فإن الكتاب أن نعترف بمساعدة السيدة سو كونيل لخبرتها في تضمين الراتنج ومقابر السيدة Stephania للخبرة مختبرها. فإن الكتاب أود أن أشكر الأستاذ الدكتور فرانك وKandziora Polboth ماري آن لنصائحهم.

<ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يوضع النسيج في حاوية مغلقة تحتوي على الفوسفات بنسبة 10 ٪ مخزنة حل الفورمالين 3. ضمان الحد الأدنى من التعرض للضوء ، وإذا كان التحليل هو ملون تألقي التي يتعين القيام بها ، كما fluorochromes خفيفة حساسة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد أي اتجاه من النسيج ستكون مطلوبة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تقليم لحجم العينة ، في الاتجاه الصحيح ، وذلك باستخدام الموجات رأى. وانضمت لضمان اجراءات السلامة. ثم يتم وضع العينة في وعاء غير شفاف ، يجب أن يكون حجم منها ما يقرب من عشرة أضعاف حجم العينة الكافي لتحقيق التثبيت. وينبغي أن العينة البقاء في حل ما مجموعه الفورمالين بين واحد وأسبوعين اعتمادا على حجمها. يقترح استخدام أنسجة السيطرة لأغراض الاختبار والتحسين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فحص الأنسجة يصب في قالب دمج ومكان النسيج في وعاء غير شفاف مختومة تحتوي على الايثانول 70 ٪. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عملية النسيج في الصعود تركيزات الإيثانول ، التدريع من الضوء وتحت تحريض مستمر. <ol class="lalpha" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 70 ٪ من الإيثانول 1 أسبوع </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 80 ٪ من الإيثانول 1 أسبوع </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 90 ٪ من الإيثانول 1 أسبوع </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 100 ٪ الايثانول 1 أسبوع </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ثم يتم مسح النسيج في لبيوتانول 1 أسبوع ، التدريع مرة أخرى من الضوء وتحت تحريض مستمر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يجب أن تكون كثافة العظم الراتنج والمتطابقة عن كثب ، ويمكن تغيير كثافة الراتنج (راجع الخطوة 8) ونحن نوصي تضمين عينة الاختبار الأول لضمان كثافة الصحيح. نستخدم Technovit 7100 (هيراوس Kulzer) للفحص المجهري والتحليل ضوء ملون تألقي. يجب إذا كان مطلوبا المناعية يمكن استخدام الراتنج بديلة مثل Technovit 9100 (هيراوس Kulzer). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قد تكون مختلطة الحل Technovit 7100 مع إعداد aliquots صغير من الحل تليين المتوفرة مع هذه المجموعة ، إذا كان ذلك مطلوبا ، ولكن بما لا يزيد عن 5 ٪ من حجم الحل الإعداد ؛ في تجربتنا هو مطلوب نادرا ما الحل تلين. تختلط أجزاء متساوية من الإيثانول المطلق وقاعدة Technovit السائل 7100 وتطبيقه على أنسجة كحل قبل التسلل لمدة 24 ساعة والحد من التعرض للضوء مع الانفعالات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ومن ثم أدلى به حتى حل تسلل 1 تصليب ز الأول (= 1 كيس) وهو يذوب في 100 مل السائل القاعدة. يستبدل هذا الحل قبل التسلل ، ويسمح للتسلل ل1 أسبوع تحت التحريض المستمر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مكان النسيج في القالب ، مع خفض سطح الوجه. ضمان وجود هامش (من الناحية المثالية لا يقل عن 5 ملليمترات) حول الأنسجة لالراتنج ، وهذا يضمن قوة الكتلة. مزيج من محلول 15mls Technovit إعداد 7100 مع 1 مل من الثانية تصليب وتصب حول العينة في القالب ، وتغطي ما لا يقل عن 5 millimietres. وسوف تبدأ المعالجة في غضون 2 ساعة ، ولكن سوف يكون كاملا بين عشية وضحاها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ثم يتم تنفيذ متصاعدة من جانب تشكيل كتلة دعم استخدام Technovit 3040 (هيراوس Kulzer). مزيج Technovit 3040 في نسبة حجم 2 أجزاء مسحوق السائل إلى الجزء 1 للحصول على السائل اللزج. صب Technovit 3040 في عطلة في الجزء الخلفي من كتلة الى مستوى لا يقل عن 2 مم فوق قاعدة الكتلة. ويمكن بعد حوالي 10 دقائق يكون مقشر العفن بعيدا وكتلة جاهزة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كثافة وبالتالي خصائص القطع من راتنج ميتاكريليت عرضة للرطوبة الجو المحيط في الغرفة. ولذلك ينبغي أن تكون القطع المخزنة في dessicator. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> sectioning الأرض تنتج أكبر أقسام بين 20-50 ميكرومتر في السمك. ومن المفيد للتحليل ملون تألقي (أنظر أدناه) ، وتنتج أكثر إشراقا أقسام سمكا مضان. تأمين شفرة الماس لmacrotome. إضافة مواد التشحيم ، مثل روح النفط الى الخزان على macrotome. تأمين كتلة في المشبك وتوجيه إلى النصل. السماح لطحن تحدث ببطء (حوالي 20-30 دقيقة لكل قسم) ضمان تزييت كاف. القسم الأول يعرض وجه القطع ويرشد المقطع يجب أن يكون التخلص منها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ثم يتم وضع المقطع التالي على شريحة Superfrost بلس. المقطع لديه ميل لحليقة لذا ننصح بوضع جزء من كيس ساندويتش وعقد أكثر من ذلك ثم انها مسطحة مع شريحة أخرى علقت في المكان. ثم يوضع في حاضنة بين 60-80 درجة مئوية لمدة 1 ساعة. هذا يخفف من ميتاكريليت ويساعد القسم التمسك الشريحة بطريقة مسطحة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قد يكون تنظيف الأرض المقطع والمصقول على النحو المطلوب باستخدام الصنفرة غرامة الحصباء بأسلوب لطيف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ومشراح تمزلج خفض الشرائح الرقيقة ، والذي يوفر أفضل المقاطع لmicrosocopy الخفيفة. استخدام مشراح تمزلج كما زاد صلابة ، وهو الأمر المطلوب لقطع هذه الكتل الصلبة. بدلا من ذلك يمكن استخدام مشراح بالطاقة الدوارة. استخدام شفرة حادة من الصلب المقاوم للصدأ. فمن الأفضل أن يكون اثنين من ريش متوفرة كما يمكن شحذ واحد كما في غيرها من يستخدم. ينبغي أن تجعل شفرة زاوية 45 درجة مع الكتلة. سولا يمكن أن يتحقق من خلال تطبيق rface تليين ورقة مبللة إلى كتلة إذا لزم الأمر. قد يستغرق عدة أقسام لتحقيق الشروط المطلوبة للحصول على قطع قسم الجودة. ومن ثم طرح الجزء المتعلق حمام ماء وتوضع على شريحة كما في 16 أعلاه. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وترد في المواد الكاشفة تلطيخ أدناه. وتستند البروتوكولات المتعلقة بانكروفت 4 آخرون. نظرا لاختلاف سماكة فمن المستحسن لتحسين البقع على شرائح الاختبار. قد تسبب تلطيخ رف الأنسجة لتطفو قبالة الشريحة حتى البقع مباشرة إضافة إلى شريحة المسطحة قد تكون مطلوبة. بروتوكول مطابقة أو تلطيخ الرف هو ضروري من أجل تحقيق نتائج متسقة اللازمة لتلطيخ histomorphometry. <ol class="lalpha" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وHaematoxylin يوزين <ol class="lroman" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وصمة عار مع 5-10 دقائق Haematoxyilin </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يغسل جيدا بماء الصنبور سكوت ق </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وصمة عار مع 5 دقائق يوزين </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تغسل في ماء الصنبور </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> واضح في الزيلين </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جبل </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> النتائج <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عظماني = الوردي </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> متكلسة العظم = البني الأرجواني </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> النوى = زرقاء </li></ol></li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فون كوسا <ol class="lroman" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مكان في محلول نترات الفضة وفضح لضوء قوي حتى العظم المعدنية سوداء (حوالي 10 دقيقة) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تغسل في ماء مقطر ثلاث مرات </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التهديد مع ثيوسلفات الصوديوم لمدة 5 دقائق </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تغسل في ماء مقطر </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ملون مباين مع O Safrinin </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> واضح في الزيلين </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جبل </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> النتائج <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عظم Mineralised = أسود </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عظماني = أحمر / وردي </li></ol></li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ماسون Goldner ق ثلاثي الألوان <ol class="lroman" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يغسل مع الكحول القلوية (90mls من الايثانول 80 ٪ من الأمونيا و10mls 25 ٪ لمدة 20 دقيقة) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شطف في الماء </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شطف في الماء المقطر </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وصمة عار مع Haematoxylin Weigert ليالي لمدة 10 دقائق </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شطف في الماء المقطر </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وصمة عار مع الحل النهائي الشقائقية فوكسين - 5 دقائق </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التشطيف مع حمض الخليك 1 ٪ 15 ثانية </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وصمة عار في الفسفومولبديك 5 دقائق حمض البرتقال حل G </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التشطيف مع حمض الخليك 1 ٪ 15 ثانية </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وصمة عار مع الضوء الأخضر 5 دقائق </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التشطيف مع حمض الخليك 1 ٪ 3 التغييرات </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شطف في الماء المقطر </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جبل </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> النتائج <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عظم Mineralised = أخضر </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عظماني = أحمر / برتقالي </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> النوى = الأزرق والرمادي </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الغضروف = الأرجواني </li></ol></li></ol></li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ملون تألقي التحضير : </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تدار من قبل هذه الحقن في الوريد ببطء ، على الأقل اسبوعين إربا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جرعات <ol class="lalpha" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Calcein الخضراء 10 ملغ / كغ الرابع </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أكسي تتراسكلين 50 ملغم / كغم الرابع </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الأليزارين Complexone 30 ملغ / كغ الرابع </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد الأخضر Calcein <ol class="lalpha" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ومعاير غرام واحد من الأخضر Calcein مع هيدروكسيد الصوديوم حتى 1 M المنحل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ويتم تعديل درجة الحموضة مع هيدروكسيد الصوديوم حتى 1 ٪ = 7،1-7،2 درجة الحموضة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التصفية والحفاظ على محمية من الضوء </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد Complexone الأليزارين <ol class="lalpha" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ومعاير ثلاثة غرامات من هيدروكسيد الصوديوم مع complexone الآليزارين M 1 حتى المنحل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ثم يتم تعديل درجة الحموضة مع حمض الهيدروكلوريك هيدروكسيد الصوديوم 1 ٪ أو حتى درجة الحموضة = 7،1-7،2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التصفية والحفاظ على محمية من الضوء </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد أكسي تتراسكلين <ol class="lalpha" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أكسي تتراسكلين يتوفر كما عقار مضاد للميكروبات من على الرف. لا يلزم الإعداد. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Kerr, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Atlas of Functional Histology. , 164-168 (2000).</li><li>Parfitt, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+histomorphometry:+standardization+of+nomenclature,+symbols,+and+units.+Report+of+the+ASBMR+Histomorphometry+Nomenclature+Committee.">Bone histomorphometry: standardization of nomenclature, symbols, and units. Report of the ASBMR Histomorphometry Nomenclature Committee.</a> J Bone Miner Res. 2, 595-610 (1987).</li><li>An, Y. H., Martin, K. l. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Handbook of histology methods for bone and cartilage. , (2003).</li><li>Bancroft, J. D., Gamble, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Theory and Practice of Histological Techniques. , 352-360 (2008).</li></ol>

