Die Autoren bedanken sich bei der Unterstützung von Frau Sue Connell für ihr Know-how erkennen in Harz eingebettet und Frau Stephania Gräber für ihre Labor-Know-how. Die Autoren bedanken sich bei Professor Frank Kandziora und Dr. Marie-Anne Polboth für ihre Ratschläge danken.

<ol><li> Das Gewebe wird in einem geschlossenen Behälter mit 10% Phosphat-gepufferter Formalin-Lösung 3 platziert. Stellen Sie sicher, minimal Einwirkung von Licht, wenn Fluorochrom-Analyse durchgeführt werden, da die Fluorochrome lichtempfindlich sind. </li><li> Stellen Sie die Ausrichtung des Gewebes erforderlich. </li><li> Schneiden Sie die Probe auf Größe, in der richtigen Ausrichtung, mit einer Bandsäge. Stellen Sie sicher, Sicherheitsmaßnahmen eingehalten werden. Die Probe wird dann in eine undurchsichtige Behälter gelegt, sollte das Volumen etwa das Zehnfache der Größe der Probe werden, um eine ausreichende Fixierung zu erreichen. Die Probe sollte in der Formalin-Lösung insgesamt zwischen einer und zwei Wochen, je nach ihrer Größe bleiben. Es wird empfohlen, mit Kontroll-Gewebe für die Prüfung und Optimierung. </li><li> Überprüfen Sie das Gewebe passt in die Einbettform und Ort des Gewebes in einem verschlossenen undurchsichtigen Behälter mit 70% Ethanol. </li><li> Prozess des Gewebes in aufsteigender Konzentrationen von Ethanol, Abschirmung vor Licht und unter ständigem Rühren. <ol class="lalpha"><li> 70% Ethanol 1 Woche </li><li> 80% Ethanol 1 Woche </li><li> 90% Ethanol 1 Woche </li><li> 100% Ethanol 1 Woche </li></ol></li><li> Das Gewebe wird dann in Butanol für 1 Woche gelöscht, wieder Abschirmung von Licht und unter ständigem Rühren. </li><li> Die Dichte des Harzes und Knochen sollten eng aufeinander abgestimmt werden. Harzdichte verändert werden können (siehe Schritt 8), und wir empfehlen die Einbettung eines Prüflings erste richtige Dichte zu gewährleisten. Wir verwenden Technovit 7100 (Heraeus Kulzer) für die Lichtmikroskopie und Fluorochrom-Analyse. Wenn Immunhistochemie ist erforderlich, eine alternative Harz muss wie Technovit 9100 (Heraeus Kulzer) verwendet werden. </li><li> Die Technovit 7100 Vorbereitung Lösung kann mit kleinen Aliquoten der Erweichung Lösung mit dem Kit enthalten sind, falls erforderlich vermischt werden, aber nicht mehr als 5% des Volumens der Zubereitung Lösung; nach unserer Erfahrung die Erweichung Lösung ist nur selten erforderlich. Zu gleichen Teilen absolutem Ethanol und Basisflüssigkeit Technovit 7100 werden gemischt und auf das Gewebe als pre-Infiltration Lösung für 24 Stunden minimiert Belichtung und unter Rühren. </li><li> Die Infiltration Lösung wird dann mit 1 g Härter I (= 1 Sack), die in 100 ml Basis Flüssigkeit gelöst wird. Dies ersetzt die vor Infiltration Lösung und darf für 1 Woche unter ständigem Rühren zu infiltrieren. </li><li> Legen Sie das Gewebe in die Form, mit der Schnittfläche nach unten zeigen. Stellen Sie sicher, es gibt einen Spielraum (im Idealfall mindestens 5 Millimeter) um das Gewebe für das Harz, das sorgt für Block Stärke. Mix 15mls von Technovit 7100 Vorbereitung Lösung mit 1 ml Härter II und gießen Sie rund um Probe in der Form und bedecken Sie es mit mindestens 5 millimietres. Die Aushärtung wird innerhalb von 2 Stunden zu beginnen, sondern wird komplett über Nacht. </li><li> Die Montage erfolgt dann durch Gestaltung einer Unterlage Block mit Technovit 3040 (Heraeus Kulzer) durchgeführt. Mix Technovit 3040 in einem Volumen-Verhältnis von 2 Teile Pulver zu 1 Teil Flüssigkeit zu einer viskosen Flüssigkeit erhalten. Gießen Technovit 3040 in die Aussparung an der Rückseite des Blocks auf ein Niveau von mindestens 2 mm über dem Boden des Blocks. Nach etwa 10 Minuten kann die Form abgeschält werden und der Block fertig ist. </li><li> Die Dichte und damit die Zerspanbarkeit von Methacrylatharz sind anfällig für die Luftfeuchtigkeit im Raum. Die Blöcke sollten daher in einem Exsikkator aufbewahrt werden. </li><li> Boden Schnitte produziert größere Abschnitte zwischen 20-50 Mikrometer dick. Es ist nützlich für Fluorochrom-Analyse (siehe unten) als dickere Abschnitte heller Fluoreszenz zu erzeugen. Sichern Sie die Diamantscheibe zu macrotome. Add Schmiermittel, wie Benzin, um das Reservoir auf dem macrotome. Sichern Sie den Block in der Klemme und orientieren sich an Klinge. Lassen Schleifen zu langsam erfolgen (ca. 20-30 Minuten pro Abschnitt) gewährleistet ausreichende Schmierung. Der erste Abschnitt macht die Spanfläche und richtet die Sektion-es sollte weggeworfen werden. </li><li> Im nächsten Abschnitt wird dann auf einen Superfrost Plus Objektträger gebracht. Der Abschnitt hat eine Tendenz, curl, damit wir platzieren einen Teil einer Sandwich-Beutel empfehlen darüber und dann hält sie flach mit einer anderen Folie eingespannt. Es wird dann in einen Inkubator zwischen 60-80 Grad Celsius für 1 Stunde gelegt. Dies mildert die Methacrylat und hilft dem Abschnitt, um die Folie in einer flachen Form zu halten. </li><li> Der Schliff kann gereinigt und poliert werden