Questo protocollo si basa su tecniche apprese nel laboratorio di Francesco-André Wollman presso l&#39;Institut de Biologie fisico-Chimique, Parigi, Francia. Gli autori hanno un debito di gratitudine a Jacqueline Girard-Bascou, che ha originariamente introdotto DBS alle tecniche di Chlamydomonas genetica. Chlamydomonas di ricerca in laboratorio degli autori &#39;è supportato da premio della National Science Foundation MCB-0646350.

Parte 1: Preparazione dei ceppi per gametogenesi Nota: Tutte le manipolazioni devono essere effettuate a temperatura ambiente. Temperature maggiori e minori influenzerà la velocità di germinazione zigote e può influenzare negativamente la vitalità. Considerazione importante: è essenziale che i ceppi di essere accoppiati sono in crescita robusta e sono privi di contaminanti funghi o batteri. Se le tensioni non sono stati trasferiti regolarmente, passaggio in terreno ricco deve precedere la generazione dei gameti. <ol><li> I ceppi di essere accoppiati vengono trasferite su piastre TAP (100 × 15 mm), 1-2 ceppi per piastra. Le cellule devono essere coltivate in una striscia di concentrato di circa 1 cm di larghezza. </li><li> L&#39;incubazione sulle piastre TAP dovrebbe continuare fino a quando una spessa coltre di robusta crescita delle cellule è presente, con i trasferimenti intermedi, se necessario. I ceppi che non sono stati diversi passaggi di recente può richiedere un passaggio e un totale di 1 settimana, mentre i ceppi wild-type in uso regolare può essere effettuato solo pochi giorni e senza passaggi. Mutanti che sono sensibili alla luce può richiedere più tempo. </li><li> Trasferire tutte le cellule dalle piastre TAP per piatti N10, che sono carenti di azoto e inizierà a indurre gametogenesi. Trasferire le cellule come una lastra di spessore, tanto quanto erano presenti sulla piastra TAP. Questo faciliterà la successiva raccolta delle cellule. Dopo 3 giorni di N10, le cellule sono disposti a sottoporsi ad gametogenesi. La divisione cellulare sarà lenta su N10, tuttavia le cellule deve rimanere verde scuro. Qualsiasi ceppi contaminati deve essere scartato come zigoti vitali non si otterrà. </li></ol> Parte 2: accoppiamento <ol><li> Ogni sforzo è trasferito in un beuta da ml 50 e risospeso in circa 2,5 ml di acqua distillata sterile. Questo può essere fatto sia utilizzando un ciclo filo o un bastone sterile, ciò che è importante è che le cellule sono ben sospesa e non in gruppi. Il volume esatto di acqua dovrebbe essere regolato in modo che la concentrazione delle cellule, come misurato ad occhio, è circa lo stesso per ogni ceppo. </li><li> Le cellule sono agitato di una forte luce (E 1,260 μ / m 2 / sec) per 2 ore, durante le quali le cellule diventeranno gameti mobili. Motilità devono essere controllati al microscopio ottico. Se i gameti sono il nuoto male, l&#39;accoppiamento rischia di essere inefficiente. Tuttavia, anche mal ceppi mobili si accoppia una frequenza ridotta. </li><li> Successivamente, volumi uguali di mt + e mt-gameti sono combinati in un unico pallone da ml 50. Gameti sono lasciati di una forte luce (E 1,260 μ / m 2 / sec) senza mescolare. </li><li> L&#39;accoppiamento può essere controllato immediatamente sotto al microscopio ottico. Coppie di gameti forma rapidamente, e appariranno come le cellule in rapido movimento unito al flagelli. Se l&#39;accoppiamento risulta essere estremamente rapido, i campioni devono essere presa entro h 30 min -1 per