المذيبات : <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التخزين المؤقت عادي 10 ٪ حمض الفورمالين ، والإيثانول ، والزيلين بيوتانول جميع الرتب الأنسجة ، حرر الكبريت. Grale العلمية بي تي واي المحدودة http://www.grale.com.au </li></ul> قوالب : <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قشر بعيدا ، والقوالب البلاستيكية Grale العلمية </li></ul> الشرائح : <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مجهر شرائح SUPERFROST PLUS ومب العلمية بي تي واي المحدودة <a href="http://www.lomb.com.au/">http://www.lomb.com.au</a> </li></ul> الراتنج : <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Technovit GlycolMethacrylate 7100 هيراوس Kulzer <a href="http://www.kulzer-technik.de/168/Products/Histology/Technovit_7100.htm">http://www.kulzer-technik.de/168/Products/Histology/Technovit_7100.htm</a> </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> دعم كتلة صمغية - Technovit كتلة Histo 3040 هيراوس Kulzer </li></ul> بقع (الكواشف من العلم Grale) ثلاثي الألوان Goldner وصمة عار </li> 1. Weigert من حديد hemotoxylin (DeGroat) <table style="margin-left:40px;;text-align:right;direction:rtl" border="0"><tr><td colspan="2" style="font-weight:bold;"> أ) حل Hemotoxylin </td></tr><tr><td> Hemotoxylin </td><td> 1G </td></tr><tr><td> الكحول المطلق </td><td> 100ML </td></tr><tr><td colspan="2" style="font-weight:bold;"> ب) الحديد الحل </td></tr><tr><td> 30 ٪ كلوريد الحديديك المائي </td><td> 4mL </td></tr><tr><td> حمض الهيدروكلوريك (تركيز) </td><td> 1mL </td></tr><tr><td> الماء المقطر </td><td> 95mL </td></tr></table> تمت تصفيتها ، وأضاف إلى حجم مساو من hemotoxylin تستخدم من قبل على الفور وصمة عار. 2. الشقائقية - فوكسين - azophloxin الأسهم حلول <table style="margin-left:40px;;text-align:right;direction:rtl" border="0"><tr><td colspan="2" style="font-weight:bold;"> أ) حل الشقائقية دي زايليدين </td></tr><tr><td> الشقائقية دي زايليدين </td><td> 0.75g </td></tr><tr><td> حمض fuchsion </td><td> 0.25g </td></tr><tr><td> حمض الخليك </td><td> 1mL </td></tr><tr><td colspan="2"> المزيج ، وإضافة الماء المقطر (100ML) </td></tr><tr><td colspan="2" style="font-weight:bold;"> ب) حل azophloxin </td></tr><tr><td> Azophloxin </td><td> 0.5g </td></tr><tr><td> حامض الخليك </td><td> 0.6mL </td></tr><tr><td colspan="2"> المزيج ، وإضافة الماء المقطر (100ML) </td></tr><tr><td colspan="2" style="font-weight:bold;"> ج) العمل النهائية حل صمة عار </td></tr><tr><td> الشقائقية - فوكسين الحل </td><td> 5 - 10ML </td></tr><tr><td> Azophloxin </td><td> 2mL </td></tr><tr><td> 0.2 ٪ محلول حمض الخليك </td><td> 88mL </td></tr></table> 3. ضوء أخضر الحل <table style="margin-left:40px;;text-align:right;direction:rtl" border="0"><tr><td> الضوء الأخضر </td><td> 1G </td></tr><tr><td> حامض الخليك </td><td> 1mL </td></tr><tr><td colspan="2"> المزيج ، وإضافة الماء المقطر (500mL) </td></tr></table> 4. Phophomolybdic حل G حمض البرتقال <table style="margin-left:40px;;text-align:right;direction:rtl" border="0"><tr><td> حمض الفسفومولبديك </td><td> 3G </td></tr><tr><td> البرتقالي G </td><td> 2G </td></tr><tr><td colspan="2"> تذوب في الماء المقطر 500ml من الثيمول وإضافة الكريستال. </td></tr></table> فون كوسا اللطخة <table style="margin-left:40px;;text-align:right;direction:rtl" border="0"><tr><td> مائي 1 ٪ نترات الفضة </td></tr><tr><td> ثيوسلفات الصوديوم 2.5 ٪ </td></tr><tr><td> 1 ٪ safranin O </td></tr></table> زرقة الألسيان صمة عار <table style="margin-left:40px;;text-align:right;direction:rtl" border="0"><tr><td> زرقة الألسيان 8GX </td><td> 1G </td></tr><tr><td> 3 ٪ من محلول حمض الخليك </td><td> 100ML </td></tr></table> وصمة عار Hemotoxylin يوزين <table style="margin-left:40px;;text-align:right;direction:rtl" border="0"><tr><td colspan="2" style="font-weight:bold;"> أ) هاريس hemotoxylin </td></tr><tr><td> Hemotoxylin </td><td> 2.5G </td></tr><tr><td> كحول مطلق </td><td> 25mL </td></tr><tr><td> البوتاسيوم الشب </td><td> 50G </td></tr><tr><td> الماء المقطر </td><td> 500mL </td></tr><tr><td> أكسيد الزئبق </td><td> 1.25g OR </td></tr><tr><td> يودات الصوديوم </td><td> 0.5g </td></tr><tr><td> الجليدية حمض الخليك </td><td> 20mL </td></tr><tr><td colspan="2" style="font-weight:bold;"> ب) حل يوزين </td></tr><tr><td colspan="2"> وقد استخدم يوزين المنتجة تجاريا. </td></tr></table> كل مساحيق صبغ هي وصمة عار Gurr مساحيق صباغة. كل الكواشف والكواشف التحليلية ، وليس الكواشف المخبرية Fluorochromes <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0" style=";text-align:right;direction:rtl"><tr><td> الصانع </td><td> ملون تألقي </td><td> رقم كتالوج </td></tr><tr><td> سيغما الدريخ ، سيدني </td><td> Calcein الخضراء </td><td> C0875 </td></tr><tr><td> سيغما الدريخ ، سيدني </td><td> الأليزارين Complexone </td><td> A3882 </td></tr><tr><td> إنترفيت استراليا وفيكتوريا </td><td> أكسي تتراسكلين (قبالة الجرف المخدرات المضادة للميكروبات) </td><td> الاسم التجاري ؛ Engemycin 100 </td></tr></table>

