Gli autori desiderano ringraziare per l&#39;aiuto della signora Sue Connell per la sua esperienza in embedding resina e la sig.ra Stefania Tombe per la sua esperienza di laboratorio. Gli autori desiderano ringraziare il professor Frank e il dottor Kandziora Marie-Anne Polboth per i loro consigli.

<ol><li> Il tessuto è inserito in un contenitore sigillato contenente il 10% tampone fosfato soluzione di formalina 3. Garantire la minima esposizione alla luce, se l&#39;analisi fluorocromo deve essere eseguita, in quanto il fluorocromi sono fotosensibili. </li><li> Stabilire che l&#39;orientamento del tessuto sarà richiesto. </li><li> Tagliare il campione a misura, con l&#39;orientamento corretto, utilizzando una sega a nastro. Adottare misure di sicurezza sono rispettate. Il campione viene poi inserito in un contenitore opaco, il cui volume dovrebbe essere circa dieci volte la dimensione del campione per ottenere una fissazione adeguata. Il campione dovrebbe rimanere nella soluzione di formalina per un totale compreso tra una e due settimane a seconda della sua grandezza. E &#39;suggerito di usare tessuto di controllo per i test e le finalità di ottimizzazione. </li><li> Controllare il tessuto si inserisce nello stampo embedding e posizionare il tessuto in un contenitore sigillato opaco contenente etanolo al 70%. </li><li> Processo il tessuto in modo crescente concentrazione di etanolo, schermatura dalla luce e sotto costante agitazione. <ol class="lalpha"><li> Etanolo al 70% 1 settimana </li><li> 80% di etanolo 1 settimana </li><li> 90% di etanolo 1 settimana </li><li> 100% di etanolo 1 settimana </li></ol></li><li> Il tessuto viene poi eliminato in butanolo per 1 settimana, ancora una volta schermatura dalla luce e sotto costante agitazione. </li><li> La densità della resina e le ossa devono essere attentamente abbinati. La densità della resina può essere alterata (vedi punto 8) e si consiglia di incorporare un esemplare primo test per garantire la giusta densità. Noi usiamo Technovit 7100 (Heraeus Kulzer) per microscopia ottica ed analisi fluorocromo. Se immunoistochimica è richiesta una resina alternativa deve essere usato come Technovit 9100 (Heraeus Kulzer). </li><li> La soluzione 7100 Technovit preparazione può essere miscelata con piccole aliquote della soluzione rammollimento fornito con il kit, se richiesto, ma a non più del 5% il volume di soluzione preparazione, nella nostra esperienza la soluzione di ammorbidimento è raramente necessaria. Parti uguali di etanolo assoluto e liquidi Technovit di base 7100 sono mescolati e applicati al tessuto come una pre-infiltrazione soluzione per 24 ore, riducendo al minimo l&#39;esposizione alla luce e con agitazione. </li><li> La soluzione di infiltrazione è poi costituita con 1 g di induritore I (= 1 borsa), che si scioglie in 100 ml di liquido base. Questo sostituisce il pre-infiltrazione soluzione ed è autorizzato a infiltrarsi per 1 settimana in agitazione costante. </li><li> Posizionare il tessuto nello stampo, con la faccia superficie di taglio verso il basso. Assicurarsi che vi sia un margine (idealmente almeno 5 millimetri) di tutto il tessuto per la resina, che assicura robustezza blocco. Mescolare 15ml di soluzione di preparazione Technovit 7100 con 1 ml di indurente II e versare attorno campione nello stampo e coprire di almeno 5 millimietres. Curare avrà inizio entro 2 ore, ma sarà completo durante la notte. </li><li> Montaggio viene quindi eseguita da modellare un blocco di supporto utilizzando Technovit 3040 (Heraeus Kulzer). Mix Technovit 3040 con