la generazione di zigoti. In caso contrario, l&#39;accoppiamento può essere controllata ogni ora, anche se questo è opzionale. Fin dai tempi dando la densità ottimale di zigoti varia notevolmente tra croci, è meglio prendere aliquote della miscela di accoppiamento in tempi diversi, dopo che combina gameti, ad esempio dopo 1 ora, 2 ore, 3 ore e 4 ore. Questo viene fatto con il trasferimento di 300 campioni microlitri di TAP-3% agar difco 60 × 15 tavole mm; punti 3-4 per piastra. Fare attenzione a non agitare la miscela di accoppiamento in quanto ciò potrebbe compromettere le coppie di accoppiamento. Agar Difco viene utilizzato perché ha un minor numero di contaminanti di agar a basso prezzo, e sarà più facile vedere zigoti sotto il microscopio. La miscela di accoppiamento non utilizzati possono essere lasciati nel pallone durante la notte, e la qualità della reazione di accoppiamento sarà evidente il giorno successivo. Quando l&#39;accoppiamento è efficiente, gli zigoti aderirà alla parete o al fondo del pallone ed il mezzo apparirà chiaro. Anche l&#39;agitazione del pallone non riuscirà a rimuovere gli zigoti. Se attacca niente al vetro quando la miscela viene agitata con forza ragionevole, allora l&#39;accoppiamento era inefficiente o non ha luogo. </li><li> Il TAP-difco piastre contenenti miscela di accoppiamento vengono essiccati in una cappa sterile, con le palpebre socchiuse, finchè tutto il liquido di superficie è stata assorbita. Le piastre sono in genere lasciati alla luce (700 NE / m 2 / sec) per 18 ore, poi avvolto in un foglio, dal momento che la maturazione zygospore avverrà solo al buio. I ceppi incrociati, l&#39;accoppiamento ora e la data sono scritti su entrambi i piatti e la pellicola. Le piastre sono memorizzati 5 a 7 giorni e può essere conservato più a lungo, anche se l&#39;efficienza germinazione zigote diminuisce progressivamente. </li></ol> Parte 3: Dissection Tetrade <ol><li> Cellule vegetative dovrebbe essere raschiata macchie secche di miscela di accoppiamento con una lama poco affilata come un bisturi. La lama può essere utilizzata per esporre una superficie di zigoti, che si atterrà strettamente al agar 3%. Questo passo è di solito fatto nel pomeriggio, in modo che gli zigoti sono germinati dalla mattina successiva, ma non hanno subito un secondo, divisione vegetativo cherendimento dell&#39;8 progenie. Chlamydomonas biologi imparano rapidamente a riconoscere zigoti sotto il microscopio, dal momento che sono più grandi delle cellule vegetative, e dispongono di uno spesso muro zygospore che dà un contorno nero. Zygospores spesso di colore giallo, ma può anche essere un po &#39;verde. Il personaggio più importante è che si attaccano di agar-agar, mentre le cellule vegetative sono facilmente spostati da parte. Tuttavia, se i piatti sono troppo secco questo non sarà il caso. Inoltre, se la miscela di accoppiamento era troppo denso, zigoti possono formare un tappeto che renderà il trasferimento di zigoti singoli difficile o impossibile. Densità appropriati sono stabiliti al punto 2.1, e sarà presto imparato con l&#39;esperienza. </li><li> Aghi di vetro sono preparati per la raccolta e la separazione zigoti progenie tetrade. Questi sono preparati tirando 3 canne di vetro mm in una piccola fiamma di generare un lungo filo sottile, che può essere interrotta. Le punte di questi fini conici vengono smussate o piegati in ganci, da riscaldamento breve in una fiamma bassa (ad