undecalcified bone preparation for histology, histomorphometry and fluorochrome analysis

Undecalcified الأنسجة العظمية يوضح الهيكل الصغير للعظم. ويعرض كل من المكونات المعدنية للعظم والخلوية ، التي توفر معلومات حيوية عن دوران العظم أو تكوين العظام وارتشاف. هذا له أهمية كبيرة في مجموعة متنوعة من التطبيقات السريرية والبحوث. أنها تعود الصور الجميلة (1) ويسمح لتقنيات مثل تقييم ملون تألقي وhistomorphometry 2. ملون تألقي التحليل هو تقنية حيث يتم حقن الأصباغ الفلورية التي تربط إلى الكالسيوم في نقطة زمنية معينة ، والذي يسمح لتقدير حجم كمية تمعدن في ذلك الوقت بعينه. Histomorphometry هو عملية تقدير العظام على المستوى المجهري. أداء undecalcified الأنسجة العظمية يمثل تحديا تقنيا ، لا سيما مع عينات كبيرة الحجم. فهي تتطلب تغييرات في أسلوب من تلك المستخدمة في البارافين القياسية جزءا لا يتجزأ من الأنسجة. هذا الفيديو يوضح عملية إنتاج المقاطع ذات نوعية جيدة ويدل على الصعوبات التقنية والأساليب التي للتغلب عليها. وتتحقق إعداد العينات ، وتجهيز مع تثبيت بطريقة مماثلة لغيرها من الأنسجة اللينة ، ولكن نظرا لكثافة وأقل نفاذية للعظم كبير تعد مطلوبة تثبيت وتجهيز مرات ، مع الأخذ في كثير من الأحيان عدة أسابيع. ويتم تحقيق دمج باستخدام وسيلة دعم مماثل مع صلابة وكثافة أو يساوي حتى العظم مثل ميتاكريليت مقرها راتنجات ، ولكن خلافا تسلل البارافين والتضمين ، وهذا هو خطوة لا رجعة فيها. لا يمكن أن يتحقق عن طريق طحن Sectioning التي تنتج أكثر سمكا المقطع ، الذي هو الأمثل لمثل هذه الدراسات والتحليل ملون تألقي. هو أفضل طريقة لتحقيق ذلك باستخدام شفرة الماس على macrotome. بدلا من ذلك ، يمكن أن تنتج أرق أقسام للالمجهر الضوئي ويتحقق هذا باستخدام مشراح تمزلج بشفرة حادة جدا. ومشراح تمزلج يوفر قوة إضافية والاستقرار المطلوبة لكتل ​​كبيرة وصعبة. يمكن أن تكون جزءا لا يتجزأ من المقاطع ملون الراتنج مع مجموعة متنوعة من البقع ، والتي أظهرت.