nach Bedarf mit feinem Schleifpapier auf sanfte Weise. </li><li> Der Schlitten Mikrotom Schnitte dünne Schnitte, welche die besten Abschnitte für Licht microsocopy. Verwenden Sie einen Schlitten Mikrotom wie Steifigkeit, die für das Schneiden von diesen harten Blöcken erforderlich ist hinzugefügt wurde. Alternativ kann eine angetrieben Rotationsmikrotom verwendet werden kann. Mit einem scharfen Klinge aus rostfreiem Stahl. Es ist besser, zwei Schaufeln zur Verfügung haben als eine wie das andere geschärft werden kann, verwendet wird. Die Klinge sollte einen Winkel von 45 Grad mit dem Block. Surface Erweichung kann durch Anlegen einer nassen Papier, um den Block bei Bedarf erreicht werden. Es kann mehrere Abschnitte, um die gewünschten Schnitt zu erzielen, um eine Qualität Abschnitt zu erhalten. Der Abschnitt wird dann auf ein Wasserbad schwimmen und auf eine Folie als in 16 oben. </li><li> Färbereagenzien sind in der Materialwirtschaft im Folgenden aufgeführt. Protokolle sind auf Bancroft 4 et al. Aufgrund Dickenvariation ist es empfehlenswert, Flecken auf Testdias optimieren. Rack-Färbung kann Gewebe zu schweben aus der Folie so Zugabe die Flecken direkt an einen Flachschieber kann erforderlich sein. Ein identisches Protokoll-oder Rack-Färbung ist notwendig für die konsequente Färbung Ergebnisse für Histomorphometrie erforderlich. <ol class="lalpha"><li> Hämatoxylin und Eosin <ol class="lroman"><li> Stain mit Haematoxyilin 5-10 Minuten </li><li> Sorgfältig mit Scott s Leitungswasser </li><li> Stain mit Eosin 5 Minuten </li><li> Wash in Leitungswasser </li><li> In Xylol klären </li><li> Montieren </li><li> Ergebnisse <ol><li> Osteoid = pink </li><li> Verkalkten Knochen = violett braun </li><li> Zellkerne = blau </li></ol></li></ol></li><li> Von Kossa <ol class="lroman"><li> Legen Sie in Silbernitrat-Lösung und setzen auf starke Licht bis mineralisierten Knochen schwarz wird (ca. 10 Min.) </li><li> Wash in destilliertem Wasser dreimal </li><li> Threat mit Natriumthiosulfat für 5 Minuten </li><li> Wash in destilliertem Wasser </li><li> Gegenfärbung mit Safrinin O </li><li> In Xylol klären </li><li> Montieren </li><li> Ergebnisse <ol><li> Mineralisierte Knochen = schwarz </li><li> Osteoid = rot / pink </li></ol></li></ol></li><li> Masson Goldner s Trichrome <ol class="lroman"><li> Waschen mit alkalischen Alkohol (90mls von 80% Ethanol und 10mls von 25% Ammoniak für 20 Minuten) </li><li> Spülen in Wasser </li><li> Spülen in destilliertem Wasser </li><li> Stain mit Weigert s Hämatoxylin für 10 Minuten </li><li> Spülen in destilliertem Wasser </li><li> Stain mit Ponceau-Fuchsin endgültige Lösung 5 Minuten </li><li> Spülen mit 1% Essigsäure 15 Sekunden </li><li> Stain in Phosphormolybdänsäure-Orange G Lösung 5 Minuten </li><li> Spülen mit 1% Essigsäure 15 Sekunden </li><li> Stain mit hellgrünen 5 Minuten </li><li> Spülen mit 1% Essigsäure 3 ändert </li><li> Spülen in destilliertem Wasser </li><li> Montieren </li><li> Ergebnisse <ol><li> Mineralisierte Knochen = grün </li><li> Osteoid = rot / orange </li><li> Zellkerne = blau grau </li><li> Knorpel = violett </li></ol></li></ol></li></ol></li><li> Fluorochrom Zubereitungen: </li><li> Diese werden durch langsame intravenöse Injektion verabreicht werden, mindestens zwei Wochen auseinander. </li><li> Dosen <ol class="lalpha"><li> Calcein Grün 10 mg / kg IV </li><li> Oxytetracyclin 50 mg / kg IV </li><li> Alizarin-Komplexon 30 mg / kg IV </li></ol></li><li> Vorbereitung von Calcein Grün <ol class="lalpha"><li> Ein Gramm des Calcein Grün ist mit 1 M NaOH titriert, bis aufgelöst. </li><li> pH wird mit 1% NaOH bis pH = 7,1-7,2 eingestellt. </li><li> Filter und halten abgeschirmt vom Licht </li></ol></li><li> Vorbereitung der Alizarin-Komplexon <ol class="lalpha"><li> Drei Gramm Alizarin-Komplexon wird mit 1 M NaOH titriert, bis aufgelöst. </li><li> pH-Wert liegt dann mit 1% HCl oder NaOH bis pH = 7,1-7,2 eingestellt. </li><li> Filter und halten abgeschirmt vom Licht </li></ol></li><li> Vorbereitung von Oxytetracyclin <ol class="lalpha"><li> Oxytetracyclin ist als aus dem Regal anti-mikrobiellen Medikamenten. Keine Vorbereitung erforderlich. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Kerr, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Atlas of Functional Histology. , 164-168 (2000).</li><li>Parfitt, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+histomorphometry:+standardization+of+nomenclature,+symbols,+and+units.+Report+of+the+ASBMR+Histomorphometry+Nomenclature+Committee.">Bone histomorphometry: standardization of nomenclature, symbols, and units. Report of the ASBMR Histomorphometry Nomenclature Committee.</a> J Bone Miner Res. 2, 595-610 (1987).</li><li>An, Y. H., Martin, K. l. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Handbook of histology methods for bone and cartilage. , (2003).</li><li>Bancroft, J. D., Gamble, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Theory and Practice of Histological Techniques. , 352-360 (2008).</li></ol>