esempio alcol o un fiammifero). Preparare 3 o più aghi di vetro, dal momento che si rompono abbastanza facilmente, soprattutto per gli utenti meno esperti. </li><li> Zigoti sono riuniti il ​​3% TAP-difco placca utilizzando un ago di vetro in un mucchio di piccole dimensioni. Un quadrato di agar (fino a 0,5 cm 2) che contiene il zigoti è formato e asportato con un bisturi noioso. Poi, il blocco agar è posto a faccia in giù su un 15 mm 1,5% TAP-Difco piatto, e scivolò lungo una linea orizzontale di circa 1,5 cm dal bordo superiore della piastra, per distribuire gli zigoti. La linea orizzontale superiore e una griglia con circa 1,5 cm ai lati e 0,5 cm Distanza verticale sono incisi sul retro delle lastre. La griglia sarà utilizzato il giorno seguente come guida per separare la progenie tetrade (la griglia può anche essere inciso il giorno della dissezione). Infine, zigoti singoli passare alle intersezioni delle linee orizzontale superiore con ogni linea verticale, con circa 20-30 zigoti per piastra. Anche se solo 12 o giù di lì sarà sezionato, non ogni zigote germina, e alcuni si dividono due volte prima di scoppiare, zigoti così supplementari sono necessari. </li><li> Dopo aver distribuito il zigoti, e le cellule vegetative che sono stati accidentalmente trasferito dalla piastra di agar 3% vengono uccisi esponendo la piastra capovolta per 30 secondi su un piatto di vetro contenente una sottile (1-2 mm) strato di cloroformio. La distanza tra la piastra ed il cloroformio dovrebbero essere di circa 5 cm. Se cloroformio viene usato troppo, o se la distanza è troppo piccolo o grande, si rischia di uccidere sia gli zigoti, o non uccidere le cellule vegetative. Il trattamento cloroformio deve essere fatta subito dopo la zygospores sono stati distribuiti sul piatto germinazione, per garantire la selettività. </li><li> La germinazione dura 16-20 ore per la maggior parte dei ceppi, ma varia a seconda del genotipo e con l&#39;età degli zigoti. Per la germinazione, le piastre sono posti sotto condizioni di scarsa luminosità (239 NE / m 2 / sec), o alla luce grigio medio, coprendo il piatto con un fazzoletto. </li><li> Zigoti germinato possono essere identificati al microscopio le cellule gonfie o, a volte scoppio con cellule figlie al loro interno. Se il zygospore non è rotto, sfiorando con un ago di vetro si rompe il muro se germinazione si è verificato. Cellule figlie vengono delicatamente trascinato i punti di griglia sottostante lo zigote. E &#39;più facile per fare questo catturando la cella in una piccola quantità di liquido rilasciato dal agar dalla pressione del ago di vetro, e trascinando questa &quot;pozzanghera&quot; dietro l&#39;ago. Una forma di &quot;assicurazione&quot; che si ha sezionato uno zigote e non una cellula vegetativa che ha diviso due volte, è che oltre alle cellule figlie quattro, la &quot;pelle&quot; del muro zygospore rimarrà. </li><li> La progenie sezionato vengono coltivate in condizioni appropriate fino clonies visibili possono essere raccolti per successive analisi. Piastre devono essere monitorati ogni giorno per contaminazione. </li></ol> Nota: Generazione di diploidi vegetativo non è coperto qui, ma coinvolge essenzialmente placcatura la miscela di accoppiamento a medio che non sosterrà la crescita di entrambi ceppo parentale, ma sosterrà la crescita del diploide (ad esempio due auxotropic marcatori diversi). Le piastre sono tenuti in luce per evitare la formazione di zigoti.