Watch this Scientific Journal Video about Undecalcified Bone Preparation for Histology, Histomorphometry and Fluorochrome Analysis at JoVE.com

Undecalcified Bone Preparation for Histology, Histomorphometry and Fluorochrome Analysis

Undecalcified الأنسجة العظام يوفر معلومات هامة لمجموعة متنوعة من التطبيقات السريرية والبحوث. فإنه يمثل تحديا تقنيا ، لا سيما مع عينات كبيرة الحجم. هذا الفيديو يوضح عملية إنتاج المقاطع ذات نوعية جيدة ويدل على الصعوبات التقنية والأساليب التي للتغلب عليها.

Undecalcified العظام لإعداد الأنسجة ، وتحليل Histomorphometry ملون تألقي

Undecalcified bone histology demonstrates the micro-architecture of bone. It shows both the mineralised and cellular components of bone, which provides ...

undecalcified-bone-preparation-for-histology-histomorphometry

Research

JoVE Journal

Biology

27.1K Views.  Monash University. Undecalcified الأنسجة العظام يوفر معلومات هامة لمجموعة متنوعة من التطبيقات السريرية والبحوث. فإنه يمثل تحديا تقنيا ، لا سيما مع عينات كبيرة الحجم. هذا الفيديو يوضح عملية إنتاج المقاطع ذات نوعية جيدة ويدل على الصعوبات التقنية والأساليب التي للتغلب عليها.

Video: Undecalcified Bone Preparation for Histology, Histomorphometry and Fluorochrome Analysis

The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell  electroporation system and Gene Pulser  electroporation buffer were specifically developed to transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells.This video demonstrates how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow, and then prepare them for electroporation in the MXcell system. We begin by isolating femur and tibia. Bone marrow from both femur and tibia are then harvested and cultures are established. Cultured bone marrow cells are then transfected and analyzed.

This procedure describes how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow and is followed by transfection using the Gene Pulser MXCell electroporation system.

التحضير لزراعة الخلايا المكونة للدم الابتدائية من نخاع عظام الفئران لElectroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

A Neuronal and Astrocyte Co-Culture Assay for High Content Analysis of Neurotoxicity

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing measurement of multiple cellular phenotypes within a single assay. In this study, we utilized HCA to develop a novel assay for neurotoxicity. Neurotoxicity assessment represents an important part of drug safety evaluation, as well as being a significant focus of environmental protection efforts. Additionally, neurotoxicity is also a well-accepted in vitro marker of the development of neurodegenerative diseases such as Alzheimer's and Parkinson's diseases. Recently, the application of HCA to neuronal screening has been reported. By labeling neuronal cells with &beta;III-tubulin, HCA assays can provide high-throughput, non-subjective, quantitative measurements of parameters such as neuronal number, neurite count and neurite length, all of which can indicate neurotoxic effects. However, the role of astrocytes remains unexplored in these models. Astrocytes have an integral role in the maintenance of central nervous system (CNS) homeostasis, and are associated with both neuroprotection and neurodegradation when they are activated in response to toxic substances or disease states. GFAP is an intermediate filament protein expressed predominantly in the astrocytes of the CNS. Astrocytic activation (gliosis) leads to the upregulation of GFAP, commonly accompanied by astrocyte proliferation and hypertrophy. This process of reactive gliosis has been proposed as an early marker of damage to the nervous system. The traditional method for GFAP quantitation is by immunoassay. This approach is limited by an inability to provide information on cellular localization, morphology and cell number. We determined that HCA could be used to overcome these limitations and to simultaneously measure multiple features associated with gliosis - changes in GFAP expression, astrocyte hypertrophy, and astrocyte proliferation - within a single assay. In co-culture studies, astrocytes have been shown to protect neurons against several types of toxic insult and to critically influence neuronal survival. Recent studies have suggested that the use of astrocytes in an in vitro neurotoxicity test system may prove more relevant to human CNS structure and function than neuronal cells alone. Accordingly, we have developed an HCA assay for co-culture of neurons and astrocytes, comprised of protocols and validated, target-specific detection reagents for profiling &beta;III-tubulin and glial fibrillary acidic protein (GFAP). This assay enables simultaneous analysis of neurotoxicity, neurite outgrowth, gliosis, neuronal and astrocytic morphology and neuronal and astrocytic development in a wide variety of cellular models, representing a novel, non-subjective, high-throughput assay for neurotoxicity assessment. The assay holds great potential for enhanced detection of neurotoxicity and improved productivity in neuroscience research and drug discovery.

This article describes a novel protocol and reagent set designed for sensitive measurement of neurotoxic effects of compounds and treatments on co-cultures of neurons and astrocytes using high content analysis. Results demonstrate that high content analysis represents an exciting novel technology for neurotoxicity assessment.

والخلايا العصبية ونجمية المشارك الثقافة الفحص لتحليل محتوى عال من العصبية

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing ...

