Os autores gostariam de agradecer o apoio da Sra. Sue Connell por sua especialização na incorporação de resina e Túmulos Ms Stephania para sua perícia em laboratório. Os autores gostariam de agradecer ao professor Frank Kandziora e Dr. Marie-Anne Polboth para os seus conselhos.

<ol><li> O tecido é colocado em um recipiente selado contendo fosfato tamponado a 10% solução de formalina 3. Garantir que a exposição mínima à luz, se a análise fluorocromo é para ser realizado, como a fluorocromos são sensíveis à luz. </li><li> Estabelecer qual a orientação do tecido serão necessários. </li><li> Apare a amostra com o tamanho, na orientação correta, usando uma serra de fita. Medidas de garantir a segurança são cumpridas. A amostra é então colocada em um recipiente opaco, cujo volume deve ser de aproximadamente dez vezes o tamanho da amostra para obter uma fixação adequada. O espécime deve permanecer na solução de formalina um total de entre uma e duas semanas dependendo do seu tamanho. Sugere-se o uso de tecidos de controle para fins de teste e otimização. </li><li> Verifique o tecido se encaixa no molde de incorporação e coloque o tecido em um recipiente selado opaco contendo etanol 70%. </li><li> Processo o tecido em ordem crescente as concentrações de etanol, protegendo da luz e sob agitação constante. <ol class="lalpha"><li> 70% de etanol 1 semana </li><li> 80% de etanol 1 semana </li><li> 90% de etanol 1 semana </li><li> 100% de etanol 1 semana </li></ol></li><li> O tecido é então apagado em butanol para uma semana, mais uma vez blindagem da luz e sob agitação constante. </li><li> A densidade da resina e osso devem ser cuidadosamente acompanhado. A densidade da resina pode ser alterada (ver passo 8) e recomendamos a incorporação de um espécime primeiro teste para garantir a densidade correta. Usamos Technovit 7100 (Heraeus Kulzer) para microscopia de luz e análise fluorocromo. Se imunohistoquímica é necessária uma resina alternativa deve ser usada como Technovit 9100 (Heraeus Kulzer). </li><li> A solução de preparação Technovit 7100 pode ser misturado com pequenas alíquotas da solução de amolecimento fornecido com o kit, se necessário, mas não mais que 5% o volume de solução de preparação, em nossa experiência, a solução de amolecimento raramente é necessário. Partes iguais de etanol absoluto e Technovit base líquida 7100 são misturados e aplicados ao tecido como uma solução de infiltração de pré-por 24 horas minimizando a exposição à luz e com agitação. </li><li> A solução é, então, a infiltração composto usando um endurecedor g I (= saco 1) que é dissolvido em 100 ml de líquido de base. Isto substitui a solução de pré-infiltração e é permitido para se infiltrar em uma semana sob agitação constante. </li><li> Coloque o tecido no molde, com o rosto superfície de corte para baixo. Garantir que há uma margem (de preferência, pelo menos, 5 milímetros) em todo o tecido para a resina, o que garante força bloco. Mix 15mls de Technovit solução de preparação 7100 com 1 ml de endurecedor II e despeje em torno de amostra no molde e cobri-lo em pelo menos 5 millimietres. Cura vai começar dentro de 2 horas, mas será concluída durante a noite. </li><li> Montagem é, então, realizada por formar um bloco de apoio usando Technovit 3040 (Heraeus Kulzer). Mix Technovit 3040 em uma relação de volume de 2 partes de pó para 1 parte de líquido para obter um líquido viscoso. Despeje Technovit 3040 no recesso na parte de trás do bloco a um nível de pelo menos 2 mm acima da base do bloco. Após cerca de 10 minutos, o molde pode ser desfeito, eo bloco está pronto. </li><li> A densidade e, portanto, as propriedades de corte de resina de metacrilato são suscetíveis à umidade ambiente na sala. Os blocos devem ser armazenados em um dessecador. </li><li> Seccionamento terra produz seções maiores entre 20-50 micrômetros de espessura. É útil para a análise fluorocromo (ver secção abaixo) como seções mais espessas produzem mais brilhante fluorescência. Fixe o disco de diamante para macrotome. Adicionar lubrificante, como o espírito de petróleo para o reservatório no macrotome. Garantir o bloco no grampo e orientar a lâmina. Permitem moer a ocorrer lentamente (cerca de 20-30 minutos por seção) garantindo a lubrificação adequada. A primeira seção expõe a face de corte e orienta a seção deve ser descartado. </li><li> A próxima seção é então colocada sobre uma lâmina Além disso Superfrost. A