un rapporto volume di 2 parti di polvere e 1 parte di liquido per ottenere un liquido viscoso. Versare Technovit 3040 nella rientranza sul retro del blocco ad un livello di almeno 2 mm al di sopra della base del blocco. Dopo circa 10 minuti lo stampo può essere staccato e il blocco è pronto. </li><li> La densità e quindi la proprietà di taglio della resina in metacrilato sono suscettibili di l&#39;umidità nella stanza. I blocchi devono essere conservati in un essiccatore. </li><li> Sezionamento terra produce grandi sezioni tra 20-50 micron di spessore. E &#39;utile per l&#39;analisi fluorocromo (vedere la sezione sotto), come più spesso sezioni produrre più luminoso fluorescenza. Fissare il disco diamantato per macrotome. Aggiungere lubrificante, come lo spirito di petrolio al serbatoio sul macrotome. Fissare il blocco nel morsetto e orientare a lama. Lasciare rettifica avvenga lentamente (circa 20-30 minuti per ogni sezione) garantire un&#39;adeguata lubrificazione. La prima sezione espone il volto di taglio e orienta la sezione, deve essere eliminato. </li><li> La sezione successiva è poi inserito in una diapositiva Superfrost Plus. La sezione ha la tendenza ad arricciarsi quindi si consiglia di mettere una parte di un sacchetto di panini su di esso e poi tenendola piatta con un altro scivolo bloccato in posizione. E &#39;poi inserito in un incubatore di tra 60-80 gradi centigradi per 1 ora. Questo ammorbidisce la metacrilato e aiuta la sezione aderire alla diapositiva in modo piatto. </li><li> La sezione a terra può essere pulito e lucidato, come richiesto con carta vetrata fine grana in modo gentile. </li><li> Il microtomo slitta tagli sezioni sottili, che fornisce le migliori sezioni per microsocopy luce. Utilizzare un microtomo slitta come ha aggiunto la rigidità, che è richiesto per il taglio di questi blocchi duri. In alternativa, un microtomo rotativo alimentato può essere utilizzato. Utilizzare una lama affilata in acciaio inossidabile. E &#39;preferibile avere a disposizione due lame come si può essere affilati come l&#39;altro viene utilizzato. La lama deve fare un angolo di 45 gradi con il blocco. Suammorbidimento rface può essere ottenuto applicando una carta bagnata al blocco, se necessario. Si può richiedere diverse sezioni per realizzare le condizioni di taglio desiderata per ottenere una sezione di qualità. La sezione è poi quotata in un bagno di acqua e posto su un vetrino come in 16 di cui sopra. </li><li> Reagenti di colorazione sono elencati in Materiali di seguito. Protocolli si basano su 4 Bancroft et al. A causa della variazione di spessore si consiglia di ottimizzare le macchie sui vetrini. Rack può causare colorazione dei tessuti a galleggiare fuori dalla diapositiva in modo da aggiungere le macchie direttamente a una diapositiva piatto può essere richiesta. Un protocollo identico o colorazione rack è necessario per esiti colorazione costante necessaria per istomorfometria. <ol class="lalpha"><li> Ematossilina ed eosina <ol class="lroman"><li> Macchia con Haematoxyilin 5-10 minuti </li><li> Lavare bene con acqua di rubinetto Scott s </li><li> Colorare con Eosina 5 minuti </li><li> Lavare in acqua di rubinetto </li><li> Chiara in xilene </li><li> Montare </li><li> Risultati <ol><li> Osteoide = rosa </li><li> Osso calcificato = bruno violaceo </li><li> Nuclei = blu </li></ol></li></ol></li><li> Von Kossa <ol class="lroman"><li> Posto in soluzione di nitrato d&#39;argento e di esporre alla luce forte fino a quando l&#39;osso mineralizzato diventa nero (circa 10 minuti) </li><li> Lavare