<ol>
	<li>Harris, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Chlamydomonas+Sourcebook:+Introduction+to+Chlamydomonas+and+Its+Laboratory+Use.">The Chlamydomonas Sourcebook: Introduction to Chlamydomonas and Its Laboratory Use.</a> Conf Proc IEEE Eng Med Biol Soc. , 119-273 (2005).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

L&#39;analisi genetica è semplice in Chlamydomonas, ma richiede particolari tecniche per generare gameti e progenie tetrade separati. Con ceppi sani, le tecniche sono facilmente acquisite. Con alcuni ceppi mutanti, diventa più un&#39;arte, e si rimanda Volume 1 del Sourcebook, recentemente pubblicato Chlamydomonas per le note storiche e consigli pratici. Inoltre, va notato che ci sono molte variazioni sul tema di base sopra descritte, che vanno dal metodo per indurre gametogenesi, per il mod...

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		<div>
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		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>CC-125</td>
<td>Mating type plus strain</td>
<td>Chlamydomonas Stock Center</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>CC-124</td>
<td>Mating type minus strain</td>
<td>Chlamydomonas Stock Center</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Tris-Acetate-Phosphate (TAP) </td>
<td>Growth medium</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>N10</td>
<td>Growth medium</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Difco agar</td>
<td>Reagent</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Fisherbrand Stainless-Steel Blades</td>
<td>Tools</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>08-916-5B</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>BD Surgical Blade Handles</td>
<td>Tools</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>08-914-5</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Fisherbrand Metal Scalpels</td>
<td>Tools</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>08-920A</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

mating and tetrad separation of chlamydomonas reinhardtii for genetic analysis

L&#39;alga verde unicellulare<em&gt; Chlamydomonas reinhardtii</em&gt; (<em&gt; Chlamydomonas</em&gt;) È diventato un organismo popolare per la ricerca in diverse aree della biologia cellulare e della genetica a causa del suo ciclo di vita semplice, la facilità di crescita e di manipolazione per l&#39;analisi genetica, risorse genomiche e trasformabilità del nucleo e due organelli. Ceppi di accoppiamento è una pratica comune quando approcci genetici sono usati in<em&gt; Chlamydomonass</em&gt;, Per creare diploidi vegetativo per l&#39;analisi di posizione dominante, o in seguito a dissezione tetrade di accertare l&#39;eredità nucleare vs organelli, per testare allelism, per analizzare epistasy, o per generare popolazioni allo scopo di carta a base di clonazione. Inoltre, incroci genetici sono abitualmente utilizzati per combinare genotipi organelli con particolari genotipi nucleari. Qui mostriamo metodi standard per gametogenesi, l&#39;accoppiamento, la germinazione dello zigote e separazione tetrade. Questo protocollo consiste in un facile da seguire serie di passi che renderanno approcci genetici suscettibili di scienziati che hanno meno familiarità con<em&gt; Chlamydomonas</em&gt;. Parametri chiave e punti problematici sono spiegato. Infine, le risorse per ulteriori informazioni e metodi alternativi sono forniti.

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Mating and Tetrad Separation of Chlamydomonas reinhardtii for Genetic Analysis

L&#39;accoppiamento e separazione tetrade sono necessari per l&#39;analisi genetica in<em&gt; Chlamydomonas reinhardtii</em&gt;. Qui mostriamo metodi standard per gametogenesi, l&#39;accoppiamento, la germinazione zigote e dissezione tetrade. Questo protocollo consiste in un facile da seguire serie di passi che renderanno approcci genetici suscettibili di scienziati che hanno meno familiarità con<em&gt; Chlamydomonas</em&gt;.

Accoppiamento e di separazione Tetrade Chlamydomonas reinhardtii Per l&#39;analisi genetica

The unicellular green alga Chlamydomonas reinhardtii (Chlamydomonas) has become a popular organism for research in diverse areas of cell biology and ...

mating-tetrad-separation-chlamydomonas-reinhardtii-for-genetic

Research

JoVE Journal

Biology

Mating and Tetrad Separation of Chlamydomonas reinhardtii for Genetic Analysis

19.8K Views.  Cornell University. L'accoppiamento e separazione tetrade sono necessari per l'analisi genetica in Chlamydomonas reinhardtii. Qui mostriamo metodi standard per gametogenesi, l'accoppiamento, la germinazione zigote e dissezione tetrade. Questo protocollo consiste in un facile da seguire serie di passi che renderanno approcci genetici suscettibili di scienziati che hanno meno familiarità con Chlamydomonas.

