هذه الطريقة مناسبة للتصوير الحي لديناميات السيتوبلازم باستخدام مستخلصات بيض الضفدع ، مما يتيح دراسة معلومات النمط المكاني في السيتوبلازم. يمكن تشكيل العينات في طبقة بسمك موحد وقابل للتعديل وتصويرها عبر حقل 2D أو حجم 3D. هذه الطريقة فعالة من حيث التكلفة وسهلة التنفيذ.
ابدأ بوضع طبقة من الشريط اللاصق FEP على شريحة زجاجية باستخدام قضيب الأسطوانة. قطع الشريط الزائد على الحواف بشفرة حلاقة نظيفة. بعد ذلك ، قم بإعداد زلات الغطاء المطلي بشريط FEP بنفس الطريقة.
ثم ضع فاصل تصوير لاصق على الوجهين على الجانب المطلي بشريط FEP من الشريحة مع ترك البطانة الواقية غير مقشرة. انقل البيض إلى دورق زجاجي سعة 400 مل وقم بإزالة أكبر قدر ممكن من المخزن المؤقت لوضع البيض عن طريق الصب. ثم احتضان البيض في 100 ملليلتر من محلول إزالة الشوائب الطازج وقم بتحريكه برفق.
بعد حوالي ثلاث دقائق ، اسكب المحلول وأضف 100 مل من محلول إزالة الشوائب الطازج. استمر في الحضانة حتى يتم تعبئة البيض بإحكام ، ولكن تجنب ترك البيض في محلول إزالة الشوائب لأكثر من خمس دقائق. بعد الحضانة ، قم بإزالة محلول إزالة الشوائب قدر الإمكان واغسل البيض في محلول 0.25x MMR.
حرك البيض ، ثم اسكب العازلة. كرر عدة مرات حتى يتم استخدام ما مجموعه لتر واحد من المخزن المؤقت للغسيل. بعد ذلك ، اغسل البيض عدة مرات بإجمالي 400 مل من محلول تحلل البيض ، وإزالة البيض غير الطبيعي بين الغسيل.
ثم استخدم ماصة نقل ذات طرف عريض لنقل البيض إلى أنبوب طرد مركزي دائري القاع سعة 17 ملليلتر يحتوي على ملليلتر واحد من محلول تحلل البيض. قم بتدوير الأنبوب في جهاز طرد مركزي سريري بمعدل 400 جم لمدة 15 ثانية لتعبئة البيض. ثم قم بإزالة أكبر قدر ممكن من محلول تحلل البيض باستخدام ماصة باستور.
تحديد الحجم التقريبي للبيض المعبأ. ثم أضف خمسة ميكروغرام لكل ملليلتر من كل من أبروتينين وليببتين وسيتوكلاسين ب و 50 ميكروغرام لكل ملليلتر من سيكلوهيكساميد مباشرة فوق البيض المعبأ. سحق البيض عن طريق الطرد المركزي للأنبوب لمدة 15 دقيقة عند 12،000 جم وأربع درجات مئوية في دوار دلو متأرجح.
بعد ذلك ، قم بتوصيل إبرة قياس 18 بحقنة. مع توجيه طرف الإبرة المائل لأعلى ، قم بثقب الأنبوب من الجانب الموجود أسفل الطبقة السيتوبلازمية واستعد المستخلص عن طريق الرسم ببطء. انقل مستخلص السيتوبلازم المستعاد إلى أنبوب طرد مركزي دقيق جديد واحتفظ به على الجليد.
عندما تكون جاهزا للتصوير ، استكمل المستخلص بالكواشف المطلوبة ومجسات التصوير الفلوري. قم بإزالة البطانة الواقية العلوية من فاصل التصوير على الشريحة المعدة وقم بإيداع ما يقرب من سبعة ميكرولترات من المستخلص في وسط البئر. قم على الفور بتطبيق زلة الغطاء المطلي بشريط FEP بحيث يكون جانب FEP مواجها للمستخلص لإغلاق البئر والمضي قدما بسرعة في التصوير.
اضبط الشريحة على مجهر مقلوب أو مستقيم باستخدام منصة آلية وكاميرا رقمية. قم بتصوير المقتطفات في المواضع المكانية المطلوبة في فترات زمنية في كل من قنوات المجال الساطع والتألق. توضح هنا تجربة الفاصل الزمني باستخدام مستخلصات بيض xenopus laevis لدراسة التنظيم الذاتي للسيتوبلازم أثناء الطور البيني.
بعد حوالي 20 دقيقة من الحضانة في مناطق درجة حرارة الغرفة المستنفدة من مكونات السيتوبلازم المبعثرة للضوء كانت مرئية في كل من قنوات المجال الساطع والميتوكوندريا. بحلول حوالي 60 دقيقة في درجة حرارة الغرفة ، يجب أن يكون النمط المكاني الذي يتكون من مقصورات تشبه الخلية راسخا بشكل جيد مع الأنابيب الدقيقة التي تشكل بنية مجوفة تشبه إكليل الزهور والميتوكوندريا مقسمة بوضوح إلى كل حجرة. يتم هنا عرض مقارنة لأداء الاستخراج في غرف التصوير مع وبدون أشرطة FEP على الزجاج.
في الغرفة المصنوعة من الزجاج المسجل FEP ، يتم تنظيم المستخلص ذاتيا في أنماط طبيعية تشبه الخلايا. في الغرفة حيث لم تكن الأسطح الزجاجية مغطاة بشريط FEP ، أظهر المستخلص أنماطا غير طبيعية للمجال الساطع والأنابيب الدقيقة التي تعطلت بشكل متزايد بمرور الوقت. لم تلاحظ فروق ذات دلالة إحصائية في الاستيراد النووي لبروتين GST-mCherry-NLS.
الأشياء المهمة التي يجب تذكرها هي تخميل الأسطح الزجاجية بشريط FEP وإزالة جميع البيض الفاسد أثناء تحضير المستخلص. مع هذا النظام ، يمكننا بسهولة التحكم في سمك عينة المستخلص ، مما يمهد الطريق لتصوير الأنماط السيتوبلازمية في 3D ، باستخدام المجهر ورقة الضوء.