in acqua distillata per tre volte </li><li> Minaccia con tiosolfato di sodio per 5 minuti </li><li> Lavare in acqua distillata </li><li> Contrasto con Safrinin O </li><li> Chiara in xilene </li><li> Montare </li><li> Risultati <ol><li> Osso mineralizzate = nero </li><li> Osteoide = rosso / rosa </li></ol></li></ol></li><li> Masson tricromica Goldner s <ol class="lroman"><li> Lavare con alcool alcalino (90mls del 80% etanolo e 10mls del 25% di ammoniaca per 20 minuti) </li><li> Risciacquare con acqua </li><li> Sciacquare con acqua distillata </li><li> Colorare con Ematossilina Weigert s per 10 minuti </li><li> Sciacquare con acqua distillata </li><li> Macchia con Ponceau-fucsina soluzione finale 5 minuti </li><li> Sciacquare con 1% di acido acetico 15 secondi </li><li> Colorare con fosfomolibdico acido-arancio soluzione G 5 minuti </li><li> Sciacquare con 1% di acido acetico 15 secondi </li><li> Macchia con la luce verde 5 minuti </li><li> Sciacquare con 1% di acido acetico 3 cambi </li><li> Sciacquare con acqua distillata </li><li> Montare </li><li> Risultati <ol><li> Osso mineralizzate = verde </li><li> Osteoide = rosso / arancio </li><li> Nuclei = blu grigio </li><li> Cartilagine = viola </li></ol></li></ol></li></ol></li><li> Preparazioni fluorocromo: </li><li> Questi sono somministrati mediante iniezione endovenosa lenta, di almeno due settimane di distanza. </li><li> Dosi <ol class="lalpha"><li> Calceina verde 10 mg / kg IV </li><li> Ossitetraciclina 50 mg / kg IV </li><li> Alizarina complessone 30 mg / kg IV </li></ol></li><li> Preparazione di calceina verde <ol class="lalpha"><li> Un grammo di calceina verde è titolato con NaOH 1 M fino alla dissoluzione. </li><li> pH è regolato con l&#39;1% NaOH fino a pH = 7,1-7,2. </li><li> Filtrare e tenere al riparo dalla luce </li></ol></li><li> Preparazione di alizarina complessone <ol class="lalpha"><li> Tre grammi di alizarina complessone è titolato con NaOH 1 M fino alla dissoluzione. </li><li> pH è quindi regolata con 1% di HCl o NaOH fino a pH = 7,1-7,2. </li><li> Filtrare e tenere al riparo dalla luce </li></ol></li><li> Preparazione del Ossitetraciclina <ol class="lalpha"><li> Ossitetraciclina è disponibile come al largo della piattaforma anti-microbico della droga. Non è necessaria la preparazione. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Kerr, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Atlas of Functional Histology. , 164-168 (2000).</li><li>Parfitt, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+histomorphometry:+standardization+of+nomenclature,+symbols,+and+units.+Report+of+the+ASBMR+Histomorphometry+Nomenclature+Committee.">Bone histomorphometry: standardization of nomenclature, symbols, and units. Report of the ASBMR Histomorphometry Nomenclature Committee.</a> J Bone Miner Res. 2, 595-610 (1987).</li><li>An, Y. H., Martin, K. l. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Handbook of histology methods for bone and cartilage. , (2003).</li><li>Bancroft, J. D., Gamble, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Theory and Practice of Histological Techniques. , 352-360 (2008).</li></ol>