Video: Mating and Tetrad Separation of Chlamydomonas reinhardtii for Genetic Analysis

Light/dark Transition Test for Mice

Although all of the mouse genome sequences have been determined, we do not yet know the functions of most of these genes. Gene-targeting techniques, however, can be used to delete or manipulate a specific gene in mice. The influence of a given gene on a specific behavior can then be determined by conducting behavioral analyses of the mutant mice. As a test for behavioral phenotyping of mutant mice, the light/dark transition test is one of the most widely used tests to measure anxiety-like behavior in mice. The test is based on the natural aversion of mice to brightly illuminated areas and on their spontaneous exploratory behavior in novel environments. The test is sensitive to anxiolytic drug treatment. The apparatus consists of a dark chamber and a brightly illuminated chamber. Mice are allowed to move freely between the two chambers. The number of entries into the bright chamber and the duration of time spent there are indices of bright-space anxiety in mice. To obtain phenotyping results of a strain of mutant mice that can be readily reproduced and compared with those of other mutants, the behavioral test methods should be as identical as possible between laboratories. The procedural differences that exist between laboratories, however, make it difficult to replicate or compare the results among laboratories. Here, we present our protocol for the light/dark transition test as a movie so that the details of the protocol can be demonstrated. In our laboratory, we have assessed more than 60 strains of mutant mice using the protocol shown in the movie. Those data will be disclosed as a part of a public database that we are now constructing.

Visualization of the protocol will facilitate understanding of the details of the entire experimental procedure, allowing for standardization of the protocols used across laboratories and comparisons of the behavioral phenotypes of various strains of mutant mice assessed using this test.

The light/dark transition test is one of the most widely used tests to measure anxiety-like behavior in mice. Here, we present a movie that shows detailed procedures on how we conduct the test.

Luce / buio test di transizione per i Topi

Although all of the mouse genome sequences have been determined, we do not yet know the functions of most of these genes. Gene-targeting techniques, ...

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Biologia

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo (New Culture)

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying  the formation and patterning of brain, neural tube, somite and heart primordia. Applications of chick embryo culture include electroporation of DNA or RNA constructs in order to analyze gene function, grafts of growth factor coated beads such as FGFs and BMPs , as well as whole mount in situ hybridization and immunohistochemistry. This video demonstrates the different steps in chick embryo culture; First, the embryo is explanted in saline. Then, the embryo is centered on a glass ring. The membranes surrounding the embryo are lifted along the walls of the ring. The ring is then placed in a culture dish containing a pool of albumine. The culture dish is sealed and placed in a humid chamber, where the embryo is cultured for up to 24 hrs. Finally, the embryo is removed from the ring, fixed and processed for further applications. A troubleshooting guide is also presented.

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo New Culture

This video demonstrates New culture, a method by which chick embryos are cultured outside the egg for up to 24 hr. This method enables one to study early development (primitive streak to 14 som.), a period corresponding to E7-9 in mouse. Applications of this technique include electroporation, in situ hybridization and immunohistochemistry.

Metodo per la Cultura di Chick primi embrioni ex vivo (Nuova Cultura)

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

Double Whole Mount in situ Hybridization of Early Chick Embryos

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying  gene expression in brain, neural tube, somite and heart primordia formation. This video demonstrates the different steps in 2-color whole mount in situ hybridization; First, the embryo is dissected from the egg and fixed in paraformaldehyde. Second, the embryo is processed for prehybridization. The embryo is then hybridized with two different probes, one coupled to DIG, and one coupled to FITC.  Following overnight hybridization, the embryo is incubated with DIG coupled antibody. Color reaction for DIG substrate is performed, and the region of interest appears blue. The embryo is then incubated with FITC coupled antibody. The embryo is processed for color reaction with FITC, and the region of interest appears red. Finally, the embryo is fixed and processed for phtograph and sectioning. A troubleshooting guide is also presented.

This video demonstrates 2-color whole mount in situ hybridization, a method by which the spatial and temporal expression pattern of 2 different genes can be visualized in young chick embryos. This method was originally introduced by David Wilkinson, Domingos Henrique, Phil Ingham and David Ish -Horowicz.

