מסתיים קוני הם החליקו או כפופות לתוך ווים, על ידי חימום קצר אש נמוכה (למשל אלכוהול או גפרור בוער). הכן 3 או יותר מחטים זכוכית, שכן הם לשבור בקלות יחסית, במיוחד עבור משתמשים לא מנוסים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Zygotes נאספים על הצלחת סטפס Difco 3% באמצעות מחט זכוכית לערימה קטנה. ריבוע של אגר (עד 0.5 ס&quot;מ 2) המכיל את zygotes נוצר ו נכרת באמצעות אזמל קהה. ואז, לחסום את אגר ממוקם עם הפנים כלפי מטה על צלחת 15 1.5% סטפס Difco מ&quot;מ, והחליק לאורך קו אופקי של כ -1.5 ס&quot;מ מהחלק העליון של הצלחת, כדי לפזר את zygotes. הקו האופקי העליון, רשת עם כ 1.5 ס&quot;מ 0.5 ריווח אופקי אנכי ס&quot;מ חקוקות לחלק האחורי של הצלחות. הרשת תשמש למחרת כמדריך הפרדת צאצאים הטטרדה (רשת יכול להיות גם חרוט יום דיסקציה). לבסוף, zygotes בודדים לעבור בצמתים של קווים אופקיים העליון עם כל קו אנכי, עם כ 20-30 zygotes לכל צלחת. אמנם רק 12 או כך יהיה גזור, לא הזיגוטה כל germinates, וכמה תחלק פעמיים לפני שהם מתפוצצים, zygotes תוספת כך נחוצים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הפצת zygotes, ותאי צמח שהועברו בטעות צלחת אגר 3% נהרגים על ידי חשיפת צלחת הפוכה למשך 30 שניות על צלחת זכוכית המכילה שכבה דקה (1-2 מ&quot;מ) של כלורופורם. המרחק בין הצלחת כלורופורם צריך להיות בערך 5 ס&quot;מ. אם כלורופורם משמש יותר מדי, או אם המרחק קטן מדי או גדול, אחד הסיכונים או להרוג את zygotes, או לא להרוג את התאים הצמחיים. הטיפול כלורופורם חייב להיעשות מיד לאחר zygospores הופצו על הצלחת נביטה, כדי להבטיח סלקטיביות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נביטה לוקח 16-20 שעות עבור רוב זני, אבל ישתנו עם גנוטיפ עם גיל zygotes. עבור נביטה, צלחות ממוקמים באור נמוך (239 NE / m 2 / sec), או באור מעומעם בינוני על ידי כיסוי צלחת עם נייר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Zygotes מונבטים ניתן לזהות תחת מיקרוסקופ כמו תאים נפוחים או פרץ לפעמים עם לתאי הבת בתוכם. אם zygospore לא מקרע, נוגעת בעדינות עם מחט זכוכית תשבור את הקיר אם התרחשה נביטה. לתאי הבת הם גררו בעדינות לנקודות רשת מתחת הזיגוטה. היא הקלה ביותר לעשות זאת על ידי לכידת התא כמות קטנה של נוזל בינוני שוחרר מבית אגר על ידי לחץ של המחט זכוכית, גרירת הזה &quot;שלולית&quot; מאחורי המחט. צורה אחת של &quot;ביטוח&quot; כי יש גזור זיגוטה ולא תא צמח, כי יש לחלק פעמיים, כי מלבד התאים בת ארבע, &quot;עור&quot; של הקיר zygospore יישאר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הצאצאים גזור מגודלים בתנאים המתאימים עד clonies לעין יכול להיות נטל לניתוח שלאחר מכן. צלחות יש לעקוב מדי יום זיהום. </li></ol> הערה: דור diploids צמח שאינו מכוסה כאן, אבל בעצם כרוך ציפוי את התערובת על הזדווגות בינוני אשר לא לתמוך בצמיחה של מתח או של ההורים, אלא לתמוך בצמיחה של דיפלואידי (למשל auxotropic שני סמנים שונים). פלטות נשמרים האור, כדי למנוע היווצרות של zygotes.