Lösungsmittel: <ul><li> 10% Normal-Buffered Formalin, Ethanol, Xylol und Butanol Säure Alle Histologie grade, schwefelfrei. GRALE Scientific Pty Ltd http://www.grale.com.au </li></ul> Schimmelpilze: <ul><li> Peel entfernt, Kunststoffformen GRALE Scientific </li></ul> Slides: <ul><li> SuperFrost Plus Objektträger Lomb Scientific Pty Ltd <a href="http://www.lomb.com.au/">http://www.lomb.com.au</a> </li></ul> Harz: <ul><li> GlycolMethacrylate Technovit 7100 Heraeus Kulzer <a href="http://www.kulzer-technik.de/168/Products/Histology/Technovit_7100.htm">http://www.kulzer-technik.de/168/Products/Histology/Technovit_7100.htm</a> </li><li> Sichern blockieren Resin-Technovit 3040 Histo-Block Heraeus Kulzer </li></ul> Stains (Reagenzien aus GRALE Scientific) Goldner ist Trichrom </li> 1. Weigert Eisen Hämatoxilin (DeGroat) <table style="margin-left:40px;" border="0"><tr><td colspan="2" style="font-weight:bold;"> a) Hämatoxilin Lösung </td></tr><tr><td> Hämatoxilin </td><td> 1g </td></tr><tr><td> Absoluter Alkohol </td><td> 100ml </td></tr><tr><td colspan="2" style="font-weight:bold;"> b) Eisen-Lösung </td></tr><tr><td> 30% ige wässrige Eisenchlorid </td><td> 4mL </td></tr><tr><td> Salzsäure (konzentriert) </td><td> 1ml </td></tr><tr><td> destilliertem Wasser </td><td> 95ml </td></tr></table> Filtriert und zu gleichen Volumen Hämatoxilin unmittelbar vor verwendet Fleck. 2. Ponceau-Fuchsin-azophloxin Stammlösungen <table style="margin-left:40px;" border="0"><tr><td colspan="2" style="font-weight:bold;"> a) Ponceau de Xylidin Lösung </td></tr><tr><td> Ponceau de Xylidin </td><td> 0.75g </td></tr><tr><td> Säure fuchsion </td><td> 0.25g </td></tr><tr><td> Essigsäure </td><td> 1ml </td></tr><tr><td colspan="2"> mischen, und fügen Sie destilliertes Wasser (100 ml) </td></tr><tr><td colspan="2" style="font-weight:bold;"> b) azophloxin Lösung </td></tr><tr><td> Azophloxin </td><td> 0.5g </td></tr><tr><td> Essigsäure </td><td> 0,6 ml </td></tr><tr><td colspan="2"> mischen, und fügen Sie destilliertes Wasser (100 ml) </td></tr><tr><td colspan="2" style="font-weight:bold;"> c) Letzter Arbeitstag Färbelösung </td></tr><tr><td> Ponceau-Fuchsin-Lösung </td><td> 5-10ml </td></tr><tr><td> Azophloxin </td><td> 2 ml </td></tr><tr><td> 0,2% Essigsäure-Lösung </td><td> 88ml </td></tr></table> 3. Light Green-Lösung <table style="margin-left:40px;" border="0"><tr><td> Light Green </td><td> 1g </td></tr><tr><td> Essigsäure </td><td> 1ml </td></tr><tr><td colspan="2"> Mix, und fügen Sie destilliertes Wasser (500 ml) </td></tr></table> 4. Phophomolybdic Säure-Orange G-Lösung <table style="margin-left:40px;" border="0"><tr><td> Phosphormolybdänsäure </td><td> 3g </td></tr><tr><td> Orange G </td><td> 2g </td></tr><tr><td colspan="2"> Man löst in 500 ml destilliertem Wasser und fügen Kristall Thymol. </td></tr></table> Von Kossa Stain <table style="margin-left:40px;" border="0"><tr><td> 1% ige wässrige Silbernitratlösung </td></tr><tr><td> 2,5% Natriumthiosulfat </td></tr><tr><td> 1% Safranin O </td></tr></table> Alcianblau Fleck <table style="margin-left:40px;" border="0"><tr><td> Alcianblau 8GX </td><td> 1g </td></tr><tr><td> 3% Essigsäure-Lösung </td><td> 100ml </td></tr></table> Hämatoxilin und Eosin-Färbung <table style="margin-left:40px;" border="0"><tr><td colspan="2" style="font-weight:bold;"> a) Harris Hämatoxilin </td></tr><tr><td> Hämatoxilin </td><td> 2.5g </td></tr><tr><td> Absolute Alkohol </td><td> 25ml </td></tr><tr><td> Potassium Alum </td><td> 50g </td></tr><tr><td> destilliertem Wasser </td><td> 500ml </td></tr><tr><td> Quecksilberoxid </td><td> 1,25 g OR </td></tr><tr><td> Natriumjodat </td><td> 0.5g </td></tr><tr><td> Eisessig </td><td> 20mL </td></tr><tr><td colspan="2" style="font-weight:bold;"> b) Eosin-Lösung </td></tr><tr><td colspan="2"> Kommerziell hergestellte Eosin verwendet wurde. </td></tr></table> Alle Flecken Farbstoffpulvern sind Gurr Farbstoffpulvern. Alle Reagenzien sind analytische Reagenzien und nicht Lab Reagenzien Fluorochrome <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0"><tr><td> Hersteller </td><td> Fluorochrom </td><td> Katalog-Nummer </td></tr><tr><td> Sigma-Aldrich, Sydney </td><td> Calcein Grün </td><td> C0875 </td></tr><tr><td> Sigma-Aldrich, Sydney </td><td> Alizarin-Komplexon </td><td> A3882 </td></tr><tr><td> Intervet Australia, Victoria </td><td> Oxytetracyclin (Aus dem Regal antimikrobiellen Wirkstoff) </td><td> Handelsname; Engemycin 100 </td></tr></table>

