作者要感谢她的专长苏康奈尔女士的协助下，在树脂嵌入和她的实验室技术女士千金墓群。作者要感谢他们的意见弗兰克Kandziora教授和博士玛丽 - 安妮Polboth。

<ol><li>该组织是放置在一个密封的容器中含有10％磷酸的福尔马林溶液3。确保尽量减少暴露在光线下，如果要执行，作为荧光光敏感荧光分析。 </li><li>建立将需要组织的方向。 </li><li>修剪大小的标本，在正确的方向，用一个带锯。确保安全措施得到遵守。试样，然后将放在不透明的容器，其中的量应该是10倍左右大小的标本，以达到充分固定。试样应保持在福尔马林溶液中的一到两个星期取决于其大小总。建议使用控制组织，用于测试和优化的目的。 </li><li>检查组织成适合嵌入模具和组织放入一个密封的不透明的容器中含有70％的乙醇。 </li><li>升序乙醇浓度的组织过程，从光线和不断搅拌下屏蔽。 <ol class="lalpha"><li> 70％的乙醇，1个星期</li><li> 80％的乙醇，1个星期</li><li> 90％的乙醇，1个星期</li><li> 100％的乙醇，1个星期</li></ol></li><li>组织正丁醇1周，然后清除，再从光，并不断搅拌下屏蔽。 </li><li> 树脂和骨骼的密度应密切配合 ，可以改变树脂的密度（见第8步），我们建议首先要保证正确的密度嵌入试样。我们用光学显微镜和荧光分析Technovit 7100（贺利氏古莎）。如果需要免疫组化是另一种树脂，必须使用如Technovit 9100（贺利氏古莎）。 </li><li> Technovit 7100溶液的制备可混合分装软化解决方案提供的套件，如果需要的话，但不超过5％的配制溶液的体积，软化解决方案在我们的经验是很少需要。无水乙醇和基液体Technovit 7100等份混合和应用的组织，作为减少光线照射24小时前渗透解决方案，并搅拌。 </li><li>渗透溶液，然后用1克固化剂，我（= 1袋），这是溶解在100毫升的基液。这取代了前渗透的解决方案是允许的渗透不断搅拌1周。 </li><li>组织，切割面正面朝下放入模具。确保有一个保证金周围组织的树脂（理想情况下至少5毫米），这确保了块强度。混合溶液的制备Technovit 7100 15mls与1毫升固化剂二，倒在模具周围的标本和至少5 millimietres覆盖。固化将在2小时内开始，但在一夜之间将完成。 </li><li>然后执行安装使用Technovit 3040（贺利氏古莎）塑造一个备份块。在两部分粉1部分液体，以获得一种粘性液体的体积比混合Technovit 3040。 Technovit 3040倒入水平至少2毫米以上的块基地块背面的凹槽。约10分钟后，模具可剥离和块准备。 </li><li>的密度，因此甲基丙烯酸树脂切割性能很容易受到室内的环境湿度。因此，应块存储在一个dessicator。 </li><li>地面切片厚度为20-50微米之间产生较大的部分。它是有用的荧光分析（见下节）较厚部分产生明亮的荧光。安全金刚石锯片macrotome。添加润滑剂，如汽油，水库上macrotome。安全钳块，定位到刀片。允许研磨发生缓慢（约20-30分钟，每节），以确保足够的润滑。第一部分公开的切割面和orientates部分，它应该被丢弃。 </li><li> Superfrost加幻灯片，然后放置在下一节。本节有一种倾向，因此，我们建议配售的超额部分三明治袋，然后拿着另一张幻灯片的地方夹住它平卷曲。 1小时摄氏60-80度之间，然后放入一个孵化器。这种柔软的丙烯酸甲酯，并帮助部分坚持在一个单位的方式幻灯片。 </li><li>可清洗地面部分和根据需要在一个温柔的方式使用细砂纸打磨。 </li><li>爬犁切片切薄片，它提供了最好的部分光microsocopy。使用雪橇切片机，还增加了刚性，这是需要切割这些硬模块。另外一个动力旋转切片机都可以使用。用锋利的不锈钢刀片。最好是有两个叶片可作为一个可用于其他削尖。刀片应该做一个45度角块。苏如果需要，应用湿纸块，可以实现rface软化。这可能需要几个部分，达到理想的切削条件下，获得优质的部分。本节，然后飘然水浴上，并在16个以上的幻灯片上。 </li><li>染色试剂列在下面的材料。协议是基于班克罗夫特4等。由于厚度的变化，建议以优化测试幻灯片的污渍。机架染色可能会导致组织浮动，所以，可能需要添加的污渍直接向扁平幻灯片的幻灯片。相同的协议或机架染色染色组织形态计量学要求的结果一致是必要的。 <ol class="lalpha"><li>苏木和曙红<ol class="lroman"><li>染色Haematoxyilin 5-10分钟</li><li>斯科特小号自来水冲洗</li><li>染色与曙红5分钟</li><li>自来水洗</li><li>在二甲苯清除</li><li>挂载</li><li> 结果 <ol><li>骨样=粉红色</li><li>钙化骨=紫褐色</li><li>核=蓝色</li></ol></li></ol></li><li>冯科萨<ol class="lroman"><li>放入硝酸银溶液和矿化骨，直到变成黑色，暴露在强烈的光线（约10分钟） </li><li>在蒸馏水洗三次</li><li> 5分钟与硫代硫酸钠的威胁</li><li>蒸馏水洗净</li><li>染液与Safrinin Ø </li><li>在二甲苯清除</li><li>挂载</li><li> 结果 <ol><li> Mineralised骨=黑色</li><li>骨样=红/粉红色</li></ol></li></ol></li><li>马森Goldner小号三色<ol class="lroman"><li>碱性酒精清洗（90mls 80％的乙醇和25％的氨水20分钟10mls） </li><li>用水冲洗</li><li>蒸馏水冲洗</li><li>与Weigert小号苏木染色10分钟</li><li>蒸馏水冲洗</li><li>染色与丽春红，品红最终解决5分钟</li><li>用1％醋酸冲洗15秒</li><li>磷钼酸橙色G解决方案5分钟染色</li><li>用1％醋酸冲洗15秒</li><li>染色浅绿色5分钟</li><li>用1％醋酸冲洗3变化</li><li>蒸馏水冲洗</li><li>挂载</li><li> 结果 <ol><li> Mineralised骨=绿色</li><li>骨样=红/橙</li><li>核=蓝灰色</li><li>软骨=紫色</li></ol></li></ol></li></ol></li><li>荧光染料的准备工作： </li><li>这些管理缓慢静脉注射，相隔至少两个星期。 </li><li>剂量<ol class="lalpha"><li>钙黄绿素绿10毫克/公斤IV </li><li>土霉素50毫克/公斤IV </li><li>茜素络合剂30毫克/公斤IV </li></ol></li><li>钙黄绿素绿色的制备<ol class="lalpha"><li> 1克钙黄绿素绿色的是用1 M NaOH溶液滴定，直至被解散为止。 </li><li>用1％NaOH调整pH值至pH = 7.1-7.2。 </li><li>光屏蔽过​​滤器，并保持</li></ol></li><li>茜素络合剂的制备<ol class="lalpha"><li>茜素络合克用1 M NaOH溶液滴定，直至解散。 </li><li> pH值，然后用1％盐酸或氢氧化钠调整至pH = 7.1-7.2。 </li><li>光屏蔽过​​滤器，并保持</li></ol></li><li>土霉素的制备<ol class="lalpha"><li>土霉素是作为一个现成的抗微生物药物。无需配制。 </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Kerr, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Atlas of Functional Histology. , 164-168 (2000).</li><li>Parfitt, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+histomorphometry:+standardization+of+nomenclature,+symbols,+and+units.+Report+of+the+ASBMR+Histomorphometry+Nomenclature+Committee.">Bone histomorphometry: standardization of nomenclature, symbols, and units. Report of the ASBMR Histomorphometry Nomenclature Committee.</a> J Bone Miner Res. 2, 595-610 (1987).</li><li>An, Y. H., Martin, K. l. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Handbook of histology methods for bone and cartilage. , (2003).</li><li>Bancroft, J. D., Gamble, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Theory and Practice of Histological Techniques. , 352-360 (2008).</li></ol>

