Наша работа по локализации РНК при поддержке гранта NIH (R01GM071049) для KLM.

Часть 1: Транскрипция флуоресцентно меченных мРНК. <ol><li> Линеаризации плазмиды ДНК, содержащей элемент РНК локализации или другие соответствующие последовательности и ресуспендирования на 1 мкг / мкл DEPC обработанных H 2 O. ДНК шаблоне должен быть выше по течению сайтов промотор для транскрипции Т7, SP6, или T3 РНК-полимеразы. </li><li> Добавить следующие реагенты для стерильного 1,5 мл трубки: <table><tbody><tr><td> a. 10X Tx буфере (см. М &amp; М) </td><td> 2 мкл </td></tr><tr><td> b. 20X шапка / NTP смеси (см. М &amp; М) </td><td> 1 мкл </td></tr><tr><td> c. 1 мМ Alexa Fluor 546-14-UTP (Invitrogen) </td><td> 1 мкл </td></tr><tr><td> d. UTP, [α-32 P] (1 мкКи / мкл) (Perkin Elmer) </td><td> 1 мкл </td></tr><tr><td> e. DEPC-H 2 O </td><td> 11 мкл </td></tr><tr><td> f. 0,2 М ДТТ </td><td> 1 мкл </td></tr><tr><td> g. RNasin (Promega) </td><td> 1 мкл </td></tr><tr><td> час линейная ДНК-матрицы </td><td> 1 мкл </td></tr><tr><td> i. РНК-полимеразы (Promega) </td><td> 1 мкл </td></tr></tbody></table></li><li> Смешайте реагенты мягко и центрифуга кратко (10 сек. В микроцентрифужных). </li><li> Инкубируйте в течение 2-4 часов при 37 ° C, покрытие трубы с алюминиевой фольгой, чтобы предотвратить фотообесцвечивания флуорофора. </li><li> Добавить 1 мкл 1 мг / мл РНКазы без ДНКазы (Promega) деградировать шаблона ДНК. </li><li> Инкубировать 15 минут при температуре 37 ° C. </li><li> Добавить 79 мкл 20 мМ ЭДТА (рН 8,0), чтобы остановить реакцию. </li><li> Удалить 1 мкл в отдельную трубу, помеченные как &quot;вход&quot; и сохранить. </li><li> Спиновые реакции через 1 мл G50 колонке (см. Материалы и методы), который будет включать неинкорпорированных нуклеотиды, исключая полное мРНК длиной. </li><li> Концентрат РНК этанолом осадков: <ol class="lalpha"><li> Добавьте 250 мкл 100% этанола, 10 мкл 7М CH 3 COONH 4, 1 мкл носителя РНК (тРНК дрожжей, 10 мкг / мкл) или 1 мкл гликогена (20 мг / мл). </li><li> Хорошо перемешать и заморозить до твердого при -80 ° С в течение&gt; 30 минут или на сухом льду в течение 15 минут. </li><li> Спиновые на максимальной скорости в микроцентрифужных течение 15 минут, сцедить супернатант. </li><li> Промыть 150 мкл 75% этанола. </li><li> Спиновые в течение 3 минут при максимальной скорости в микроцентрифужных, переливать супернатант. </li><li> Сухие гранулы при температуре 37 ° С в течение 3 минут, чтобы все этанола не испарится. </li></ol></li><li> Ресуспендируют в 11 мкл DEPC-H 2 O и удалить 1 мкл до отдельной трубки, помеченные как &quot;включено&quot;. </li><li> Определить процент включения и разбавленных РНК до 50 нм (см. Материалы и методы расчета). </li><li> РНК должны быть заморожены в 5 мкл аликвот, для одноразового использования, чтобы избежать циклов замораживания / оттаивания и может храниться в течение нескольких недель при температуре -80 ° C. </li></ol> Часть 2: Подготовка к Микроинъекция. <ol><li> РНК приготовления: Оттепель аликвоту РНК (50 нм) и денатурации РНК при 70 ° С в течение 3-5 минут. Спиновые в течение 10 минут при комнатной температуре микроцентрифужных на максимальной скорости, чтобы удалить твердые частицы, и держать на льду. </li><li> Подготовка ооцитов: <ol class="lalpha"><li> Хирургическим путем удалить яичники из Xenopus laevis женщин (НАСКО). </li><li> Обрезать куски яичников Xenopus laevis в 50 мл коническую пробирку с 25 мл коллагеназы решения (см. Материалы и Методы). </li><li> Встряска мягко при 18 ° С в течение 15 минут, или пока ооцитов заметно отделен от яичника. Из-за партии к партии вариации, коллагеназы время лечения может варьироваться и должны находиться под тщательным наблюдением через визуальный осмотр с целью обеспечения defoliculation. </li><li> Разрешить ооцитов, чтобы обосноваться в трубу, удалить раствор и промыть ооциты с буфером MBSH (см. Материалы и Методы). </li><li> Повторите