seção tem uma tendência a enrolar por isso, recomendamos colocar uma porção de um saco de sanduíche por cima e, em seguida, segurando-o apartamento com outro slide preso no lugar. É então colocado em uma incubadora de entre 60-80 graus Celsius durante 1 hora. Isto suaviza a metacrilato e ajuda a seção aderir ao deslize de uma forma plana. </li><li> A seção de solo pode ser limpo e polido, conforme necessário usando lixa fina de uma maneira suave. </li><li> O micrótomo sledge cortes cortes finos, que proporciona o melhor seções para microsocopy luz. Use um micrótomo trenó como tem adicionado rigidez, que é necessário para o corte desses blocos rígidos. Alternativamente um micrótomo rotativo movido podem ser usados. Use uma lâmina de aço inoxidável afiada. É preferível ter duas lâminas disponíveis como se pode ser afiada como a outra é utilizada. A lâmina deve fazer um ângulo de 45 graus com o bloco. Suamolecimento rface pode ser conseguido pela aplicação de um papel molhado para o bloco, se necessário. Pode levar várias seções para atingir as condições de corte desejado para obter uma seção de qualidade. A seção é então flutuou em um banho de água e colocado sobre uma lâmina como em 16, supra. </li><li> Reagentes de coloração estão listados em Materiais abaixo. Protocolos são baseados em quatro Bancroft et al. Devido à variação de espessura é recomendado para otimizar manchas em lâminas. Rack de coloração dos tecidos pode provocar a flutuar fora do slide para adicionar a manchas diretamente para um slide plana pode ser necessária. Um protocolo idêntico ou coloração rack é necessário para resultados consistentes coloração exigida para histomorfometria. <ol class="lalpha"><li> Hematoxilina e eosina <ol class="lroman"><li> Mancha com Haematoxyilin 5-10 minutos </li><li> Lave bem com água da torneira Scott s </li><li> Mancha com Eosina 5 minutos </li><li> Lavar em água corrente </li><li> Limpar em xilol </li><li> Montar </li><li> Resultados <ol><li> Osteóide = rosa </li><li> Óssea calcificada = marrom arroxeada </li><li> Núcleos = blue </li></ol></li></ol></li><li> Von Kossa <ol class="lroman"><li> Lugar em solução de nitrato de prata e expor à luz forte até o osso fica preto (aprox. 10 min) </li><li> Lavar em água destilada por três vezes </li><li> Ameaça com tiossulfato de sódio por 5 minutos </li><li> Lavar em água destilada </li><li> Contracoloração com Safrinin O </li><li> Limpar em xilol </li><li> Montar </li><li> Resultados <ol><li> Óssea Mineralised = preto </li><li> Osteóide = vermelho / rosa </li></ol></li></ol></li><li> Masson Goldner s Trichrome <ol class="lroman"><li> Lavar com álcool alcalina (90mls de etanol 80% e 10mls de amônia 25% para 20 minutos) </li><li> Enxaguar em água </li><li> Enxágüe em água destilada </li><li> Mancha com Hematoxilina Weigert s por 10 minutos </li><li> Enxágüe em água destilada </li><li> Mancha com Ponceau-Fucsina solução final 5 minutos </li><li> Enxágüe com 1% de ácido acético 15 segundo </li><li> Mancha em fosfomolíbdico ácido-laranja solução G 5 minutos </li><li> Enxágüe com 1% de ácido acético 15 segundo </li><li> Mancha com luz verde 5 minutos </li><li> Enxágüe com 1% de ácido acético 3 mudanças </li><li> Enxágüe em água destilada </li><li> Montar </li><li> Resultados <ol><li> Óssea Mineralised = verde </li><li> Osteóide = vermelho / laranja </li><li> Núcleos = azul cinza </li><li> Cartilagem = roxo </li></ol></li></ol></li></ol></li><li> Preparações fluorocromo: </li><li> Estes são administrados por injecção intravenosa lenta, pelo menos duas semanas de intervalo. </li><li> Doses <ol class="lalpha"><li> Calceína Verde 10 mg / kg IV </li><li> Oxitetraciclina 50 mg / kg IV </li><li> Alizarina complexona 30 mg / kg IV </li></ol></li><li> Preparação de calceína Verde <ol class="lalpha"><li> Um grama de calceína Verde é titulado com NaOH 1 M até dissolver. </li><li> pH é ajustado com NaOH 1% até pH = 7,1-7,2. </li><li> Filtro e manter protegido da luz </li></ol></li><li> Preparação de Alizarina complexona <ol class="lalpha"><li> Três gramas de Alizarina complexona é titulado com NaOH 1 M até dissolver. </li><li> pH é ajustado com HCl 1% ou NaOH até pH = 7,1-7,2. </li><li> Filtro e manter protegido da luz </li></ol></li><li> Preparação de Oxitetraciclina <ol class="lalpha"><li> Oxitetraciclina está disponível como um fora da prateleira de drogas anti-microbial. Não requer preparação. </li></ol></li></ol>