Solventi: <ul><li> 10% Normale formalina tamponata, etanolo, xilene e butanolo acido Tutti grado istologico, senza zolfo. Grale scientifico Pty Ltd. http://www.grale.com.au </li></ul> Stampi: <ul><li> Staccarsi, stampi di plastica Grale scientifico </li></ul> Diapositive: <ul><li> SuperFrost PLUS Microscopio diapositive Lomb scientifico Pty Ltd. <a href="http://www.lomb.com.au/">http://www.lomb.com.au</a> </li></ul> Resina: <ul><li> GlycolMethacrylate Technovit 7100 Heraeus Kulzer <a href="http://www.kulzer-technik.de/168/Products/Histology/Technovit_7100.htm">http://www.kulzer-technik.de/168/Products/Histology/Technovit_7100.htm</a> </li><li> Backup blocco di resina Technovit 3040 blocco Histo Heraeus Kulzer </li></ul> Macchie (Reagenti da Grale scientifico) Goldner di colorazione tricromica </li> 1. Weigert ferro hemotoxylin (DeGroat) <table style="margin-left:40px;" border="0"><tr><td colspan="2" style="font-weight:bold;"> a) Hemotoxylin soluzione </td></tr><tr><td> Hemotoxylin </td><td> 1g </td></tr><tr><td> Alcol assoluto </td><td> 100 ml </td></tr><tr><td colspan="2" style="font-weight:bold;"> b) Soluzione di ferro </td></tr><tr><td> 30% acquosa di cloruro ferrico </td><td> 4 ml </td></tr><tr><td> Acido cloridrico (concentrato) </td><td> 1 ml </td></tr><tr><td> Acqua distillata </td><td> 95mL </td></tr></table> Filtrato e aggiunto al volume uguale di hemotoxylin immediatamente prima macchia utilizzato. 2. Ponceau-fucsina-azophloxin magazzino soluzioni <table style="margin-left:40px;" border="0"><tr><td colspan="2" style="font-weight:bold;"> a) Ponceau de xilidina soluzione </td></tr><tr><td> Ponceau de xilidina </td><td> 0,75 g </td></tr><tr><td> acido fuchsion </td><td> 0,25 g </td></tr><tr><td> Acido acetico </td><td> 1 ml </td></tr><tr><td colspan="2"> mescolare e aggiungere acqua distillata (100ml) </td></tr><tr><td colspan="2" style="font-weight:bold;"> b) azophloxin soluzione </td></tr><tr><td> Azophloxin </td><td> 0,5 g </td></tr><tr><td> L&#39;acido acetico </td><td> 0,6 ml </td></tr><tr><td colspan="2"> mescolare e aggiungere acqua distillata (100ml) </td></tr><tr><td colspan="2" style="font-weight:bold;"> c) Finale di lavoro soluzione macchia </td></tr><tr><td> Ponceau-fucsina soluzione </td><td> 5-10ml </td></tr><tr><td> Azophloxin </td><td> 2 ml </td></tr><tr><td> 0,2% soluzione di acido acetico </td><td> 88mL </td></tr></table> 3. Soluzione luce verde <table style="margin-left:40px;" border="0"><tr><td> Luce verde </td><td> 1g </td></tr><tr><td> acido acetico </td><td> 1 ml </td></tr><tr><td colspan="2"> Mescolare e aggiungere acqua distillata (500ml) </td></tr></table> 4. Phophomolybdic acido-Orange G soluzione <table style="margin-left:40px;" border="0"><tr><td> Fosfomolibdico acido </td><td> 3g </td></tr><tr><td> Arancio G </td><td> 2g </td></tr><tr><td colspan="2"> Sciogliere in 500 ml di acqua distillata e aggiungere timolo cristallo. </td></tr></table> Von Kossa Stain <table style="margin-left:40px;" border="0"><tr><td> 1% di nitrato d&#39;argento acquoso </td></tr><tr><td> Tiosolfato di sodio 2,5% </td></tr><tr><td> 1% safranina O </td></tr></table> Alcian macchia blu <table style="margin-left:40px;" border="0"><tr><td> Alcian blu 8GX </td><td> 1g </td></tr><tr><td> 3% di soluzione di acido acetico </td><td> 100 ml </td></tr></table> Hemotoxylin e eosina <table style="margin-left:40px;" border="0"><tr><td colspan="2" style="font-weight:bold;"> a) Harris hemotoxylin </td></tr><tr><td> Hemotoxylin </td><td> 2.5g </td></tr><tr><td> Alcol assoluto </td><td> 25mL </td></tr><tr><td> Allume di potassio </td><td> 50g </td></tr><tr><td> acqua distillata </td><td> 500mL </td></tr><tr><td> ossido di mercurio </td><td> 1.25g O </td></tr><tr><td> Iodato di sodio </td><td> 0,5 g </td></tr><tr><td> Acido acetico glaciale </td><td> 20 mL </td></tr><tr><td colspan="2" style="font-weight:bold;"> b) Eosina soluzione </td></tr><tr><td colspan="2"> Eosina prodotto commercialmente è stato utilizzato. </td></tr></table> Tutte le