Preparation of Adult Drosophila Eyes for Thin Sectioning and Microscopic Analysis

Drosophila has long been used as model system to study development, mainly due to the ease with which it is genetically tractable. Over the years, a plethora of mutant strains and technical tricks have been developed to allow sophisticated questions to be asked and answered in a reasonable amount of time. Fundamental insight into the interplay of components of all known major signaling pathways has been obtained in forward and reverse genetic Drosophila studies. The fly eye has proven to be exceptionally well suited for mutational analysis, since, under laboratory conditions, flies can survive without functional eyes. Furthermore, the surface of the insect eye is composed of some 800 individual unit eyes (facets or ommatidia) that form a regular, smooth surface when looked at under a dissecting microscope. Thus, it is easy to see whether a mutation might affect eye development or growth by externally looking for the loss of the smooth surface ('rough eye' phenotype; Fig. 1) or overall eye size, respectively (for examples of screens based on external eye morphology see e.g.1). Subsequent detailed analyses of eye phenotypes require fixation, plastic embedding and thin-sectioning of adult eyes.
The Drosophila eye develops from the so-called eye imaginal disc, a bag of epithelial cells that proliferate and differentiate during larval and pupal stages (for review see e.g. 2). Each ommatidium consists of 20 cells, including eight photoreceptors (PR or R-cells; Fig. 2), four lens-secreting cone cells, pigment cells ('hexagon' around R-cell cluster) and a bristle. The photoreceptors of each ommatidium, most easily identified by their light sensitive organelles, the rhabdomeres, are organized in a trapezoid made up of the six "outer" (R1-6) and two "inner" photoreceptors (R7/8; R8 [Fig. 2] is underneath R7 and thus only seen in sections from deeper areas of the eye). The trapezoid of each facet is precisely aligned with those of its neighbors and the overall anteroposterior and dorsoventral axes of the eye (Fig. 3A). In particular, the ommatidia of the dorsal and ventral (black and red arrows, respectively) halves of the eye are mirror images of each other and correspond to two chiral forms established during planar cell polarity signaling (for review see e.g. 3).
The method to generate semi-thin eye sections (such as those presented in Fig. 3) described here is slightly modified from the one originally described by Tomlinson and Ready4. It allows the morphological analysis of all cells except for the transparent cone cells. In addition, the pigment of R-cells (blue arrowheads in Fig. 2 and 3) can be used as a cell-autonomous marker for the genotype of a R-cell, thus genetic requirements of genes in a subset of R-cells can readily be determined5,6.

Preparation of Adult Drosophila Eyes for Thin Sectioning and Microscopic Analysis

A standard approach to prepare adult Drosophila eyes for semi-thin sectioning and light microscopic analysis is presented here. The protocol can be used for gross morphological analysis of eye defects, or with the indicated adjustments can be used to determine genetic requirements of genes in specific cell types of the eye (e.g. clonal analysis of photoreceptors) or for electron microscopic analysis.

إعداد الكبار ذبابة الفاكهة لعيون Sectioning رقيقة والتحليل المجهري

Drosophila has long been used as model system to study development, mainly due to the ease with which it is genetically tractable. Over the years, a ...

RNA In situ Hybridization in Whole Mount Embryos and Cell Histology Adapted for Marine Elasmobranchs

Marine elasmobranchs are valued animal models for biomedical and genomic studies as they are the most primitive vertebrates to have adaptive immunity and have unique mechanisms for osmoregulation 1-3. As the most primitive living jawed-vertebrates with paired appendages, elasmobranchs are an evolutionarily important model, especially for studies in evolution and development. Marine elasmobranchs have also been used to study aquatic toxicology and stress physiology in relationship to climate change 4. Thus, development and adaptation of methodologies is needed to facilitate and expand the use of these primitive vertebrates to multiple biological disciplines. Here I present the successful adaptation of RNA whole mount in situ hybridization and histological techniques to study gene expression and cell histology in elasmobranchs.
Monitoring gene expression is a hallmark tool of developmental biologists, and is widely used to investigate developmental processes 5. RNA whole mount in situ hybridization allows for the visualization and localization of specific gene transcripts in tissues of the developing embryo. The expression pattern of a gene's message can provide insight into what developmental processes and cell fate decisions a gene may control. By comparing the expression pattern of a gene at different developmental stages, insight can be gained into how the role of a gene changes during development.
While whole mount in situ's provides a means to localize gene expression to tissue, histological techniques allow for the identification of differentiated cell types and tissues. Histological stains have varied functions. General stains are used to highlight cell morphology, for example hematoxylin and eosin for general staining of nuclei and cytoplasm, respectively. Other stains can highlight specific cell types. For example, the alcian blue stain reported in this paper is a widely used cationic stain to identify mucosaccharides. Staining of the digestive tract with alcian blue can identify the distribution of goblet cells that produce mucosaccharides. Variations in mucosaccharide constituents on short peptides distinguish goblet cells by function within the digestive tract 6. By using RNA whole mount in situ's and histochemical methods concurrently, cell fate decisions can be linked to gene-specific expression.
Although RNA in situ's and histochemistry are widely used by researchers, their adaptation and use in marine elasmobranchs have met limited and varied success. Here I present protocols developed for elasmobranchs and used on a regular basis in my laboratory. Although further modification of the RNA in situ's hybridization method may be needed to adapt to different species, the protocols described here provide a strong starting point for researchers wanting to adapt the use of marine elasmobranchs to their scientific inquiries.

RNA In situ Hybridization in Whole Mount Embryos and Cell Histology Adapted for Marine Elasmobranchs

By combining methods for RNA whole mount in situ hybridization and histology, gene expression can be linked with cell fate decisions in the developing embryo. These methods have been adapted to marine elasmobranchs and facilitate the use of these animals as model organisms for biomedical, toxicology and comparative studies.