мыть два раза больше, в общей сложности три стирок. Этот протокол ооцитов изоляции аналогичен подробно изложены в Cohen и соавт., 2009. </li><li> Вручную рода этап III / IV ооцитов (Дюмон, 1972) в MBSH буфера при стандартных рассекает микроскопом. Стадия III ооцитов полностью непрозрачны, но белый, в то время этапа IV ооцитов чуть больше, и с крапинами с пигментом. Ооцитов, которые немного прозрачной слишком молоды и ооцитов, которые полностью пигментированные или выставлять поляризованным распределением пигмента слишком стары. </li></ol></li><li> Иглы Способ приготовления: Вытяните и конические иглы наружный диаметр ~ 0,05 мм. (Мы используем Драммонд Научно 3,5-дюймовый капилляров (приказ № 3-000-203-G / X), инструмент Саттер Ко микропипетки съемник и WPI Инк beveller.) </li></ol> Часть 3: Микроинъекция <ol><li> Калибровка игла с DEPC-H 2 O для доставки 2 п на инъекцию. Мы нагрузка на переднюю нашей иглу использованием газа управляемой microinjector (см. Материалы и методы), и калибровки падение размера с помощью микрометра. </li><li> Нагрузка РНК в иглу. </li><li> Место отсортированы ооцитов в инъекции блюдо с MBSH буфера. Мы microinject на блюдо слой черного поролона. Бледно ооцитов выделяются также на белом backgrouй. </li><li> Внимательно вводить каждый ооцит с 2 п РНК при 50 нМ. </li><li> Выгнать РНК, промойте иглу с DEPC-H 2 O, и загрузить следующий РНК для инъекций. </li></ol> Часть 4: ооцитов культуры <ol><li> Место ооцитов в скважине стерильные 24-луночного планшета (Sigma Aldrich). Мы культуры до тысячи яйцеклеток на лунку. </li><li> Удалить буфера и заменить 400 мкл О ocyte C ulture М edium (ОСМ, см. Материалы и методы) на лунку. Место культуры пластины внутри герметичный пластиковый контейнер с мокрым бумажным полотенцем, чтобы сохранить влажную среду во время культуры. </li><li> Инкубируйте ооцитов при 18 ° С в течение временных точках в диапазоне от 8 до 48 часов. </li></ol> Часть 5: фиксация, обезвоживания и хранения ооцитов <ol><li> Сортировать любые мертвые ооцитов и место выживших ооцитов в стеклянных флаконах. Мы регулярно наблюдаем&gt; 90% выживаемости. </li><li> Место ооцитов в MEMFA фиксатором (см. Материалы и методы) и рок-течение 20 минут. Защита ооцитов от света, покрывая с алюминиевой фольгой. </li><li> Вымойте ооцитов путем удаления фиксатора и замена с равным объемом MBSH буфера. Повторите это еще раз мыть в общей сложности два стирок. </li><li> Вымойте ооцитов в безводном метаноле: <ol class="lalpha"><li> Удаление половины объема, заменить метанол. </li><li> Повторите шаг &quot;&quot; в два раза. </li><li> Удалите все решения, заменить метанол. </li><li> Повторите метанола стирки. </li></ol></li><li> Ооциты могут храниться при температуре -20 ° С до готовности изображения. </li></ol> Часть 6: Локализация РНК изображений с помощью конфокальной микроскопии <ol><li> Перед изображения, добавлять Клиринговый Средний Мюррей ы (2:1 бензилбензоата-бензилового спирта), чтобы FluoroDish стеклянным дном (WPI Inc) для покрытия изображения поверхности. </li><li> Тщательно передачи ооцитов из метанола, FluoroDish, сводя к минимуму объем метанола переданы. </li><li> Изображение на перевернутую конфокальной микроскопии (Мы успешно использовали Zeiss LSM510 и Leica TCS SP2). </li></ol><img src="/files/ftp_upload/1704/1704fig1.jpg" alt="Рисунок 1" /> Рисунок 1:.. Визуализация субклеточных Локализация РНК Микроинъекция флуоресцентно меченых стенограммы А. После микроинъекции, РНК помечена Alexa Fluor 546 изначально ограничен ядром В. После восьми часов культуры, флуоресцентно меченных контроль РНК можно увидеть равномерно распространяется в цитоплазме яйцеклетки. C. Однако, флуоресцентно меченой РНК содержащие последовательности, которые вербуют транспортного машиностроения можно увидеть в процессе внутриклеточной локализации растительного полюса яйцеклетки (в направлении снизу). Шкала бар = 50 мкм.