Doppia Monte intero ibridazione in situ di embrioni di pollo primi

Method for Whole Mount Antibody Staining in Chick

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying antibody expression in developing brain, neural tube and somite. This video demonstrates the different steps in whole-mount antibody staining using HRP conjugated secondary antibodies; First, the embryo is dissected from the egg and fixed in paraformaldehyde. Second, endogenous peroxidase is inactivated; The embryo is then exposed to primary antibody. After several washes, the embryo is incubated with secondary antibody conjugated to HRP. Peroxidase activity is revealed using reaction with diaminobenzidine substrate. Finally, the embryo is fixed and processed for photography and sectioning. The advantage of this method over the use of fluorescent antibodies is that embryos can be processed for wax sectioning, thus enabling the study of antigen sites in cross section. This method was originally introduced by Jane Dodd and Tom Jessell 1.

This video demonstrates whole mount immunohistochemistry, a method by which the spatial and temporal expression pattern of an antigen can be visualized in young chick embryos. This method was originally introduced by Jane Dodd and Tom Jessell.

Metodo per la colorazione intero anticorpi Monte a Chick

Assay for Neural Induction in the Chick Embryo

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying the formation and initial patterning of the nervous system. This video demonstrates how to graft organizer tissue into a host, a method by which Hensen s node (the organizer in the chick embryo) is grafted to a host competent ectoderm. The organizer graft instructs overlying na ve tissue to adopt a neural fate via neural inducing signals. This mechanism is referred to as neural induction, and constitutes the initial step in the formation of brain and spinal cord in amniotes. This method is essentially used for the characterization of putative neural inducing molecules in chick. This video demonstrates the different steps in the assay for neural induction; First, the donnor embryo is explanted and pinned on a dish. Then, the host embryo is prepared for New culture. The graft is excised and transplanted to the host area pellucida margin. The host is cultured for 18-22 hrs. The assembly is fixed and processed for further applications (e.g. in situ hybridization). This method was originally devised by Waddington 1,2 and Gallera 3,4.

Neural induction is the first step in the formation of the brain. It is a mechanism by which Hensen's node (organizer), instructs adjacent tissue to adopt a neural fate, i.e. to give rise to the nervous system. This video demonstrates an assay for neural induction in chick embryo.

Test di induzione neurale nell&#39;embrione Chick

A Neuronal and Astrocyte Co-Culture Assay for High Content Analysis of Neurotoxicity

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing measurement of multiple cellular phenotypes within a single assay. In this study, we utilized HCA to develop a novel assay for neurotoxicity. Neurotoxicity assessment represents an important part of drug safety evaluation, as well as being a significant focus of environmental protection efforts. Additionally, neurotoxicity is also a well-accepted in vitro marker of the development of neurodegenerative diseases such as Alzheimer's and Parkinson's diseases. Recently, the application of HCA to neuronal screening has been reported. By labeling neuronal cells with &beta;III-tubulin, HCA assays can provide high-throughput, non-subjective, quantitative measurements of parameters such as neuronal number, neurite count and neurite length, all of which can indicate neurotoxic effects. However, the role of astrocytes remains unexplored in these models. Astrocytes have an integral role in the maintenance of central nervous system (CNS) homeostasis, and are associated with both neuroprotection and neurodegradation when they are activated in response to toxic substances or disease states. GFAP is an intermediate filament protein expressed predominantly in the astrocytes of the CNS. Astrocytic activation (gliosis) leads to the upregulation of GFAP, commonly accompanied by astrocyte proliferation and hypertrophy. This process of reactive gliosis has been proposed as an early marker of damage to the nervous system. The traditional method for GFAP quantitation is by immunoassay. This approach is limited by an inability to provide information on cellular localization, morphology and cell number. We determined that HCA could be used to overcome these limitations and to simultaneously measure multiple features associated with gliosis - changes in GFAP expression, astrocyte hypertrophy, and astrocyte proliferation - within a single assay. In co-culture studies, astrocytes have been shown to protect neurons against several types of toxic insult and to critically influence neuronal survival. Recent studies have suggested that the use of astrocytes in an in vitro neurotoxicity test system may prove more relevant to human CNS structure and function than neuronal cells alone. Accordingly, we have developed an HCA assay for co-culture of neurons and astrocytes, comprised of protocols and validated, target-specific detection reagents for profiling &beta;III-tubulin and glial fibrillary acidic protein (GFAP). This assay enables simultaneous analysis of neurotoxicity, neurite outgrowth, gliosis, neuronal and astrocytic morphology and neuronal and astrocytic development in a wide variety of cellular models, representing a novel, non-subjective, high-throughput assay for neurotoxicity assessment. The assay holds great potential for enhanced detection of neurotoxicity and improved productivity in neuroscience research and drug discovery.