<ol>
	<li>Harris, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Chlamydomonas+Sourcebook:+Introduction+to+Chlamydomonas+and+Its+Laboratory+Use.">The Chlamydomonas Sourcebook: Introduction to Chlamydomonas and Its Laboratory Use.</a> Conf Proc IEEE Eng Med Biol Soc. , 119-273 (2005).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

אנליזה גנטית פשוטה Chlamydomonas, אבל זה דורש טכניקות מסוים כדי לייצר גמטות והצאצאים הטטרדה נפרד. עם זנים בריא, טכניקות נרכשות בקלות. עם כמה זנים מוטנטים, הוא הופך להיות יותר אמנות, וקוראים צריך להפנות כרך 1 של Sourcebook Chlamydomonas לאחרונה פרסם הערות היסטוריות רמזים מעשית....

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>CC-125</td>
<td>Mating type plus strain</td>
<td>Chlamydomonas Stock Center</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>CC-124</td>
<td>Mating type minus strain</td>
<td>Chlamydomonas Stock Center</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Tris-Acetate-Phosphate (TAP) </td>
<td>Growth medium</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>N10</td>
<td>Growth medium</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Difco agar</td>
<td>Reagent</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Fisherbrand Stainless-Steel Blades</td>
<td>Tools</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>08-916-5B</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>BD Surgical Blade Handles</td>
<td>Tools</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>08-914-5</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Fisherbrand Metal Scalpels</td>
<td>Tools</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>08-920A</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

mating and tetrad separation of chlamydomonas reinhardtii for genetic analysis

Unicellular אצה ירוקה<em&gt; Chlamydomonas reinhardtii</em&gt; (<em&gt; Chlamydomonas</em&gt;) הפך פופולרי אורגניזם למחקר בתחומים מגוונים של ביולוגיה של התא וגנטיקה בגלל מחזור החיים הפשוטים שלה, קלות צמיחה מניפולציה לצורך ניתוח גנטי משאבים גנטי, ו transformability הגרעין ושניהם האברונים. זנים הזדווגות היא מנהג נפוץ כאשר גישות גנטי משמשים<em&gt; Chlamydomonass</em&gt;, ליצור diploids וגטטיבי לניתוח של דומיננטיות, או לאחר דיסקציה הטטרדה לירושה גרעיני לעומת organellar לברר, לבדוק allelism, לנתח epistasy, או ליצור אוכלוסיות לצורך שיבוט המפה מבוססת. בנוסף, חוצה גנטי משמשים באופן שגרתי לשלב גנוטיפים organellar עם גנוטיפים גרעיני בפרט. כאן אנו מדגימים שיטות תקן, נביטה gametogenesis, הזדווגות הזיגוטה והפרדה הטטרדה. פרוטוקול זה מורכב מסדרה קל לעקוב אחר צעדים שיהפכו גישות גנטיות מקובל מדענים שמכירים פחות<em&gt; Chlamydomonas</em&gt;. פרמטרים מרכזיים מועדים לפורענות מוסברים. לבסוף, מקורות מידע נוספים חלופה שיטות מסופקים.

Watch this Scientific Journal Video about Mating and Tetrad Separation of Chlamydomonas reinhardtii for Genetic Analysis at JoVE.com

Mating and Tetrad Separation of Chlamydomonas reinhardtii for Genetic Analysis

הזדווגות והפרדה הטטרדה נדרשים לניתוח גנטי<em&gt; Chlamydomonas reinhardtii</em&gt;. כאן אנו מדגימים שיטות תקן, נביטה gametogenesis, הזדווגות הזיגוטה ו לנתיחה הטטרדה. פרוטוקול זה מורכב מסדרה קל לעקוב אחר צעדים שיהפכו גישות גנטיות מקובל מדענים שמכירים פחות<em&gt; Chlamydomonas</em&gt;.

הזדווגות והפרדה של הטטרדה Chlamydomonas reinhardtii עבור ניתוח גנטי

The unicellular green alga Chlamydomonas reinhardtii (Chlamydomonas) has become a popular organism for research in diverse areas of cell biology and ...

mating-tetrad-separation-chlamydomonas-reinhardtii-for-genetic

Research

JoVE Journal

Biology

Mating and Tetrad Separation of Chlamydomonas reinhardtii for Genetic Analysis

19.8K Views.  Cornell University. הזדווגות והפרדה הטטרדה נדרשים לניתוח גנטי Chlamydomonas reinhardtii. כאן אנו מדגימים שיטות תקן, נביטה gametogenesis, הזדווגות הזיגוטה ו לנתיחה הטטרדה. פרוטוקול זה מורכב מסדרה קל לעקוב אחר צעדים שיהפכו גישות גנטיות מקובל מדענים שמכירים פחות Chlamydomonas.