<ol>
	<li>Cohen, S., Au, S., Pant, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microinjection+of+Xenopus+laevis+oocytes.">Microinjection of Xenopus laevis oocytes.</a> JoVE. 24, (2009).</li><li>Dumont, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oogenesis+in+Xenopus+laevis+(Daudin).+I.+Stages+of+oocyte+development+in+laboratory+maintained+animals.">Oogenesis in Xenopus laevis (Daudin). I. Stages of oocyte development in laboratory maintained animals.</a> J. Morphol. 136, 153-179 (1972).</li><li>Gagnon, J. A., Mowry, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+transport+in+ovo:+Simultaneous+visualization+of+two+RNAs.">RNA transport in ovo: Simultaneous visualization of two RNAs.</a> Mol Reprod Dev. 76, 1115-1115 (2009).</li><li>Gautreau, D., Cote, C. A., Mowry, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+copies+of+a+subelement+from+the+Vg1+RNA+localization+sequence+are+sufficient+to+direct+vegetal+localization+in+Xenopus+oocytes.">Two copies of a subelement from the Vg1 RNA localization sequence are sufficient to direct vegetal localization in Xenopus oocytes.</a> Development. 124, 5013-5020 (1997).</li><li>Lewis, R. A., Gagnon, J. A., Mowry, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PTB/hnRNP+I+is+required+for+RNP+remodeling+during+RNA+localization+in+Xenopus+oocytes.">PTB/hnRNP I is required for RNP remodeling during RNA localization in Xenopus oocytes.</a> Mol Cell Biol. 28, 678-6786 (2008).</li><li>Messitt, T. J., Gagnon, J. A., Kreiling, J. A., Pratt, C. A., Yoon, Y. J., Mowry, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+kinesin+motors+coordinate+cytoplasmic+RNA+transport+on+a+subpopulation+of+microtubules+in+Xenopus+oocytes.">Multiple kinesin motors coordinate cytoplasmic RNA transport on a subpopulation of microtubules in Xenopus oocytes.</a> Dev Cell. 15, 426-436 (2008).</li><li>Mowry, K. L., Melton, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vegetal+messenger+RNA+localization+directed+by+a+340-nt+RNA+sequence+element+in+Xenopus+oocytes.">Vegetal messenger RNA localization directed by a 340-nt RNA sequence element in Xenopus oocytes.</a> Science. 255, 991-994 (1992).</li><li>Yoon, Y. J., Mowry, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xenopus+Staufen+is+a+component+of+a+ribonucleoprotein+complex+containing+Vg1+RNA+and+kinesin.">Xenopus Staufen is a component of a ribonucleoprotein complex containing Vg1 RNA and kinesin.</a> Development. 131, 3035-3045 (2004).</li></ol>

Эксперименты с использованием лабораторных животных были проведены в соответствии с руководящими принципами и правилами установленными Университете Брауна.

Здесь мы представили протокол для визуализации локализации мРНК в ооцитах Xenopus. Этот метод, с помощью флуоресцентно меченных РНК-транскрипты имеет более высокое отношение сигнал-шум, чем ранее полученные с дигоксигенин меченных стенограммы и проще, и быстрее, чем на месте подход (?...

A correction to the step 2 of Part 1 for article Visualizing RNA Localization in Xenopus Oocytes.