This article describes a novel protocol and reagent set designed for sensitive measurement of neurotoxic effects of compounds and treatments on co-cultures of neurons and astrocytes using high content analysis. Results demonstrate that high content analysis represents an exciting novel technology for neurotoxicity assessment.

Un neuronale e astrociti Co-Cultura Assay per l&#39;analisi dei contenuti elevati di neurotossicità

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing ...

Dissection of Hippocampal Dentate Gyrus from Adult Mouse

The hippocampus is one of the most widely studied areas in the brain because of its important functional role in memory processing and learning, its remarkable neuronal cell plasticity, and its involvement in epilepsy, neurodegenerative diseases, and psychiatric disorders. The hippocampus is composed of distinct regions; the dentate gyrus, which comprises mainly granule neurons, and Ammon's horn, which comprises mainly pyramidal neurons, and the two regions are connected by both anatomic and functional circuits. Many different mRNAs and proteins are selectively expressed in the dentate gyrus, and the dentate gyrus is a site of adult neurogenesis; that is, new neurons are continually generated in the adult dentate gyrus. To investigate mRNA and protein expression specific to the dentate gyrus, laser capture microdissection is often used. This method has some limitations, however, such as the need for special apparatuses and complicated handling procedures. In this video-recorded protocol, we demonstrate a dissection technique for removing the dentate gyrus from adult mouse under a stereomicroscope. Dentate gyrus samples prepared using this technique are suitable for any assay, including transcriptomic, proteomic, and cell biology analyses. We confirmed that the dissected tissue is dentate gyrus by conducting real-time PCR of dentate gyrus-specific genes, tryptophan 2,3-dioxygenase (TDO2) and desmoplakin (Dsp), and Ammon's horn enriched genes, Meis-related gene 1b (Mrg1b) and TYRO3 protein tyrosine kinase 3 (Tyro3). The mRNA expressions of TDO2 and Dsp in the dentate gyrus samples were detected at obviously higher levels, whereas Mrg1b and Tyro3 were lower levels, than those in the Ammon's horn samples. To demonstrate the advantage of this method, we performed DNA microarray analysis using samples of whole hippocampus and dentate gyrus. The mRNA expression of TDO2 and Dsp, which are expressed selectively in the dentate gyrus, in the whole hippocampus of alpha-CaMKII+/- mice, exhibited 0.037 and 0.10-fold changes compared to that of wild-type mice, respectively. In the isolated dentate gyrus, however, these expressions exhibited 0.011 and 0.021-fold changes compared to that of wild-type mice, demonstrating that gene expression changes in dentate gyrus can be detected with greater sensitivity. Taken together, this convenient and accurate dissection technique can be reliably used for studies focused on the dentate gyrus.

A dissection technique for removal of the dentate gyrus from adult mouse under a stereomicroscope was demonstrated in this video-recorded protocol.

Dissezione di giro dentato ippocampale di topo adulto

The hippocampus is one of the most widely studied areas in the brain because of its important functional role in memory processing and learning, its ...

Rapid Genetic Analysis of Epithelial-Mesenchymal Signaling During Hair Regeneration

Hair follicle morphogenesis, a complex process requiring interaction between epithelia-derived keratinocytes and the underlying mesenchyme, is an attractive model system to study organ development and tissue-specific signaling. Although hair follicle development is genetically tractable, fast and reproducible analysis of factors essential for this process remains a challenge. Here we describe a procedure to generate targeted overexpression or shRNA-mediated knockdown of factors using lentivirus in a tissue-specific manner. Using a modified version of a hair regeneration model 5, 6, 11, we can achieve robust gain- or loss-of-function analysis in primary mouse keratinocytes or dermal cells to facilitate study of epithelial-mesenchymal signaling pathways that lead to hair follicle morphogenesis. We describe how to isolate fresh primary mouse keratinocytes and dermal cells, which contain dermal papilla cells and their precursors, deliver lentivirus containing either shRNA or cDNA to one of the cell populations, and combine the cells to generate fully formed hair follicles on the backs of nude mice. This approach allows analysis of tissue-specific factors required to generate hair follicles within three weeks and provides a fast and convenient companion to existing genetic models.