Video: Mating and Tetrad Separation of Chlamydomonas reinhardtii for Genetic Analysis

Light/dark Transition Test for Mice

Although all of the mouse genome sequences have been determined, we do not yet know the functions of most of these genes. Gene-targeting techniques, however, can be used to delete or manipulate a specific gene in mice. The influence of a given gene on a specific behavior can then be determined by conducting behavioral analyses of the mutant mice. As a test for behavioral phenotyping of mutant mice, the light/dark transition test is one of the most widely used tests to measure anxiety-like behavior in mice. The test is based on the natural aversion of mice to brightly illuminated areas and on their spontaneous exploratory behavior in novel environments. The test is sensitive to anxiolytic drug treatment. The apparatus consists of a dark chamber and a brightly illuminated chamber. Mice are allowed to move freely between the two chambers. The number of entries into the bright chamber and the duration of time spent there are indices of bright-space anxiety in mice. To obtain phenotyping results of a strain of mutant mice that can be readily reproduced and compared with those of other mutants, the behavioral test methods should be as identical as possible between laboratories. The procedural differences that exist between laboratories, however, make it difficult to replicate or compare the results among laboratories. Here, we present our protocol for the light/dark transition test as a movie so that the details of the protocol can be demonstrated. In our laboratory, we have assessed more than 60 strains of mutant mice using the protocol shown in the movie. Those data will be disclosed as a part of a public database that we are now constructing.

Visualization of the protocol will facilitate understanding of the details of the entire experimental procedure, allowing for standardization of the protocols used across laboratories and comparisons of the behavioral phenotypes of various strains of mutant mice assessed using this test.

The light/dark transition test is one of the most widely used tests to measure anxiety-like behavior in mice. Here, we present a movie that shows detailed procedures on how we conduct the test.

אור / חושך מעבר מבחן עכברים

Although all of the mouse genome sequences have been determined, we do not yet know the functions of most of these genes. Gene-targeting techniques, ...

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo (New Culture)

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying  the formation and patterning of brain, neural tube, somite and heart primordia. Applications of chick embryo culture include electroporation of DNA or RNA constructs in order to analyze gene function, grafts of growth factor coated beads such as FGFs and BMPs , as well as whole mount in situ hybridization and immunohistochemistry. This video demonstrates the different steps in chick embryo culture; First, the embryo is explanted in saline. Then, the embryo is centered on a glass ring. The membranes surrounding the embryo are lifted along the walls of the ring. The ring is then placed in a culture dish containing a pool of albumine. The culture dish is sealed and placed in a humid chamber, where the embryo is cultured for up to 24 hrs. Finally, the embryo is removed from the ring, fixed and processed for further applications. A troubleshooting guide is also presented.

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo New Culture

This video demonstrates New culture, a method by which chick embryos are cultured outside the egg for up to 24 hr. This method enables one to study early development (primitive streak to 14 som.), a period corresponding to E7-9 in mouse. Applications of this technique include electroporation, in situ hybridization and immunohistochemistry.

שיטת לתרבות מוקדם של עוברים צ&#39;יק לשעבר vivo (תרבות חדש)

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

Double Whole Mount in situ Hybridization of Early Chick Embryos

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying  gene expression in brain, neural tube, somite and heart primordia formation. This video demonstrates the different steps in 2-color whole mount in situ hybridization; First, the embryo is dissected from the egg and fixed in paraformaldehyde. Second, the embryo is processed for prehybridization. The embryo is then hybridized with two different probes, one coupled to DIG, and one coupled to FITC.  Following overnight hybridization, the embryo is incubated with DIG coupled antibody. Color reaction for DIG substrate is performed, and the region of interest appears blue. The embryo is then incubated with FITC coupled antibody. The embryo is processed for color reaction with FITC, and the region of interest appears red. Finally, the embryo is fixed and processed for phtograph and sectioning. A troubleshooting guide is also presented.