undecalcified bone preparation for histology, histomorphometry and fluorochrome analysis

Nichtentkalktem Knochenhistologie zeigt die Mikroarchitektur des Knochens. Es zeigt sowohl die mineralisierten und zellulären Bestandteile des Knochens, die wichtige Informationen auf den Knochenumbau oder Knochenbildung und Resorption zur Verfügung stellt. Dies hat enorme Bedeutung in einer Vielzahl von klinischen und wissenschaftlichen Anwendungen. Es liefert schöne Bilder 1 und ermöglicht Techniken wie Fluorochrom Beurteilung und Histomorphometrie 2. Fluorochrom-Analyse ist eine Technik, bei der Fluoreszenz-Farbstoffe, die Kalzium binden zu einem bestimmten Zeitpunkt, der für die Quantifizierung der Menge der Mineralisierung können an diesem bestimmten Zeitpunkt gespritzt werden. Histomorphometrisch ist ein Prozess des Knochen-Quantifizierung auf der mikroskopischen Ebene. Performing nichtentkalktem Knochenhistologie ist technisch anspruchsvoll, vor allem bei großformatigen Proben. Es erfordert Veränderungen in Technik von den in Standard-Paraffin eingebetteten Histologie verwendet. Dieses Video zeigt den Prozess der Herstellung guter Qualität Abschnitte und zeigt die technischen Schwierigkeiten und Methoden, mit denen sie zu überwinden. Probenvorbereitung, Fixierung und Verarbeitung sind mit einer ähnlichen Weise wie andere Weichteile, aber aufgrund der Dichte und eine geringere Durchlässigkeit des Knochens erheblich länger Fixierung und Verarbeitung gefordert sind, oft unter mehreren Wochen erreicht. Embedding erfolgt über ein Trägermedium mit ähnlichen oder gleichen Härte und Dichte des Knochens wie Methacrylat-Harze, aber im Gegensatz zu Paraffin Infiltration und Einbettung, ist dies ein irreversibler Schritt. Schnitte können durch Schleifen, die zu einer dickeren Abschnitt, der optimal für Studien wie Fluorochrom Analyse erreicht werden. Dies ist am besten mit einem Diamant-Trennscheibe auf einem macrotome. Alternativ können dünnere Abschnitte für die Lichtmikroskopie hergestellt werden und erreichen Sie dies über einen Schlitten Mikrotom mit einem sehr scharfen Messer. Der Schlitten Mikrotom bietet die zusätzliche Festigkeit und Stabilität für große, harte Blöcke benötigt. Resin eingebettet Abschnitte können mit einer Vielzahl von Flecken, die gezeigt gefärbt werden.