Tissue-specific analysis of a hair follicle regeneration model using lentivirus to mediate gain- or loss-of-function.

Rapida analisi genetica di epitelio-mesenchimale segnalazione durante la rigenerazione dei capelli

Hair follicle morphogenesis, a complex process requiring interaction between epithelia-derived keratinocytes and the underlying mesenchyme, is an ...

Alternative Cultures for Human Pluripotent Stem Cell Production, Maintenance, and Genetic Analysis

Human pluripotent stem cells (hPSCs) hold great promise for regenerative medicine and biopharmaceutical applications. Currently, optimal culture and efficient expansion of large amounts of clinical-grade hPSCs are critical issues in hPSC-based therapies. Conventionally, hPSCs are propagated as colonies on both feeder and feeder-free culture systems. However, these methods have several major limitations, including low cell yields and generation of heterogeneously differentiated cells. To improve current hPSC culture methods, we have recently developed a new method, which is based on non-colony type monolayer (NCM) culture of dissociated single cells. Here, we present detailed NCM protocols based on the Rho-associated kinase (ROCK) inhibitor Y-27632. We also provide new information regarding NCM culture with different small molecules such as Y-39983 (ROCK I inhibitor), phenylbenzodioxane (ROCK II inhibitor), and thiazovivin (a novel ROCK inhibitor). We further extend our basic protocol to cultivate hPSCs on defined extracellular proteins such as the laminin isoform 521 (LN-521) without the use of ROCK inhibitors. Moreover, based on NCM, we have demonstrated efficient transfection or transduction of plasmid DNAs, lentiviral particles, and oligonucleotide-based microRNAs into hPSCs in order to genetically modify these cells for molecular analyses and drug discovery. The NCM-based methods overcome the major shortcomings of colony-type culture, and thus may be suitable for producing large amounts of homogeneous hPSCs for future clinical therapies, stem cell research, and drug discovery.

Here, we present human pluripotent stem cell (hPSC) culture protocols, based on non-colony type monolayer (NCM) growth of dissociated single cells. This new method, utilizing Rho-associated kinase inhibitors or the laminin isoform 521 (LN-521), is suitable for producing large amounts of homogeneous hPSCs, genetic manipulation, and drug discovery.

Le colture per pluripotenti umane alternative staminali produzione di celle, manutenzione e analisi genetica

Human pluripotent stem cells (hPSCs) hold great promise for regenerative medicine and biopharmaceutical applications. Currently, optimal culture and ...

DNA Electroporation, Isolation and Imaging of Myofibers

Mature muscle has a unique structure that is amenable to live cell imaging. Herein, we describe the experimental protocol for expressing fluorescently labeled proteins in the flexor digitorum brevis (FDB) muscle. Conditions have been optimized to provide a large number of high quality myofibers expressing the electroporated plasmid while minimizing muscle damage. The method employs fluorescent tags on various proteins. Combining this expression method with high resolution confocal microscopy permits live cell imaging, including imaging after laser-induced damage. Fluorescent dyes combined with imaging of fluorescently-tagged proteins provides information regarding the basic structure of muscle and its response to stimuli.

This protocol utilizes electroporation to introduce and express fluorescently labeled proteins in mouse muscle fibers. Following recovery after electroporation, fibers are isolated. Individual fibers are then imaged using high resolution confocal microscopy to visualize muscle structure.

Elettroporazione DNA, isolamento e imaging di miofibre

Mature muscle has a unique structure that is amenable to live cell imaging. Herein, we describe the experimental protocol for expressing fluorescently ...