This video demonstrates 2-color whole mount in situ hybridization, a method by which the spatial and temporal expression pattern of 2 different genes can be visualized in young chick embryos. This method was originally introduced by David Wilkinson, Domingos Henrique, Phil Ingham and David Ish -Horowicz.

הר שלם כפול באתרו הכלאה של עוברים צ&#39;יק מוקדם

Method for Whole Mount Antibody Staining in Chick

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying antibody expression in developing brain, neural tube and somite. This video demonstrates the different steps in whole-mount antibody staining using HRP conjugated secondary antibodies; First, the embryo is dissected from the egg and fixed in paraformaldehyde. Second, endogenous peroxidase is inactivated; The embryo is then exposed to primary antibody. After several washes, the embryo is incubated with secondary antibody conjugated to HRP. Peroxidase activity is revealed using reaction with diaminobenzidine substrate. Finally, the embryo is fixed and processed for photography and sectioning. The advantage of this method over the use of fluorescent antibodies is that embryos can be processed for wax sectioning, thus enabling the study of antigen sites in cross section. This method was originally introduced by Jane Dodd and Tom Jessell 1.

This video demonstrates whole mount immunohistochemistry, a method by which the spatial and temporal expression pattern of an antigen can be visualized in young chick embryos. This method was originally introduced by Jane Dodd and Tom Jessell.

שיטת מכתים נוגדן שלם הר ב צ&#39;יק

Assay for Neural Induction in the Chick Embryo

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying the formation and initial patterning of the nervous system. This video demonstrates how to graft organizer tissue into a host, a method by which Hensen s node (the organizer in the chick embryo) is grafted to a host competent ectoderm. The organizer graft instructs overlying na ve tissue to adopt a neural fate via neural inducing signals. This mechanism is referred to as neural induction, and constitutes the initial step in the formation of brain and spinal cord in amniotes. This method is essentially used for the characterization of putative neural inducing molecules in chick. This video demonstrates the different steps in the assay for neural induction; First, the donnor embryo is explanted and pinned on a dish. Then, the host embryo is prepared for New culture. The graft is excised and transplanted to the host area pellucida margin. The host is cultured for 18-22 hrs. The assembly is fixed and processed for further applications (e.g. in situ hybridization). This method was originally devised by Waddington 1,2 and Gallera 3,4.

Neural induction is the first step in the formation of the brain. It is a mechanism by which Hensen's node (organizer), instructs adjacent tissue to adopt a neural fate, i.e. to give rise to the nervous system. This video demonstrates an assay for neural induction in chick embryo.

Assay עבור אינדוקציה עצבית בעובר צ&#39;יק

A Neuronal and Astrocyte Co-Culture Assay for High Content Analysis of Neurotoxicity

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing measurement of multiple cellular phenotypes within a single assay. In this study, we utilized HCA to develop a novel assay for neurotoxicity. Neurotoxicity assessment represents an important part of drug safety evaluation, as well as being a significant focus of environmental protection efforts. Additionally, neurotoxicity is also a well-accepted in vitro marker of the development of neurodegenerative diseases such as Alzheimer's and Parkinson's diseases. Recently, the application of HCA to neuronal screening has been reported. By labeling neuronal cells with &beta;III-tubulin, HCA assays can provide high-throughput, non-subjective, quantitative measurements of parameters such as neuronal number, neurite count and neurite length, all of which can indicate neurotoxic effects. However, the role of astrocytes remains unexplored in these models. Astrocytes have an integral role in the maintenance of central nervous system (CNS) homeostasis, and are associated with both neuroprotection and neurodegradation when they are activated in response to toxic substances or disease states. GFAP is an intermediate filament protein expressed predominantly in the astrocytes of the CNS. Astrocytic activation (gliosis) leads to the upregulation of GFAP, commonly accompanied by astrocyte proliferation and hypertrophy. This process of reactive gliosis has been proposed as an early marker of damage to the nervous system. The traditional method for GFAP quantitation is by immunoassay. This approach is limited by an inability to provide information on cellular localization, morphology and cell number. We determined that HCA could be used to overcome these limitations and to simultaneously measure multiple features associated with gliosis - changes in GFAP expression, astrocyte hypertrophy, and astrocyte proliferation - within a single assay. In co-culture studies, astrocytes have been shown to protect neurons against several types of toxic insult and to critically influence neuronal survival. Recent studies have suggested that the use of astrocytes in an in vitro neurotoxicity test system may prove more relevant to human CNS structure and function than neuronal cells alone. Accordingly, we have developed an HCA assay for co-culture of neurons and astrocytes, comprised of protocols and validated, target-specific detection reagents for profiling &beta;III-tubulin and glial fibrillary acidic protein (GFAP). This assay enables simultaneous analysis of neurotoxicity, neurite outgrowth, gliosis, neuronal and astrocytic morphology and neuronal and astrocytic development in a wide variety of cellular models, representing a novel, non-subjective, high-throughput assay for neurotoxicity assessment. The assay holds great potential for enhanced detection of neurotoxicity and improved productivity in neuroscience research and drug discovery.