RNA<em&gt; في الموقع</em&gt; التهجين في الأجنة جبل الجامعة وعلم الأنسجة الخلية مقتبس عن Elasmobranchs البحرية

Marine  elasmobranchs are valued animal models for biomedical and genomic studies as  they are the most primitive vertebrates to have adaptive immunity ...

Bone Conditioned Medium: Preparation and Bioassay

Autologous bone grafts are widely used in oral and maxillofacial surgery, orthopedics, and traumatology. Autologous bone grafts not only replace missing bone, they also support the complex process of bone regeneration. This favorable behavior of autografts is attributed to the three characteristics: osteoconductivity, osteogenicity, and osteoinductivity. However, there is another aspect: Bone grafts release a myriad of molecules, including growth factors, which can target mesenchymal cells involved in bone regeneration. The paracrine properties of bone grafts can be studied in vitro by the use of bone-conditioned medium (BCM). Here we present a protocol on how to prepare bone-conditioned medium from native pig cortical bone, and bone that underwent thermal processing or demineralization. Cells can be directly exposed to BCM or seeded onto biomaterials, such as collagen membranes, previously soaked with BCM. We give examples for in vitro bioassays with mesenchymal cells on the expression of TGF-&#946; regulated genes. The presented protocols should encourage to further reveal the paracrine effects of bone grafts during bone regeneration and open a path for translational research in the broad field of reconstructive surgery.

We describe here how to prepare bone-conditioned medium (BCM) and test its activity in vitro.

العظام مكيفة المتوسطة: إعداد والأحيائي

Autologous bone grafts are widely used in oral and maxillofacial surgery, orthopedics, and traumatology. Autologous bone grafts not only replace missing ...

Sample Preparation for Mass Cytometry Analysis

Mass cytometry utilizes antibodies conjugated with heavy metal labels, an approach that has greatly increased the number of parameters and opportunities for deep analysis well beyond what is possible with conventional fluorescence-based flow cytometry. As with any new technology, there are critical steps that help ensure the reliable generation of high-quality data. Presented here is an optimized protocol that incorporates multiple techniques for the processing of cell samples for mass cytometry analysis. The methods described here will help the user avoid common pitfalls and achieve consistent results by minimizing variability, which can lead to inaccurate data. To inform experimental design, the rationale behind optional or alternative steps in the protocol and their efficacy in uncovering new findings in the biology of the system being investigated is covered. Lastly, representative data is presented to illustrate expected results from the techniques presented here.

This article describes the collection and processing of samples for mass cytometry analysis.

إعداد نموذج لتحليل قداس الخلوي

Mass cytometry utilizes antibodies conjugated with heavy metal labels, an approach that has greatly increased the number of parameters and opportunities ...

An Alternative Approach for Sample Preparation with Low Cell Number for TEM Analysis

Transmission electron microscopy (TEM) provides details of the cellular organization and ultrastructure. However, TEM analysis of rare cell populations, especially cells in suspension such as hematopoietic stem cells (HSCs), remains limited due to the requirement of a high cell number during sample preparation. There are a few cytospin or monolayer approaches for TEM analysis from scarce samples, but these approaches fail to get significant quantitative data from the limited number of cells. Here, an alternative and novel approach for sample preparation in TEM studies is described for rare cell populations that enables quantitative analysis.
A relatively low cell number, i.e., 10,000 HSCs, was successfully used for TEM analysis compared to the millions of cells typically used for TEM studies. In particular, Evans blue staining was performed after paraformaldehyde-glutaraldehyde (PFA-GA) fixation to visualize the tiny cell pellet, which facilitated embedding in agarose. Clusters of numerous cells were observed in ultra-thin sections. The cells had a well preserved morphology, and the ultra-structural details of the Golgi complex and several mitochondria were visible. This efficient, easy and reproducible protocol allows sample preparation from a low cell number and can be used for qualitative and quantitative TEM analysis on rare cell populations from limited biological samples.

Here, we present a protocol to prepare samples with low cell numbers for transmission electron microscopy (TEM) analysis.

طريقة بديلة لإعداد نموذج مع انخفاض عدد الخلايا لتحليل تيم

Transmission electron microscopy (TEM) provides details of the cellular organization and ultrastructure. However, TEM analysis of rare cell populations, ...

Sample Preparation for Mass-spectrometry-based Proteomics Analysis of Ocular Microvessels

The use of isolated ocular blood vessels in vitro to decipher the pathophysiological state of the eye using advanced technological approaches has greatly expanded our understanding of certain diseases. Mass spectrometry (MS)-based proteomics has emerged as a powerful tool to unravel alterations in the molecular mechanisms and protein signaling pathways in the vascular beds in health and disease. However, sample preparation steps prior to MS analyses are crucial to obtain reproducible results and in-depth elucidation of the complex proteome. This is particularly important for preparation of ocular microvessels, where the amount of sample available for analyses is often limited and thus, poses a challenge for optimum protein extraction. This article endeavors to provide an efficient, rapid and robust protocol for sample preparation from an exemplary retrobulbar ocular vascular bed employing the porcine short posterior ciliary arteries. The present method focuses on protein extraction procedures from both the supernatant and pellet of the sample following homogenization, sample cleaning with centrifugal filter devices prior to one-dimensional gel electrophoresis and peptide purification steps for label-free quantification in a liquid chromatography-electrospray ionization-linear ion trap-Orbitrap MS system. Although this method has been developed specifically for proteomics analyses of ocular microvessels, we have also provided convincing evidence that it can also be readily employed for other tissue-based samples.