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Undecalcified Bone Preparation for Histology, Histomorphometry and Fluorochrome Analysis

Nichtentkalktem Knochenhistologie liefert wichtige Informationen für eine Vielzahl von klinischen und wissenschaftlichen Anwendungen. Es ist technisch anspruchsvoll, vor allem bei großformatigen Proben. Dieses Video zeigt den Prozess der Herstellung guter Qualität Abschnitte und zeigt die technischen Schwierigkeiten und Methoden, mit denen sie zu überwinden.

Nichtentkalktem Knochen Vorbereitung für Histologie, Histomorphometrisch und Fluorochrom Analysis

Undecalcified bone histology demonstrates the micro-architecture of bone. It shows both the mineralised and cellular components of bone, which provides ...

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Research

JoVE Journal

Biology

27.1K Aufrufe.  Monash University. Nichtentkalktem Knochenhistologie liefert wichtige Informationen für eine Vielzahl von klinischen und wissenschaftlichen Anwendungen. Es ist technisch anspruchsvoll, vor allem bei großformatigen Proben. Dieses Video zeigt den Prozess der Herstellung guter Qualität Abschnitte und zeigt die technischen Schwierigkeiten und Methoden, mit denen sie zu überwinden.

Serie: Undecalcified Bone Preparation for Histology, Histomorphometry and Fluorochrome Analysis

The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell  electroporation system and Gene Pulser  electroporation buffer were specifically developed to transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells.This video demonstrates how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow, and then prepare them for electroporation in the MXcell system. We begin by isolating femur and tibia. Bone marrow from both femur and tibia are then harvested and cultures are established. Cultured bone marrow cells are then transfected and analyzed.

This procedure describes how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow and is followed by transfection using the Gene Pulser MXCell electroporation system.

Die Herstellung von primären hämatopoetischen Zellkulturen aus Knochenmark der Maus für die Elektroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

Forschung

Biologie

A Neuronal and Astrocyte Co-Culture Assay for High Content Analysis of Neurotoxicity

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing measurement of multiple cellular phenotypes within a single assay. In this study, we utilized HCA to develop a novel assay for neurotoxicity. Neurotoxicity assessment represents an important part of drug safety evaluation, as well as being a significant focus of environmental protection efforts. Additionally, neurotoxicity is also a well-accepted in vitro marker of the development of neurodegenerative diseases such as Alzheimer's and Parkinson's diseases. Recently, the application of HCA to neuronal screening has been reported. By labeling neuronal cells with &beta;III-tubulin, HCA assays can provide high-throughput, non-subjective, quantitative measurements of parameters such as neuronal number, neurite count and neurite length, all of which can indicate neurotoxic effects. However, the role of astrocytes remains unexplored in these models. Astrocytes have an integral role in the maintenance of central nervous system (CNS) homeostasis, and are associated with both neuroprotection and neurodegradation when they are activated in response to toxic substances or disease states. GFAP is an intermediate filament protein expressed predominantly in the astrocytes of the CNS. Astrocytic activation (gliosis) leads to the upregulation of GFAP, commonly accompanied by astrocyte proliferation and hypertrophy. This process of reactive gliosis has been proposed as an early marker of damage to the nervous system. The traditional method for GFAP quantitation is by immunoassay. This approach is limited by an inability to provide information on cellular localization, morphology and cell number. We determined that HCA could be used to overcome these limitations and to simultaneously measure multiple features associated with gliosis - changes in GFAP expression, astrocyte hypertrophy, and astrocyte proliferation - within a single assay. In co-culture studies, astrocytes have been shown to protect neurons against several types of toxic insult and to critically influence neuronal survival. Recent studies have suggested that the use of astrocytes in an in vitro neurotoxicity test system may prove more relevant to human CNS structure and function than neuronal cells alone. Accordingly, we have developed an HCA assay for co-culture of neurons and astrocytes, comprised of protocols and validated, target-specific detection reagents for profiling &beta;III-tubulin and glial fibrillary acidic protein (GFAP). This assay enables simultaneous analysis of neurotoxicity, neurite outgrowth, gliosis, neuronal and astrocytic morphology and neuronal and astrocytic development in a wide variety of cellular models, representing a novel, non-subjective, high-throughput assay for neurotoxicity assessment. The assay holds great potential for enhanced detection of neurotoxicity and improved productivity in neuroscience research and drug discovery.

This article describes a novel protocol and reagent set designed for sensitive measurement of neurotoxic effects of compounds and treatments on co-cultures of neurons and astrocytes using high content analysis. Results demonstrate that high content analysis represents an exciting novel technology for neurotoxicity assessment.

Eine Neuronale und Astrocyte Co-Kultur-Assay für High Content Analyse der Neurotoxizität

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing ...