This article describes a novel protocol and reagent set designed for sensitive measurement of neurotoxic effects of compounds and treatments on co-cultures of neurons and astrocytes using high content analysis. Results demonstrate that high content analysis represents an exciting novel technology for neurotoxicity assessment.

עצב Astrocyte שותף תרבות Assay לניתוח תכולה גבוהה של neurotoxicity

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing ...

Dissection of Hippocampal Dentate Gyrus from Adult Mouse

The hippocampus is one of the most widely studied areas in the brain because of its important functional role in memory processing and learning, its remarkable neuronal cell plasticity, and its involvement in epilepsy, neurodegenerative diseases, and psychiatric disorders. The hippocampus is composed of distinct regions; the dentate gyrus, which comprises mainly granule neurons, and Ammon's horn, which comprises mainly pyramidal neurons, and the two regions are connected by both anatomic and functional circuits. Many different mRNAs and proteins are selectively expressed in the dentate gyrus, and the dentate gyrus is a site of adult neurogenesis; that is, new neurons are continually generated in the adult dentate gyrus. To investigate mRNA and protein expression specific to the dentate gyrus, laser capture microdissection is often used. This method has some limitations, however, such as the need for special apparatuses and complicated handling procedures. In this video-recorded protocol, we demonstrate a dissection technique for removing the dentate gyrus from adult mouse under a stereomicroscope. Dentate gyrus samples prepared using this technique are suitable for any assay, including transcriptomic, proteomic, and cell biology analyses. We confirmed that the dissected tissue is dentate gyrus by conducting real-time PCR of dentate gyrus-specific genes, tryptophan 2,3-dioxygenase (TDO2) and desmoplakin (Dsp), and Ammon's horn enriched genes, Meis-related gene 1b (Mrg1b) and TYRO3 protein tyrosine kinase 3 (Tyro3). The mRNA expressions of TDO2 and Dsp in the dentate gyrus samples were detected at obviously higher levels, whereas Mrg1b and Tyro3 were lower levels, than those in the Ammon's horn samples. To demonstrate the advantage of this method, we performed DNA microarray analysis using samples of whole hippocampus and dentate gyrus. The mRNA expression of TDO2 and Dsp, which are expressed selectively in the dentate gyrus, in the whole hippocampus of alpha-CaMKII+/- mice, exhibited 0.037 and 0.10-fold changes compared to that of wild-type mice, respectively. In the isolated dentate gyrus, however, these expressions exhibited 0.011 and 0.021-fold changes compared to that of wild-type mice, demonstrating that gene expression changes in dentate gyrus can be detected with greater sensitivity. Taken together, this convenient and accurate dissection technique can be reliably used for studies focused on the dentate gyrus.

A dissection technique for removal of the dentate gyrus from adult mouse under a stereomicroscope was demonstrated in this video-recorded protocol.

Dissection של gyrus משוננת בהיפוקמפוס מתוך עכבר למבוגרים

The hippocampus is one of the most widely studied areas in the brain because of its important functional role in memory processing and learning, its ...