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	<li>Kerr, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Atlas of Functional Histology. , 164-168 (2000).</li><li>Parfitt, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+histomorphometry:+standardization+of+nomenclature,+symbols,+and+units.+Report+of+the+ASBMR+Histomorphometry+Nomenclature+Committee.">Bone histomorphometry: standardization of nomenclature, symbols, and units. Report of the ASBMR Histomorphometry Nomenclature Committee.</a> J Bone Miner Res. 2, 595-610 (1987).</li><li>An, Y. H., Martin, K. l. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Handbook of histology methods for bone and cartilage. , (2003).</li><li>Bancroft, J. D., Gamble, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Theory and Practice of Histological Techniques. , 352-360 (2008).</li></ol>

Solventes: <ul><li> 10% normal Buffered ácido formalina, Xileno Etanol e Butanol Todos grau histológico, livre de enxofre. GRALE Scientific Pty Ltd. http://www.grale.com.au </li></ul> Moldes: <ul><li> Descascar, moldes de plástico GRALE Scientific </li></ul> Slides: <ul><li> Microscópio SuperFrost slides PLUS Lomb Scientific Pty Ltd. <a href="http://www.lomb.com.au/">http://www.lomb.com.au</a> </li></ul> Resina: <ul><li> Technovit GlycolMethacrylate 7100 Heraeus Kulzer <a href="http://www.kulzer-technik.de/168/Products/Histology/Technovit_7100.htm">http://www.kulzer-technik.de/168/Products/Histology/Technovit_7100.htm</a> </li><li> Fazendo bloco de resina-Technovit 3040 bloco Histo Heraeus Kulzer </li></ul> Manchas (Reagentes de GRALE Científica) Trichrome Goldner da mancha </li> 1. Ferro Weigert hemotoxylin (DeGroat) <table style="margin-left:40px;" border="0"><tr><td colspan="2" style="font-weight:bold;"> a) solução Hemotoxylin </td></tr><tr><td> Hemotoxylin </td><td> 1g </td></tr><tr><td> Álcool absoluto </td><td> 100mL </td></tr><tr><td colspan="2" style="font-weight:bold;"> b) Solução de Ferro </td></tr><tr><td> 30% de cloreto férrico aquosa </td><td> 4mL </td></tr><tr><td> Ácido clorídrico (concentrado) </td><td> 1mL </td></tr><tr><td> água destilada </td><td> 95mL </td></tr></table> Filtrado e adicionado volume igual de hemotoxylin imediatamente antes mancha usado. 2. Ponceau-fucsina-azophloxin soluções estoque <table style="margin-left:40px;" border="0"><tr><td colspan="2" style="font-weight:bold;"> a) solução de Ponceau xilidina </td></tr><tr><td> Ponceau de xilidina </td><td> 0,75 g </td></tr><tr><td> fuchsion ácido </td><td> 0.25g </td></tr><tr><td> Ácido acético </td><td> 1mL </td></tr><tr><td colspan="2"> mix, e adicionar água destilada (100ml) </td></tr><tr><td colspan="2" style="font-weight:bold;"> b) solução azophloxin </td></tr><tr><td> Azophloxin </td><td> 0.5g </td></tr><tr><td> Ácido acético </td><td> 0,6 ml </td></tr><tr><td colspan="2"> mix, e adicionar água destilada (100ml) </td></tr><tr><td colspan="2" style="font-weight:bold;"> c) Final solução de trabalho mancha </td></tr><tr><td> Ponceau-fucsina solução </td><td> 5-10ml </td></tr><tr><td> Azophloxin </td><td> 2mL </td></tr><tr><td> Solução de ácido acético 0,2% </td><td> 88mL </td></tr></table> 3. Solução Green Light <table style="margin-left:40px;" border="0"><tr><td> Luz verde </td><td> 1g </td></tr><tr><td> ácido acético </td><td> 1mL </td></tr><tr><td colspan="2"> Misture e adicione água destilada (500ml) </td></tr></table> 4. Phophomolybdic ácido-Orange solução G <table style="margin-left:40px;" border="0"><tr><td> Ácido fosfomolíbdico </td><td> 3g </td></tr><tr><td> Laranja G </td><td> 2g </td></tr><tr><td colspan="2"> Dissolver em 500mL de água destilada e adicionar timol cristal. </td></tr></table> Von Kossa Stain <table style="margin-left:40px;" border="0"><tr><td> 1% de nitrato de prata aquoso </td></tr><tr><td> Tiossulfato de sódio 2,5% </td></tr><tr><td> 1% de safranina O </td></tr></table> Alcian mancha azul <table style="margin-left:40px;" border="0"><tr><td> Alcian blue 8GX </td><td> 1g </td></tr><tr><td> Solução de ácido acético 3% </td><td> 100mL </td></tr></table> Hemotoxylin e eosina <table style="margin-left:40px;" border="0"><tr><td colspan="2" style="font-weight:bold;"> a) hemotoxylin Harris </td></tr><tr><td> Hemotoxylin </td><td> 2.5g </td></tr><tr><td> Álcool absoluto </td><td> 25mL </td></tr><tr><td> Alum de potássio </td><td> 50g </td></tr><tr><td> água destilada </td><td> 500mL </td></tr><tr><td> óxido de mercúrio </td><td> 1,25 g OR </td></tr><tr><td> Iodato de sódio </td><td> 0.5g </td></tr><tr><td> Ácido acético glacial </td><td> 20mL </td></tr><tr><td colspan="2" style="font-weight:bold;"> b) solução de Eosina </td></tr><tr><td colspan="2"> Eosina produzido comercialmente foi usado. </td></tr></table> Todos os pós corante mancha são pós Gurr corante. Todos os reagentes são reagentes analíticos, e não Lab reagentes Fluorocromos <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0"><tr><td> Fabricante </td><td> Fluorocromo </td><td> Número Catálogo </td></tr><tr><td> Sigma-Aldrich, Sydney </td><td> Calceína Verde </td><td> C0875 </td></tr><tr><td> Sigma-Aldrich, Sydney </td><td> Alizarina complexona </td><td> A3882 </td></tr><tr><td> Intervet Austrália, Victoria </td><td> Oxitetraciclina (Fora da droga antimicrobiana prateleira) </td><td> Comercial; Engemycin 100 </td></tr></table>