Erratum: Visualizing RNA Localization in Xenopus Oocytes

10X буфера Tx <ul><li class="none"> 60 мМ MgCl 2 </li><li class="none"> 400 мМ Трис-HCl (рН 7,5) </li><li class="none"> 20 мМ спермидина-HCl </li></ul> 20x шапка / NTP смеси <ul><li class="none"> 10 мМ CTP </li><li class="none"> 10 мМ ATP </li><li class="none"> 9 мм UTP </li><li class="none"> 2 мМ GTP </li><li class="none"> 20 мМ G (ППС) G Cap аналоговый (New England Biolabs) </li></ul> G-50 колонке <ul><li class="none"> Гидратов 5 г Сефадекс G-50 бусин (Sigma Aldrich) в 100 мл деионизированной H 2 O. DEPC лечению в течение 30 мин. и автоклав. Магазин неполный запас при комнатной температуре. Перед употреблением добавить следующие РНКазы без решения: </li><li class="none"> 0,5 мл 0,2 М ЭДТА </li><li class="none"> 1 мл 1 М Трис рН 8,0 </li><li class="none"> 0,5 мл 20% SDS </li><li class="none"> Магазин полный G-50 решение при 4 ° C. </li><li class="none"> Удаляют поршень от 3 мл шприцем (BD Biosciences) и поместите баррель шприца в 15 мл коническую трубку (Corning). Вставьте шприц с небольшим количеством стекловаты (плагин около половины размера копейки). </li><li class="none"> Swirl полный G-50 решение для ресуспендирования бисером. </li><li class="none"> Добавить 2 мл G-50 решение пустой столбец. </li><li class="none"> Спиновые течение 1 минуты при 1000 х г в центрифуге настольный. </li><li class="none"> Добавить 200 мкл DEPC обработанных деионизированной H 2 O для каждого столбца. Spin. </li><li class="none"> Повторите мыть два раза больше, в общей сложности три стирок. </li><li class="none"> Удалите шприц баррель до 15 мл свежего коническую трубку. </li></ul> Коллагеназа решение <ul><li class="none"> 75 мг коллагеназы из Clostridium histolyticum (Sigma Aldrich) </li><li class="none"> 25 мл 0,1 М КПО 3 + (рН 7,4) </li></ul> MBSH буфер <ul><li class="none"> 88 мМ NaCl </li><li class="none"> 1 мМ KCl </li><li class="none"> 2,4 мМ NaHCO 3 </li><li class="none"> 0,82 мМ MgSO 4 x 7H 2 O </li><li class="none"> 0,33 мМ Ca (NO 3) 2 X 4H 2 O </li><li class="none"> 0,41 мМ CaCl 2 х 6H 2 O </li><li class="none"> 10 мМ HEPES (рН 7,6) </li></ul> Средний ооцитов культуры <ul><li class="none"> 50% L15 среда </li><li class="none"> 15 мМ HEPES (рН 7,6) </li><li class="none"> 1 мг / мл инсулина </li><li class="none"> 100 мг / мл гентамицина </li><li class="none"> 50 ед / мл нистатина </li><li class="none"> 50 ед / мл пенициллина </li><li class="none"> 50 мг / мл стрептомицина </li></ul> MEMFA решение <ul><li class="none"> 0,1 М MOPS (рН 7,4) </li><li class="none"> 2 мМ EGTA </li><li class="none"> 1 мМ MgSO 4 </li><li class="none"> 3,7% формальдегида </li></ul> Вычислительная РНК выход <ul><li class="none"> Определите CPM в &quot;вход&quot; и &quot;включить&quot; образцы с использованием стандартного сцинтилляционного счетчика. </li><li class="none"> Включение = (&quot;включено&quot;) / (10 х &quot;вход&quot;) </li><li class="none"> Типичные значения включению в диапазоне от ~ 0,03 и 0,10. </li><li class="none"> Максимальная теоретическая доходность для разных полимераз: T7, T3, SP6 - 2,64 мкг </li><li class="none"> Реакция выхода в мкг = (максимальный выход полимеразы используется) X (включение) </li><li class="none"> Развести РНК до 50 нм = (мкг РНК) / 320 / (длина РНК в базах) / (5x10 -8) </li><li class="none"> Реакция обычно дает ~ 50-100 мкл РНК на 50 нм. </li></ul>

visualizing rna localization in xenopus oocytes

РНК локализация сохраняется механизм формирования клеточной полярности. Vg1 мРНК локализуется на растительном полюса Xenopus laevis ооциты и действует на пространственно ограничить экспрессии генов Vg1 белка. Жесткий контроль Vg1 распределение таким образом, необходимо для правильного выбора слой зародыша в развивающемся эмбрионе. РНК последовательности элементов в 3 &#39;UTR мРНК, Vg1 локализации элемента (VLE) необходимы и достаточны для прямого транспорта. Для изучения признание и транспортировки Vg1 мРНК в естественных условиях, мы разработали изображений метод, который позволяет обширный анализ транс-фактора направлено транспортных механизмов с помощью простого визуального считывания. Чтобы визуализировать локализацию РНК, мы синтезировать флуоресцентно меченных VLE РНК и microinject эту стенограмму в отдельные ооциты. После ооцитов культуры, чтобы перевозки вводили РНК, ооциты являются фиксированными и обезвоженные до визуализации с помощью конфокальной микроскопии. Визуализация модели локализации мРНК обеспечивает считывание для мониторинга полный путь РНК транспорта и для выявления роли в управлении РНК транспорта для цис-действующих элементов в стенограмме и транс-действующих факторов, которые связываются с VLE (Lewis и соавт., 2008, Messitt и соавт., 2008). Мы расширили эту технику в рамках совместного с дополнительной локализации РНК и белков (Ганьон и Моури, 2009, Messitt и соавт., 2008), а в сочетании с нарушением моторных белков и цитоскелет (Messitt и соавт., 2008), чтобы исследовать механизмы, лежащие мРНК локализации.