Rapid Genetic Analysis of Epithelial-Mesenchymal Signaling During Hair Regeneration

Hair follicle morphogenesis, a complex process requiring interaction between epithelia-derived keratinocytes and the underlying mesenchyme, is an attractive model system to study organ development and tissue-specific signaling. Although hair follicle development is genetically tractable, fast and reproducible analysis of factors essential for this process remains a challenge. Here we describe a procedure to generate targeted overexpression or shRNA-mediated knockdown of factors using lentivirus in a tissue-specific manner. Using a modified version of a hair regeneration model 5, 6, 11, we can achieve robust gain- or loss-of-function analysis in primary mouse keratinocytes or dermal cells to facilitate study of epithelial-mesenchymal signaling pathways that lead to hair follicle morphogenesis. We describe how to isolate fresh primary mouse keratinocytes and dermal cells, which contain dermal papilla cells and their precursors, deliver lentivirus containing either shRNA or cDNA to one of the cell populations, and combine the cells to generate fully formed hair follicles on the backs of nude mice. This approach allows analysis of tissue-specific factors required to generate hair follicles within three weeks and provides a fast and convenient companion to existing genetic models.

Tissue-specific analysis of a hair follicle regeneration model using lentivirus to mediate gain- or loss-of-function.

ניתוח גנטי מהיר של איתות אפיתל-mesenchymal במהלך התחדשות שיער

Hair follicle morphogenesis, a complex process requiring interaction between epithelia-derived keratinocytes and the underlying mesenchyme, is an ...

Alternative Cultures for Human Pluripotent Stem Cell Production, Maintenance, and Genetic Analysis

Human pluripotent stem cells (hPSCs) hold great promise for regenerative medicine and biopharmaceutical applications. Currently, optimal culture and efficient expansion of large amounts of clinical-grade hPSCs are critical issues in hPSC-based therapies. Conventionally, hPSCs are propagated as colonies on both feeder and feeder-free culture systems. However, these methods have several major limitations, including low cell yields and generation of heterogeneously differentiated cells. To improve current hPSC culture methods, we have recently developed a new method, which is based on non-colony type monolayer (NCM) culture of dissociated single cells. Here, we present detailed NCM protocols based on the Rho-associated kinase (ROCK) inhibitor Y-27632. We also provide new information regarding NCM culture with different small molecules such as Y-39983 (ROCK I inhibitor), phenylbenzodioxane (ROCK II inhibitor), and thiazovivin (a novel ROCK inhibitor). We further extend our basic protocol to cultivate hPSCs on defined extracellular proteins such as the laminin isoform 521 (LN-521) without the use of ROCK inhibitors. Moreover, based on NCM, we have demonstrated efficient transfection or transduction of plasmid DNAs, lentiviral particles, and oligonucleotide-based microRNAs into hPSCs in order to genetically modify these cells for molecular analyses and drug discovery. The NCM-based methods overcome the major shortcomings of colony-type culture, and thus may be suitable for producing large amounts of homogeneous hPSCs for future clinical therapies, stem cell research, and drug discovery.

Here, we present human pluripotent stem cell (hPSC) culture protocols, based on non-colony type monolayer (NCM) growth of dissociated single cells. This new method, utilizing Rho-associated kinase inhibitors or the laminin isoform 521 (LN-521), is suitable for producing large amounts of homogeneous hPSCs, genetic manipulation, and drug discovery.

תרבויות אלטרנטיבי לפלוריפוטנטיים אנושיים לתאים גזע ייצור, תחזוקה וניתוח גנטי

Human pluripotent stem cells (hPSCs) hold great promise for regenerative medicine and biopharmaceutical applications. Currently, optimal culture and ...

DNA Electroporation, Isolation and Imaging of Myofibers

Mature muscle has a unique structure that is amenable to live cell imaging. Herein, we describe the experimental protocol for expressing fluorescently labeled proteins in the flexor digitorum brevis (FDB) muscle. Conditions have been optimized to provide a large number of high quality myofibers expressing the electroporated plasmid while minimizing muscle damage. The method employs fluorescent tags on various proteins. Combining this expression method with high resolution confocal microscopy permits live cell imaging, including imaging after laser-induced damage. Fluorescent dyes combined with imaging of fluorescently-tagged proteins provides information regarding the basic structure of muscle and its response to stimuli.

This protocol utilizes electroporation to introduce and express fluorescently labeled proteins in mouse muscle fibers. Following recovery after electroporation, fibers are isolated. Individual fibers are then imaged using high resolution confocal microscopy to visualize muscle structure.

DNA Electroporation, בידוד והדמיה של Myofibers

Mature muscle has a unique structure that is amenable to live cell imaging. Herein, we describe the experimental protocol for expressing fluorescently ...