溶剂： <ul><li>酸，10％的正常缓冲福尔马林，乙醇，二甲苯和丁醇 所有组织学级，无硫。 Grale科学Pty有限公司 http://www.grale.com.au </li></ul> 模具： <ul><li>剥离，塑料模具 Grale科学</li></ul> 幻灯片： <ul><li> SUPERFROST PLUS的显微镜幻灯片 博士伦科学Pty有限公司 <a href="http://www.lomb.com.au/">http://www.lomb.com.au</a> </li></ul> 树脂： <ul><li> GlycolMethacrylate Technovit 7100 贺利氏古莎 <a href="http://www.kulzer-technik.de/168/Products/Histology/Technovit_7100.htm">http://www.kulzer-technik.de/168/Products/Histology/Technovit_7100.htm</a> </li><li>背座树脂Technovit 3040 HISTO块 贺利氏古莎</li></ul> 渍 （Grale科学试剂） Goldner三色染色</li> 1。 Weigert氏铁hemotoxylin（DeGroat） <table style="margin-left:40px;" border="0"><tr><td colspan="2" style="font-weight:bold;"> A）Hemotoxylin解决方案</td></tr><tr><td> Hemotoxylin </td><td> 1克</td></tr><tr><td>无水酒精</td><td> 100毫升</td></tr><tr><td colspan="2" style="font-weight:bold;"> B）铁溶液</td></tr><tr><td> 30％三氯化铁水溶液</td><td> 4ML </td></tr><tr><td>盐酸（浓） </td><td> 1ML </td></tr><tr><td>蒸馏水</td><td> 95ml置于</td></tr></table>过滤和添加到同等体积的hemotoxylin立即前染色使用。 2。丽春红，品红azophloxin股票解决方案<table style="margin-left:40px;" border="0"><tr><td colspan="2" style="font-weight:bold;"> A）丽春红 - 二甲基苯胺的解决方案</td></tr><tr><td>丽春红 - 二甲基苯胺</td><td> 0.75克</td></tr><tr><td>酸fuchsion </td><td> 0.25克</td></tr><tr><td>醋酸</td><td> 1ML </td></tr><tr><td colspan="2">混合，并添加蒸馏水（100毫升） </td></tr><tr><td colspan="2" style="font-weight:bold;"> B）azophloxin解决方案</td></tr><tr><td> Azophloxin </td><td> 0.5克</td></tr><tr><td>乙酸</td><td> 0.6mL </td></tr><tr><td colspan="2">混合，并添加蒸馏水（100毫升） </td></tr><tr><td colspan="2" style="font-weight:bold;"> c）最后的工作染色解决方案</td></tr><tr><td>丽春红，品红溶液</td><td> 5 - 10毫升</td></tr><tr><td> Azophloxin </td><td> 2ML </td></tr><tr><td> 0.2％的醋酸溶液</td><td> 88mL </td></tr></table> 3。浅绿色解决方案<table style="margin-left:40px;" border="0"><tr><td>浅绿色</td><td> 1克</td></tr><tr><td>乙酸</td><td> 1ML </td></tr><tr><td colspan="2">混合，并添加蒸馏水（500毫升） </td></tr></table> 4。 Phophomolybdic酸性橙G解决方案<table style="margin-left:40px;" border="0"><tr><td>磷钼酸</td><td> 3克</td></tr><tr><td>橙G </td><td> 2克</td></tr><tr><td colspan="2">溶解在500ml的蒸馏水，加​​冰糖麝香草酚。 </td></tr></table>冯科萨染色<table style="margin-left:40px;" border="0"><tr><td> 1％硝酸银水溶液</td></tr><tr><td> 2.5％硫代硫酸钠</td></tr><tr><td> 1％番红O </td></tr></table>阿尔辛蓝染色<table style="margin-left:40px;" border="0"><tr><td>阿尔新蓝8GX </td><td> 1克</td></tr><tr><td> 3％醋酸溶液</td><td> 100毫升</td></tr></table> Hemotoxylin和曙红染色<table style="margin-left:40px;" border="0"><tr><td colspan="2" style="font-weight:bold;"> A）哈里斯的hemotoxylin </td></tr><tr><td> Hemotoxylin </td><td> 2.5克</td></tr><tr><td>无水酒精</td><td> 25ML </td></tr><tr><td>明矾</td><td> 50克</td></tr><tr><td>蒸馏水</td><td> 500毫升</td></tr><tr><td>氧化汞</td><td> 1.25克或</td></tr><tr><td>碘酸钠</td><td> 0.5克</td></tr><tr><td>冰醋酸</td><td> 20ML </td></tr><tr><td colspan="2" style="font-weight:bold;"> B）曙红溶液</td></tr><tr><td colspan="2">使用商业化生产的曙红。 </td></tr></table>所有染色的染料粉末Gurr染料粉末。 所有试剂均为分析纯，而不是实验室试剂 荧光 <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0"><tr><td> 制造商</td><td>荧光</td><td>目录编号</td></tr><tr><td> Sigma - Aldrich公司，悉尼</td><td>钙黄绿素绿</td><td> C0875 </td></tr><tr><td> Sigma - Aldrich公司，悉尼</td><td>茜素络合剂</td><td> A3882 </td></tr><tr><td>英特威澳大利亚，维多利亚</td><td>土霉素 （现成的抗菌药物） </td><td>商标名称; Engemycin 100 </td></tr></table>