Watch this Scientific Journal Video about Visualizing RNA Localization in Xenopus Oocytes at JoVE.com

Visualizing RNA Localization in Xenopus Oocytes

Визуализация<em&gt; В естественных условиях</em&gt; РНК транспорта осуществляется путем микроинъекции флуоресцентно меченных транскриптов РНК в<em&gt; Xenopus</em&gt; Ооцитов, а затем с помощью конфокальной микроскопии.

Визуализация РНК Локализация в Xenopus Ооцитов

RNA localization is a conserved mechanism of establishing cell polarity.  Vg1 mRNA localizes to the vegetal pole of Xenopus laevis oocytes and acts to ...

visualizing-rna-localization-in-xenopus-oocytes

Research

JoVE Journal

Biology

Visualizing RNA Localization in Xenopus Oocytes

11.5K Views.  Brown University. Визуализация В естественных условиях РНК транспорта осуществляется путем микроинъекции флуоресцентно меченных транскриптов РНК в Xenopus Ооцитов, а затем с помощью конфокальной микроскопии.

Video: Visualizing RNA Localization in Xenopus Oocytes

Patch Clamp Recording of Ion Channels Expressed in  Xenopus Oocytes

Since its development by Sakmann and Neher 1, 2, the patch clamp has become established as an extremely useful technique for electrophysiological measurement of single or multiple ion channels in cells. This technique can be applied to ion channels in both their native environment and expressed in heterologous cells, such as oocytes harvested from the African clawed frog, Xenopus laevis. Here, we describe the well-established technique of patch clamp recording from Xenopus oocytes. This technique is used to measure the properties of expressed ion channels either in populations (macropatch) or individually (single-channel recording). We focus on techniques to maximize the quality of oocyte preparation and seal generation. With all factors optimized, this technique gives a probability of successful seal generation over 90 percent. The process may be optimized differently by every researcher based on the factors he or she finds most important, and we present the approach that have lead to the greatest success in our hands.

This is intended as an introduction to patch clamp recording from Xenopus laevis oocytes. It covers vitelline membrane removal, formation of a gigaohm seal (gigaseal), and the optional conversion of the patch to the outside-out topology.

Патч зажим Запись ионных каналов, выраженные в ооцитов Xenopus

Since its development by Sakmann and Neher 1, 2, the patch clamp has become established as an extremely useful technique for electrophysiological ...

Microinjection of Xenopus Laevis Oocytes

Microinjection of Xenopus laevis oocytes followed by thin-sectioning electron microscopy (EM) is an excellent system for studying nucleocytoplasmic transport. Because of its large nucleus and high density of nuclear pore complexes (NPCs), nuclear transport can be easily visualized in the Xenopus oocyte. Much insight into the mechanisms of nuclear import and export has been gained through use of this system (reviewed by Pant&eacute;, 2006). In addition, we have used microinjection of Xenopus oocytes to dissect the nuclear import pathways of several viruses that replicate in the host nucleus. 
Here we demonstrate the cytoplasmic microinjection of Xenopus oocytes with a nuclear import substrate. We also show preparation of the injected oocytes for visualization by thin-sectioning EM, including dissection, dehydration, and embedding of the oocytes into an epoxy embedding resin. Finally, we provide representative results for oocytes that have been microinjected with the capsid of the baculovirus Autographa californica nucleopolyhedrovirus (AcMNPV) or the parvovirus Minute Virus of Mice (MVM), and discuss potential applications of the technique.

Here we demonstrate cytoplasmic microinjection of Xenopus laevis oocytes with a nuclear import substrate, as well as preparation of the injected oocytes for visualization by thin-sectioning electron microscopy.

Микроинъекции Xenopus ооцитов Laevis

Microinjection of Xenopus laevis oocytes followed by thin-sectioning electron microscopy (EM) is an excellent system for studying nucleocytoplasmic ...

Fertilization of Xenopus oocytes using the Host Transfer Method

Studying the contribution of maternally inherited molecules to vertebrate early development is often hampered by the time and expense necessary to generate maternal-effect mutant animals. Additionally, many of the techniques to overexpress or inhibit gene function in organisms such as Xenopus and zebrafish fail to sufficiently target critical maternal signaling pathways, such as Wnt signaling. In Xenopus, manipulating gene function in cultured oocytes and subsequently fertilizing them can ameliorate these problems to some extent. Oocytes are manually defolliculated from donor ovary tissue, injected or treated in culture as desired, and then stimulated with progesterone to induce maturation. Next, the oocytes are introduced into the body cavity of an ovulating host female frog, whereupon they will be translocated through the host's oviduct and acquire modifications and jelly coats necessary for fertilization. The resulting embryos can then be raised to the desired stage and analyzed for the effects of any experimental perturbations. This host-transfer method has been highly effective in uncovering basic mechanisms of early development and allows a wide range of experimental possibilities not available in any other vertebrate model organism.