Preparation of Adult Drosophila Eyes for Thin Sectioning and Microscopic Analysis

Drosophila has long been used as model system to study development, mainly due to the ease with which it is genetically tractable. Over the years, a plethora of mutant strains and technical tricks have been developed to allow sophisticated questions to be asked and answered in a reasonable amount of time. Fundamental insight into the interplay of components of all known major signaling pathways has been obtained in forward and reverse genetic Drosophila studies. The fly eye has proven to be exceptionally well suited for mutational analysis, since, under laboratory conditions, flies can survive without functional eyes. Furthermore, the surface of the insect eye is composed of some 800 individual unit eyes (facets or ommatidia) that form a regular, smooth surface when looked at under a dissecting microscope. Thus, it is easy to see whether a mutation might affect eye development or growth by externally looking for the loss of the smooth surface ('rough eye' phenotype; Fig. 1) or overall eye size, respectively (for examples of screens based on external eye morphology see e.g.1). Subsequent detailed analyses of eye phenotypes require fixation, plastic embedding and thin-sectioning of adult eyes.
The Drosophila eye develops from the so-called eye imaginal disc, a bag of epithelial cells that proliferate and differentiate during larval and pupal stages (for review see e.g. 2). Each ommatidium consists of 20 cells, including eight photoreceptors (PR or R-cells; Fig. 2), four lens-secreting cone cells, pigment cells ('hexagon' around R-cell cluster) and a bristle. The photoreceptors of each ommatidium, most easily identified by their light sensitive organelles, the rhabdomeres, are organized in a trapezoid made up of the six "outer" (R1-6) and two "inner" photoreceptors (R7/8; R8 [Fig. 2] is underneath R7 and thus only seen in sections from deeper areas of the eye). The trapezoid of each facet is precisely aligned with those of its neighbors and the overall anteroposterior and dorsoventral axes of the eye (Fig. 3A). In particular, the ommatidia of the dorsal and ventral (black and red arrows, respectively) halves of the eye are mirror images of each other and correspond to two chiral forms established during planar cell polarity signaling (for review see e.g. 3).
The method to generate semi-thin eye sections (such as those presented in Fig. 3) described here is slightly modified from the one originally described by Tomlinson and Ready4. It allows the morphological analysis of all cells except for the transparent cone cells. In addition, the pigment of R-cells (blue arrowheads in Fig. 2 and 3) can be used as a cell-autonomous marker for the genotype of a R-cell, thus genetic requirements of genes in a subset of R-cells can readily be determined5,6.

Preparation of Adult Drosophila Eyes for Thin Sectioning and Microscopic Analysis

A standard approach to prepare adult Drosophila eyes for semi-thin sectioning and light microscopic analysis is presented here. The protocol can be used for gross morphological analysis of eye defects, or with the indicated adjustments can be used to determine genetic requirements of genes in specific cell types of the eye (e.g. clonal analysis of photoreceptors) or for electron microscopic analysis.

Vorbereitung von Adult Drosophila Augen für Thin Schnitte und mikroskopische Untersuchung

Drosophila has long been used as model system to study development, mainly due to the ease with which it is genetically tractable. Over the years, a ...

RNA In situ Hybridization in Whole Mount Embryos and Cell Histology Adapted for Marine Elasmobranchs

Marine elasmobranchs are valued animal models for biomedical and genomic studies as they are the most primitive vertebrates to have adaptive immunity and have unique mechanisms for osmoregulation 1-3. As the most primitive living jawed-vertebrates with paired appendages, elasmobranchs are an evolutionarily important model, especially for studies in evolution and development. Marine elasmobranchs have also been used to study aquatic toxicology and stress physiology in relationship to climate change 4. Thus, development and adaptation of methodologies is needed to facilitate and expand the use of these primitive vertebrates to multiple biological disciplines. Here I present the successful adaptation of RNA whole mount in situ hybridization and histological techniques to study gene expression and cell histology in elasmobranchs.
Monitoring gene expression is a hallmark tool of developmental biologists, and is widely used to investigate developmental processes 5. RNA whole mount in situ hybridization allows for the visualization and localization of specific gene transcripts in tissues of the developing embryo. The expression pattern of a gene's message can provide insight into what developmental processes and cell fate decisions a gene may control. By comparing the expression pattern of a gene at different developmental stages, insight can be gained into how the role of a gene changes during development.
While whole mount in situ's provides a means to localize gene expression to tissue, histological techniques allow for the identification of differentiated cell types and tissues. Histological stains have varied functions. General stains are used to highlight cell morphology, for example hematoxylin and eosin for general staining of nuclei and cytoplasm, respectively. Other stains can highlight specific cell types. For example, the alcian blue stain reported in this paper is a widely used cationic stain to identify mucosaccharides. Staining of the digestive tract with alcian blue can identify the distribution of goblet cells that produce mucosaccharides. Variations in mucosaccharide constituents on short peptides distinguish goblet cells by function within the digestive tract 6. By using RNA whole mount in situ's and histochemical methods concurrently, cell fate decisions can be linked to gene-specific expression.
Although RNA in situ's and histochemistry are widely used by researchers, their adaptation and use in marine elasmobranchs have met limited and varied success. Here I present protocols developed for elasmobranchs and used on a regular basis in my laboratory. Although further modification of the RNA in situ's hybridization method may be needed to adapt to different species, the protocols described here provide a strong starting point for researchers wanting to adapt the use of marine elasmobranchs to their scientific inquiries.

RNA In situ Hybridization in Whole Mount Embryos and Cell Histology Adapted for Marine Elasmobranchs

By combining methods for RNA whole mount in situ hybridization and histology, gene expression can be linked with cell fate decisions in the developing embryo. These methods have been adapted to marine elasmobranchs and facilitate the use of these animals as model organisms for biomedical, toxicology and comparative studies.