undecalcified bone preparation for histology, histomorphometry and fluorochrome analysis

脱钙骨组织学显示骨微架构。它同时显示矿化骨，它提供了对骨代谢或骨形成和骨吸收的重要信息和细胞成分。这具有巨大的重要性在各种不同的临床和研究中的应用。它会产生美丽的图像技术，如荧光评估和组织形态计量学2 1和允许。荧光分析是一种钙结合的荧光染料注射在特定的时间点，在那个特定的时间允许的矿化量的量化技术。组织形态计量学是在微观层面的骨定量过程。 执行脱钙骨组织学是在技术上具有挑战性，特别是大尺寸标本。它要求在技术标准石蜡嵌入组织学的变化。该视频演示了质量好的部分生产过程和演示的技术难点和方法，克服这些。实现方式类似于其他软组织的密度和骨的通透性较低，需要相当长的固定和处理时间，但是由于经常服用几个星期，试样制备，固定和处理。嵌入使用类似或等于硬度和密度，如甲基丙烯酸甲酯树脂骨支撑介质，但不像石蜡渗透和嵌入，这是一个不可逆转的步骤。切片可以通过研磨产生较厚的部分，这是最适用于如荧光分析的研究。这是最好的实现上macrotome使用的钻石刀片。另外，较薄，可产生光镜，这是一个非常锋利的刀片使用大锤切片。爬犁切片提供了额外的的大，硬模块所需的强度和稳定性。树脂包埋切片可染各种各样的污渍，这是证明。

Watch this Scientific Journal Video about Undecalcified Bone Preparation for Histology, Histomorphometry and Fluorochrome Analysis at JoVE.com

Undecalcified Bone Preparation for Histology, Histomorphometry and Fluorochrome Analysis

脱钙骨组织学各种临床和研究中的应用提供了重要信息。这在技术上是具有挑战性，特别是大尺寸的标本。该视频演示了质量好的部分生产过程和演示的技术难点和方法，克服这些。

脱钙骨组织学，形态计量学和荧光染料分析制备

Undecalcified bone histology demonstrates the micro-architecture of bone. It shows both the mineralised and cellular components of bone, which provides ...

undecalcified-bone-preparation-for-histology-histomorphometry

Research

JoVE Journal

Biology

27.0K 次观看.  Monash University. 脱钙骨组织学各种临床和研究中的应用提供了重要信息。这在技术上是具有挑战性，特别是大尺寸的标本。该视频演示了质量好的部分生产过程和演示的技术难点和方法，克服这些。