Fertilization of Xenopus oocytes using the Host Transfer Method

Procedure for fertilizing Xenopus oocytes by the host transfer method.

Оплодотворение Xenopus ооцитов Использованием метода передачи хост

Studying the contribution of maternally inherited molecules to vertebrate early development is often hampered by the time and expense necessary to ...

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may also be used to study the structure-function relationship for other ion channels and neurotransmitter receptors1. BK channels are widely expressed in different tissues and have been implicated in many physiological functions, including regulation of smooth muscle contraction, frequency tuning of inner hair cells and regulation of neurotransmitter release2-6. BK channels are activated by membrane depolarization and by intracellular Ca2+ and Mg2+ 6-9. Therefore, the protocol is designed to control both the membrane voltage and the intracellular solution. In this protocol, messenger RNA of BK channels is injected into Xenopus laevis oocytes (stage V-VI) followed by 2-5 days of incubation at 18&deg;C10-13. Membrane patches that contain single or multiple BK channels are excised with the inside-out configuration using patch clamp techniques10-13. The intracellular side of the patch is perfused with desired solutions during recording so that the channel activation under different conditions can be examined. To summarize, the mRNA of BK channels is injected into Xenopus laevis oocytes to express channel proteins on the oocyte membrane; patch clamp techniques are used to record currents flowing through the channels under controlled voltage and intracellular solutions.

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

Ionic current of BK channels is recorded using patch clamp techniques. BK channels are expressed in Xenopus oocytes by injecting messenger RNA. The intracellular solution during patch clamp recordings is controlled by a perfusion system.

Зажим Patch и перфузии Методы изучения ионных каналов, выраженные в Xenopus Ооцитов

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may ...

In vitro Transcription and Capping of Gaussia Luciferase mRNA Followed by HeLa Cell Transfection

In vitro transcription is the synthesis of RNA transcripts by RNA polymerase from a linear DNA template containing the corresponding promoter sequence (T7, T3, SP6) and the gene to be transcribed (Figure 1A). A typical transcription reaction consists of the template DNA, RNA polymerase, ribonucleotide triphosphates, RNase inhibitor and buffer containing Mg2+ ions.
Large amounts of high quality RNA are often required for a variety of applications. Use of in vitro transcription has been reported for RNA structure and function studies such as splicing1, RNAi experiments in mammalian cells2, antisense RNA amplification by the "Eberwine method"3, microarray analysis4 and for RNA vaccine studies5. The technique can also be used for producing radiolabeled and dye labeled probes6. Warren, et al. recently reported reprogramming of human cells by transfection with in vitro transcribed capped RNA7. The T7 High Yield RNA Synthesis Kit from New England Biolabs has been designed to synthesize up to 180 &mu;g RNA per 20 &mu;l reaction. RNA of length up to 10kb has been successfully transcribed using this kit. Linearized plasmid DNA, PCR products and synthetic DNA oligonucleotides can be used as templates for transcription as long as they have the T7 promoter sequence upstream of the gene to be transcribed.
Addition of a 5' end cap structure to the RNA is an important process in eukaryotes. It is essential for RNA stability8, efficient translation9, nuclear transport10 and splicing11. The process involves addition of a 7-methylguanosine cap at the 5' triphosphate end of the RNA. RNA capping can be carried out post-transcriptionally using capping enzymes or co-transcriptionally using cap analogs. In the enzymatic method, the mRNA is capped using the Vaccinia virus capping enzyme12,13. The enzyme adds on a 7-methylguanosine cap at the 5' end of the RNA using GTP and S-adenosyl methionine as donors (cap 0 structure). Both methods yield functionally active capped RNA suitable for transfection or other applications14 such as generating viral genomic RNA for reverse-genetic systems15 and crystallographic studies of cap binding proteins such as eIF4E16.
In the method described below, the T7 High Yield RNA Synthesis Kit from NEB is used to synthesize capped and uncapped RNA transcripts of Gaussia luciferase (GLuc) and Cypridina luciferase (CLuc). A portion of the uncapped GLuc RNA is capped using the Vaccinia Capping System (NEB). A linearized plasmid containing the GLuc or CLuc gene and T7 promoter is used as the template DNA. The transcribed RNA is transfected into HeLa cells and cell culture supernatants are assayed for luciferase activity. Capped CLuc RNA is used as the internal control to normalize GLuc expression.