RNA<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisierung in whole mount Embryonen und Histologie für Marine Elasmobranchs Angepasst

Marine  elasmobranchs are valued animal models for biomedical and genomic studies as  they are the most primitive vertebrates to have adaptive immunity ...

Bone Conditioned Medium: Preparation and Bioassay

Autologous bone grafts are widely used in oral and maxillofacial surgery, orthopedics, and traumatology. Autologous bone grafts not only replace missing bone, they also support the complex process of bone regeneration. This favorable behavior of autografts is attributed to the three characteristics: osteoconductivity, osteogenicity, and osteoinductivity. However, there is another aspect: Bone grafts release a myriad of molecules, including growth factors, which can target mesenchymal cells involved in bone regeneration. The paracrine properties of bone grafts can be studied in vitro by the use of bone-conditioned medium (BCM). Here we present a protocol on how to prepare bone-conditioned medium from native pig cortical bone, and bone that underwent thermal processing or demineralization. Cells can be directly exposed to BCM or seeded onto biomaterials, such as collagen membranes, previously soaked with BCM. We give examples for in vitro bioassays with mesenchymal cells on the expression of TGF-&#946; regulated genes. The presented protocols should encourage to further reveal the paracrine effects of bone grafts during bone regeneration and open a path for translational research in the broad field of reconstructive surgery.

We describe here how to prepare bone-conditioned medium (BCM) and test its activity in vitro.

Knochen konditioniertem Medium: Vorbereitung und Bioassay

Autologous bone grafts are widely used in oral and maxillofacial surgery, orthopedics, and traumatology. Autologous bone grafts not only replace missing ...

Sample Preparation for Mass Cytometry Analysis

Mass cytometry utilizes antibodies conjugated with heavy metal labels, an approach that has greatly increased the number of parameters and opportunities for deep analysis well beyond what is possible with conventional fluorescence-based flow cytometry. As with any new technology, there are critical steps that help ensure the reliable generation of high-quality data. Presented here is an optimized protocol that incorporates multiple techniques for the processing of cell samples for mass cytometry analysis. The methods described here will help the user avoid common pitfalls and achieve consistent results by minimizing variability, which can lead to inaccurate data. To inform experimental design, the rationale behind optional or alternative steps in the protocol and their efficacy in uncovering new findings in the biology of the system being investigated is covered. Lastly, representative data is presented to illustrate expected results from the techniques presented here.

This article describes the collection and processing of samples for mass cytometry analysis.

Probenvorbereitung für die Massen Cytometry-Analyse

Mass cytometry utilizes antibodies conjugated with heavy metal labels, an approach that has greatly increased the number of parameters and opportunities ...

An Alternative Approach for Sample Preparation with Low Cell Number for TEM Analysis

Transmission electron microscopy (TEM) provides details of the cellular organization and ultrastructure. However, TEM analysis of rare cell populations, especially cells in suspension such as hematopoietic stem cells (HSCs), remains limited due to the requirement of a high cell number during sample preparation. There are a few cytospin or monolayer approaches for TEM analysis from scarce samples, but these approaches fail to get significant quantitative data from the limited number of cells. Here, an alternative and novel approach for sample preparation in TEM studies is described for rare cell populations that enables quantitative analysis.
A relatively low cell number, i.e., 10,000 HSCs, was successfully used for TEM analysis compared to the millions of cells typically used for TEM studies. In particular, Evans blue staining was performed after paraformaldehyde-glutaraldehyde (PFA-GA) fixation to visualize the tiny cell pellet, which facilitated embedding in agarose. Clusters of numerous cells were observed in ultra-thin sections. The cells had a well preserved morphology, and the ultra-structural details of the Golgi complex and several mitochondria were visible. This efficient, easy and reproducible protocol allows sample preparation from a low cell number and can be used for qualitative and quantitative TEM analysis on rare cell populations from limited biological samples.

Here, we present a protocol to prepare samples with low cell numbers for transmission electron microscopy (TEM) analysis.

Ein alternativer Ansatz für die Probenvorbereitung mit geringer Zellzahl für die TEM-Analyse

Transmission electron microscopy (TEM) provides details of the cellular organization and ultrastructure. However, TEM analysis of rare cell populations, ...

Sample Preparation for Mass-spectrometry-based Proteomics Analysis of Ocular Microvessels

The use of isolated ocular blood vessels in vitro to decipher the pathophysiological state of the eye using advanced technological approaches has greatly expanded our understanding of certain diseases. Mass spectrometry (MS)-based proteomics has emerged as a powerful tool to unravel alterations in the molecular mechanisms and protein signaling pathways in the vascular beds in health and disease. However, sample preparation steps prior to MS analyses are crucial to obtain reproducible results and in-depth elucidation of the complex proteome. This is particularly important for preparation of ocular microvessels, where the amount of sample available for analyses is often limited and thus, poses a challenge for optimum protein extraction. This article endeavors to provide an efficient, rapid and robust protocol for sample preparation from an exemplary retrobulbar ocular vascular bed employing the porcine short posterior ciliary arteries. The present method focuses on protein extraction procedures from both the supernatant and pellet of the sample following homogenization, sample cleaning with centrifugal filter devices prior to one-dimensional gel electrophoresis and peptide purification steps for label-free quantification in a liquid chromatography-electrospray ionization-linear ion trap-Orbitrap MS system. Although this method has been developed specifically for proteomics analyses of ocular microvessels, we have also provided convincing evidence that it can also be readily employed for other tissue-based samples.