undecalcified bone preparation for histology, histomorphometry and fluorochrome analysis

Histologia óssea Undecalcified demonstra a micro-arquitetura do osso. Ele mostra tanto os componentes mineralizados e celulares do osso, que fornece informações vitais sobre o turnover ósseo ou formação e reabsorção óssea. Isto tem uma enorme importância em uma variedade de aplicações clínicas e de pesquisa. Ele produz belas imagens 1 e permite técnicas como a avaliação fluorocromo e histomorfometria 2. Análise fluorocromo é uma técnica onde corantes fluorescentes que se ligam ao cálcio são injetados em um ponto determinado momento, que permite a quantificação da quantidade de mineralização naquele momento. Histomorfometria é um processo de quantificação do osso ao nível microscópico. Realizar histologia óssea undecalcified é tecnicamente desafiador, especialmente com amostras de grande porte. Ela exige variações na técnica dos utilizados em parafina padrão incorporado histologia. Este vídeo ilustra o processo de produção de seções de boa qualidade e demonstra as dificuldades técnicas e métodos com os quais a superá-los. Preparação de amostras de fixação e processamento são alcançados com uma forma semelhante a outros tecidos moles, no entanto, devido à densidade e menor permeabilidade do osso consideravelmente maior fixação e os tempos de processamento são necessárias, muitas vezes levando várias semanas. Incorporação é alcançado usando um meio de suporte com dureza semelhantes ou iguais e densidade do osso, como metacrilato de resinas à base, mas ao contrário de infiltração de parafina e incorporação, este é um passo irreversível. Seccionamento pode ser conseguido através de moagem, que produz uma espessa seção, que é ótimo para os estudos, como a análise fluorocromo. Este é o melhor conseguido usando uma lâmina de diamante em uma macrotome. Alternativamente, as seções mais finas podem ser produzidas por microscopia de luz e isso é conseguido usando um micrótomo trenó com uma lâmina muito afiada. O micrótomo sledge fornece a maior resistência e estabilidade necessária para grandes blocos rígidos. Seções de resina incorporado pode ser manchado com uma variedade de manchas, que são demonstradas.

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Undecalcified Bone Preparation for Histology, Histomorphometry and Fluorochrome Analysis

Histologia óssea Undecalcified fornece informações importantes para uma variedade de aplicações clínicas e de pesquisa. É tecnicamente desafiador, especialmente com amostras de grande porte. Este vídeo ilustra o processo de produção de seções de boa qualidade e demonstra as dificuldades técnicas e métodos com os quais a superá-los.

Preparação óssea Undecalcified de Histologia, Histomorfometria e Análise Fluorocromo

Undecalcified bone histology demonstrates the micro-architecture of bone. It shows both the mineralised and cellular components of bone, which provides ...

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