In vitro Transcription and Capping of Gaussia Luciferase mRNA Followed by HeLa Cell Transfection

This method describes high yield in vitro synthesis of both capped and uncapped mRNA from a linearized plasmid containing the Gaussia luciferase (GLuc) gene. The RNA is purified and a fraction of the uncapped RNA is enzymatically capped using the Vaccinia virus capping enzyme. In the final step, the mRNA is transfected into HeLa cells and cell culture supernatants are assayed for luciferase activity.

В пробирке транскрипции и укупорки мРНК люциферазы Gaussia Вслед за Трансфекция Сотовые HeLa

In vitro transcription is the synthesis of RNA transcripts by RNA polymerase from a linear DNA template containing the corresponding promoter sequence ...

Measuring Cation Transport by Na,K- and H,K-ATPase in Xenopus Oocytes by Atomic Absorption Spectrophotometry: An Alternative to Radioisotope Assays

Whereas cation transport by the electrogenic membrane transporter Na+,K+-ATPase can be measured by electrophysiology, the electroneutrally operating gastric H+,K+-ATPase is more difficult to investigate. Many transport assays utilize radioisotopes to achieve a sufficient signal-to-noise ratio, however, the necessary security measures impose severe restrictions regarding human exposure or assay design. Furthermore, ion transport across cell membranes is critically influenced by the membrane potential, which is not straightforwardly controlled in cell culture or in proteoliposome preparations. Here, we make use of the outstanding sensitivity of atomic absorption spectrophotometry (AAS) towards trace amounts of chemical elements to measure Rb+ or Li+ transport by Na+,K+- or gastric H+,K+-ATPase in single cells. Using Xenopus oocytes as expression system, we determine the amount of Rb+ (Li+) transported into the cells by measuring samples of single-oocyte homogenates in an AAS device equipped with a transversely heated graphite atomizer (THGA) furnace, which is loaded from an autosampler. Since the background of unspecific Rb+ uptake into control oocytes or during application of ATPase-specific inhibitors is very small, it is possible to implement complex kinetic assay schemes involving a large number of experimental conditions simultaneously, or to compare the transport capacity and kinetics of site-specifically mutated transporters with high precision. Furthermore, since cation uptake is determined on single cells, the flux experiments can be carried out in combination with two-electrode voltage-clamping (TEVC) to achieve accurate control of the membrane potential and current. This allowed e.g. to quantitatively determine the 3Na+/2K+ transport stoichiometry of the Na+,K+-ATPase and enabled for the first time to investigate the voltage dependence of cation transport by the electroneutrally operating gastric H+,K+-ATPase. In principle, the assay is not limited to K+-transporting membrane proteins, but it may work equally well to address the activity of heavy or transition metal transporters, or uptake of chemical elements by endocytotic processes.

Measuring Cation Transport by Na,K- and H,K-ATPase in Xenopus Oocytes by Atomic Absorption Spectrophotometry: An Alternative to Radioisotope Assays

We describe a method to quantify the activity of K+-countertransporting P-type ATPases by heterologous expression of the enzymes in Xenopus oocytes and measuring Rb+ or Li+ uptake into individual cells by atomic absorption spectrophotometry. The method is a sensitive and safe alternative to radioisotope flux experiments facilitating complex kinetic studies.

Измерение Катионит транспорта по Na, K и H, K-АТФазы<em&gt; Xenopus</em&gt; Ооцитов методом атомно-абсорбционной спектрофотометрии: Альтернатива радиоизотопных Анализы

Whereas cation transport by the electrogenic membrane transporter Na+,K+-ATPase can be measured by electrophysiology, the electroneutrally operating ...

Facial Transplants in Xenopus laevis Embryos

Craniofacial birth defects occur in 1 out of every 700 live births, but etiology is rarely known due to limited understanding of craniofacial development. To identify where signaling pathways and tissues act during patterning of the developing face, a 'face transplant' technique has been developed in embryos of the frog Xenopus laevis. A region of presumptive facial tissue (the "Extreme Anterior Domain" (EAD)) is removed from a donor embryo at tailbud stage, and transplanted to a host embryo of the same stage, from which the equivalent region has been removed. This can be used to generate a chimeric face where the host or donor tissue has a loss or gain of function in a gene, and/or includes a lineage label. After healing, the outcome of development is monitored, and indicates roles of the signaling pathway within the donor or surrounding host tissues. Xenopus is a valuable model for face development, as the facial region is large and readily accessible for micromanipulation. Many embryos can be assayed, over a short time period since development occurs rapidly. Findings in the frog are relevant to human development, since craniofacial processes appear conserved between Xenopus and mammals.

Facial Transplants in Xenopus laevis Embryos

A technique for transplanting "Extreme Anterior Domain" facial tissue between Xenopus laevis embryos has been developed. Tissue can be moved from one gene expression background into another, allowing the study of local requirements for craniofacial development and for signaling interactions between facial regions.