Proteome characterization of ocular microvascular beds is pivotal for in-depth understanding of many ocular pathologies in humans. This study demonstrates an effective, rapid, and robust method for protein extraction and sample preparation from small blood vessels employing the porcine short posterior ciliary arteries as model vessels for mass-spectrometry-based proteomics analyses.

Probenvorbereitung für Masse-Massenspektrometrie-basierte Proteomics Analyse der okulären Mikrogefäßen

The use of isolated ocular blood vessels in vitro to decipher the pathophysiological state of the eye using advanced technological approaches has greatly ...

A Sectioning, Coring, and Image Processing Guide for High-Throughput Cortical Bone Sample Procurement and Analysis for Synchrotron Micro-CT

Bone is a dynamic and mechanically active tissue that changes in structure over the human lifespan. The products of the bone remodeling process have been studied substantially using traditional two-dimensional techniques. Recent advancements in X-ray imaging technology via desktop micro-computed tomography (&#181;CT) and synchrotron radiation micro-computed tomography (SR&#181;CT) have allowed for the acquisition of high-resolution three-dimensional (3D) scans of a larger field of view (FOV) than other 3D imaging techniques (e.g., SEM) providing a more complete picture of microscopic structures within human cortical bone. The specimen should be accurately centered within the FOV, however, to limit the appearance of streak artifacts known to impact data analysis. Previous studies have reported procurement of irregularly shaped rectilinear bone blocks that result in imaging artifacts due to uneven edges or image truncation. We have applied a geological sampling protocol (coring) to procure consistently sized cortical bone core specimens for SR&#181;CT experiments from the anterior aspect of human femora. This coring method is efficient and minimally destructive to tissue. It creates uniform cylindrical samples that decrease imaging artifacts by nature of being isometric during rotation and providing a uniform path length for X-ray beams throughout scanning. Image processing of X-ray tomographic data of cored and irregularly shaped samples confirms the potential of the technique to improve visualization and analysis of cortical bone microarchitecture. A goal of this protocol is to deliver a reliable and repeatable method for the extraction of cortical bone cores that is adaptable for various types of high-resolution bone imaging experiments. An overarching goal of the work is to create a standardized cortical bone procurement for SR&#181;CT that is affordable, consistent, and straightforward. This procedure may further be adapted by researchers in related fields who commonly evaluate hard composite materials such as in biological anthropology, geosciences, or material sciences.

We employed a geological (coring) sampling protocol to procure cortical bone specimens of uniform size for SR&#181;CT experiments from the anterior aspect of human femora. This method is minimally destructive, efficient, results in cylindrical specimens that minimize imaging artifacts from irregular sample shapes and improves microarchitectural visualization and analysis.

Bone is a dynamic and mechanically active tissue that changes in structure over the human lifespan. The products of the bone remodeling process have been ...

Tissue Collection and RNA Extraction from the Human Osteoarthritic Knee Joint

Osteoarthritis (OA) is a chronic and degenerative joint disease most often affecting the knee. As there is currently no cure, total knee arthroplasty (TKA) is a common surgical intervention. Experiments using primary human OA tissues obtained from TKA provide the capability to investigate disease mechanisms ex vivo. While OA was previously thought to impact mainly the cartilage, it is now known to impact multiple tissues in the joint. This protocol describes patient selection, sample processing, tissue homogenization, RNA extraction, and quality control (based on RNA purity, integrity, and yield) from each of seven unique tissues to support disease mechanism investigation in the knee joint. With informed consent, samples were obtained from patients undergoing TKA for OA. Tissues were dissected, washed, and stored within 4 h of surgery by flash freezing for RNA or formalin fixation for histology. Collected tissues included articular cartilage, subchondral bone, meniscus, infrapatellar fat pad, anterior cruciate ligament, synovium, and vastus medialis oblique muscle. RNA extraction protocols were tested for each tissue type. The most significant modification involved the method of disintegration used for low-cell, high-matrix, hard tissues (considered as cartilage, bone, and meniscus) versus relatively high-cell, low-matrix, soft tissues (considered as fat pad, ligament, synovium, and muscle). It was found that pulverization was appropriate for hard tissues, and homogenization was appropriate for soft tissues. A proclivity for some subjects to yield higher RNA integrity number (RIN) values than other subjects consistently across multiple tissues was observed, suggesting that underlying factors such as disease severity may impact RNA quality. The ability to isolate high-quality RNA from primary human OA tissues provides a physiologically relevant model for sophisticated gene expression experiments, including sequencing, that can lead to clinical insights that are more readily translated to patients.

Primary tissues obtained from patients following total knee arthroplasty provide an experimental model for osteoarthritis research with maximal clinical translatability. This protocol describes how to identify, process, and isolate RNA from seven unique knee tissues to support mechanistic investigation in human osteoarthritis.

Gewebeentnahme und RNA-Extraktion aus dem humanen osteoarthritischen Kniegelenk

Osteoarthritis (OA) is a chronic and degenerative joint disease most often affecting the knee. As there is currently no cure, total knee arthroplasty ...