Proteome characterization of ocular microvascular beds is pivotal for in-depth understanding of many ocular pathologies in humans. This study demonstrates an effective, rapid, and robust method for protein extraction and sample preparation from small blood vessels employing the porcine short posterior ciliary arteries as model vessels for mass-spectrometry-based proteomics analyses.

إعداد نموذج للإعلام-قياس الطيف الكتلي المستندة البروتيوميات تحليل ميكروفيسيلس العين

The use of isolated ocular blood vessels in vitro to decipher the pathophysiological state of the eye using advanced technological approaches has greatly ...

A Sectioning, Coring, and Image Processing Guide for High-Throughput Cortical Bone Sample Procurement and Analysis for Synchrotron Micro-CT

Bone is a dynamic and mechanically active tissue that changes in structure over the human lifespan. The products of the bone remodeling process have been studied substantially using traditional two-dimensional techniques. Recent advancements in X-ray imaging technology via desktop micro-computed tomography (&#181;CT) and synchrotron radiation micro-computed tomography (SR&#181;CT) have allowed for the acquisition of high-resolution three-dimensional (3D) scans of a larger field of view (FOV) than other 3D imaging techniques (e.g., SEM) providing a more complete picture of microscopic structures within human cortical bone. The specimen should be accurately centered within the FOV, however, to limit the appearance of streak artifacts known to impact data analysis. Previous studies have reported procurement of irregularly shaped rectilinear bone blocks that result in imaging artifacts due to uneven edges or image truncation. We have applied a geological sampling protocol (coring) to procure consistently sized cortical bone core specimens for SR&#181;CT experiments from the anterior aspect of human femora. This coring method is efficient and minimally destructive to tissue. It creates uniform cylindrical samples that decrease imaging artifacts by nature of being isometric during rotation and providing a uniform path length for X-ray beams throughout scanning. Image processing of X-ray tomographic data of cored and irregularly shaped samples confirms the potential of the technique to improve visualization and analysis of cortical bone microarchitecture. A goal of this protocol is to deliver a reliable and repeatable method for the extraction of cortical bone cores that is adaptable for various types of high-resolution bone imaging experiments. An overarching goal of the work is to create a standardized cortical bone procurement for SR&#181;CT that is affordable, consistent, and straightforward. This procedure may further be adapted by researchers in related fields who commonly evaluate hard composite materials such as in biological anthropology, geosciences, or material sciences.

We employed a geological (coring) sampling protocol to procure cortical bone specimens of uniform size for SR&#181;CT experiments from the anterior aspect of human femora. This method is minimally destructive, efficient, results in cylindrical specimens that minimize imaging artifacts from irregular sample shapes and improves microarchitectural visualization and analysis.

قسم، Coring، ودليل معالجة الصور لارتفاع الإنتاجية اختبار العظام كورتيكية الشراء وتحليل لSynchrotron الدقيقة CT

Bone is a dynamic and mechanically active tissue that changes in structure over the human lifespan. The products of the bone remodeling process have been ...

Tissue Collection and RNA Extraction from the Human Osteoarthritic Knee Joint

Osteoarthritis (OA) is a chronic and degenerative joint disease most often affecting the knee. As there is currently no cure, total knee arthroplasty (TKA) is a common surgical intervention. Experiments using primary human OA tissues obtained from TKA provide the capability to investigate disease mechanisms ex vivo. While OA was previously thought to impact mainly the cartilage, it is now known to impact multiple tissues in the joint. This protocol describes patient selection, sample processing, tissue homogenization, RNA extraction, and quality control (based on RNA purity, integrity, and yield) from each of seven unique tissues to support disease mechanism investigation in the knee joint. With informed consent, samples were obtained from patients undergoing TKA for OA. Tissues were dissected, washed, and stored within 4 h of surgery by flash freezing for RNA or formalin fixation for histology. Collected tissues included articular cartilage, subchondral bone, meniscus, infrapatellar fat pad, anterior cruciate ligament, synovium, and vastus medialis oblique muscle. RNA extraction protocols were tested for each tissue type. The most significant modification involved the method of disintegration used for low-cell, high-matrix, hard tissues (considered as cartilage, bone, and meniscus) versus relatively high-cell, low-matrix, soft tissues (considered as fat pad, ligament, synovium, and muscle). It was found that pulverization was appropriate for hard tissues, and homogenization was appropriate for soft tissues. A proclivity for some subjects to yield higher RNA integrity number (RIN) values than other subjects consistently across multiple tissues was observed, suggesting that underlying factors such as disease severity may impact RNA quality. The ability to isolate high-quality RNA from primary human OA tissues provides a physiologically relevant model for sophisticated gene expression experiments, including sequencing, that can lead to clinical insights that are more readily translated to patients.

Primary tissues obtained from patients following total knee arthroplasty provide an experimental model for osteoarthritis research with maximal clinical translatability. This protocol describes how to identify, process, and isolate RNA from seven unique knee tissues to support mechanistic investigation in human osteoarthritis.

جمع الأنسجة واستخراج الحمض النووي الريبي من مفصل الركبة هشاشة العظام البشرية

Osteoarthritis (OA) is a chronic and degenerative joint disease most often affecting the knee. As there is currently no cure, total knee arthroplasty ...