Трансплантация лица в<em&gt; Xenopus Laevis</em&gt; Эмбрионы

Craniofacial birth defects occur in 1 out of every 700 live births, but etiology is rarely known due to limited understanding of craniofacial development. ...

Xenopus Oocytes: Optimized Methods for Microinjection, Removal of Follicular Cell Layers, and Fast Solution Changes in Electrophysiological Experiments

The Xenopus oocyte as a heterologous expression system for proteins, was first described by Gurdon et al.1 and has been widely used since its discovery (References 2 - 3, and references therein). A characteristic that makes the oocyte attractive for foreign channel expression is the poor abundance of endogenous ion channels4. This expression system has proven useful for the characterization of many proteins, among them ligand-gated ion channels.
The expression of GABAA receptors in Xenopus oocytes and their functional characterization is described here, including the isolation of oocytes, microinjections with cRNA, the removal of follicular cell layers, and fast solution changes in electrophysiological experiments. The procedures were optimized in this laboratory5,6 and deviate from the ones routinely used7-9. Traditionally, denuded oocytes are prepared with a prolonged collagenase treatment of ovary lobes at RT, and these denuded oocytes are microinjected with mRNA. Using the optimized methods, diverse membrane proteins have been expressed and studied with this system, such as recombinant GABAA receptors10-12, human recombinant chloride channels13, Trypanosome potassium channels14, and a myo-inositol transporter15, 16.
The methods detailed here may be applied to the expression of any protein of choice in Xenopus oocytes, and the rapid solution change can be used to study other ligand-gated ion channels.

Xenopus Oocytes: Optimized Methods for Microinjection, Removal of Follicular Cell Layers, and Fast Solution Changes in Electrophysiological Experiments

Optimized procedures for the isolation of single follicles, cytoplasmic RNA microinjections, the removal of surrounding cell layers, and protein expression in Xenopus oocytes are described. In addition, a simple method for fast solution changes in electrophysiological experiments with ligand-gated ion channels is presented.

Xenopus ооциты: Оптимизированные методы микроинъекции, Удаление тироцит слоев и быстрые изменения в Решение электрофизиологических экспериментов

The Xenopus oocyte as a heterologous expression system for proteins, was first described by Gurdon et al.1 and has been widely used since its discovery ...

TChIP-Seq: Cell-Type-Specific Epigenome Profiling

Epigenetic regulation plays central roles in gene expression. Since histone modification was discovered in the 1960s, its physiological and pathological functions have been extensively studied. Indeed, the advent of next-generation deep sequencing and chromatin immunoprecipitation (ChIP) via specific histone modification antibodies has revolutionized our view of epigenetic regulation across the genome. Conversely, tissues typically consist of diverse cell types, and their complex mixture poses analytic challenges to investigating the epigenome in a particular cell type. To address the cell type-specific chromatin state in a genome-wide manner, we recently developed tandem chromatin immunoprecipitation sequencing (tChIP-Seq), which is based on the selective purification of chromatin by tagged core histone proteins from cell types of interest, followed by ChIP-Seq. The goal of this protocol is the introduction of best practices of tChIP-Seq. This technique provides a versatile tool for tissue-specific epigenome investigation in diverse histone modifications and model organisms.

We describe a step-by-step protocol for tandem chromatin immunoprecipitation sequencing (tChIP-Seq) that enables the analysis of cell-type-specific genome-wide histone modification.

TChIP-Seq: Профилирование конкретного типа ячейки Epigenome

Epigenetic regulation plays central roles in gene expression. Since histone modification was discovered in the 1960s, its physiological and pathological ...

Visualizing Lymph Node Structure and Cellular Localization using Ex-Vivo Confocal Microscopy

Lymph nodes (LNs) are organs spread within the body, where the innate immune responses can connect with the adaptive immunity. In fact, LNs are strategically interposed in the path of the lymphatic vessels, allowing intimate contact of tissue antigens with all resident immune cells in the LN. Thus, understanding the cellular composition, distribution, location and interaction using ex vivo whole LN imaging will add to the knowledge on how the body coordinates local and systemic immune responses. This protocol shows an ex vivo imaging strategy following an in vivo administration of fluorescent-labeled antibodies that allows a very reproducible and easy-to-perform methodology by using conventional confocal microscopes and stock reagents. Through subcutaneous injection of antibodies, it is possible to label different cell populations in draining LNs without affecting tissue structures that can be potentially damaged by a conventional immunofluorescence microscopy technique.

This protocol describes a technique to image different cell populations in draining lymph nodes without alterations in the organ structure.