polveri colorante macchia sono Gurr polveri coloranti. Tutti i reagenti sono reattivi e non reattivi di laboratorio Fluorocromi <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0"><tr><td> Fabbricante </td><td> Fluorocromo </td><td> Numero di catalogo </td></tr><tr><td> Sigma-Aldrich, Sydney </td><td> Calceina verde </td><td> C0875 </td></tr><tr><td> Sigma-Aldrich, Sydney </td><td> Alizarina complessone </td><td> A3882 </td></tr><tr><td> Intervet Australia, Victoria </td><td> Ossitetraciclina (Fuori della droga scaffale antimicrobici) </td><td> Nome commerciale; Engemycin 100 </td></tr></table>

undecalcified bone preparation for histology, histomorphometry and fluorochrome analysis

Istologia ossea Undecalcified dimostra la micro-architettura del tessuto osseo. Esso mostra sia le componenti mineralizzata e cellulare di osso, che fornisce informazioni vitali sul turnover osseo o la formazione dell&#39;osso ed il riassorbimento. Ciò ha enorme importanza in una varietà di applicazioni cliniche e di ricerca. Si produce belle immagini 1 e consente di tecniche quali la valutazione fluorocromo e istomorfometria 2. Analisi fluorocromo è una tecnica in cui vengono iniettati coloranti fluorescenti che si legano al calcio in un punto particolare momento, che permette di quantificare la quantità di mineralizzazione in quel dato momento. Istomorfometria è un processo di quantificazione delle ossa a livello microscopico. Esecuzione di istologia undecalcified osso è tecnicamente impegnativo, soprattutto con esemplari di grandi dimensioni. Si richiede variazioni nella tecnica da quelli utilizzati in paraffina di serie incorporato istologia. Questo video illustra il processo di produzione di sezioni di buona qualità e dimostra le difficoltà tecniche e le modalità con le quali per il loro superamento. Preparazione dei campioni, fissazione e la lavorazione si ottengono con un modo simile a quello di altri tessuti molli, tuttavia a causa della densità e bassa permeabilità di osso molto più tempo di fissazione e tempi di lavorazione sono necessari, spesso prendendo diverse settimane. Incorporare si ottiene utilizzando un mezzo di supporto con durezza simili o uguali e la densità fino all&#39;osso come metacrilato, ma a differenza di infiltrazione di paraffina e l&#39;inclusione, questo è un passo irreversibile. Sezionamento può essere ottenuto dalla macinazione che produce una sezione più spessa, che è ottimale per gli studi, come l&#39;analisi fluorocromo. Questo è meglio realizzato utilizzando una lama di diamante su un macrotome. In alternativa, sezioni più sottili possono essere prodotti per la microscopia ottica e questo si ottiene utilizzando un microtomo slitta con una lama molto affilata. Il microtomo slitta fornisce la solidità e la stabilità necessaria per grandi blocchi duri. Resina sezioni incorporato può essere colorato con una varietà di macchie, di cui sia dimostrato.

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Undecalcified Bone Preparation for Histology, Histomorphometry and Fluorochrome Analysis

Istologia ossea Undecalcified fornisce importanti informazioni per una varietà di applicazioni cliniche e di ricerca. E &#39;tecnicamente impegnativo, soprattutto con esemplari di grandi dimensioni. Questo video illustra il processo di produzione di sezioni di buona qualità e dimostra le difficoltà tecniche e le modalità con le quali per il loro superamento.

Bone Preparazione Undecalcified per Istologia, Istomorfometria e analisi Fluorocromo

Undecalcified bone histology demonstrates the micro-architecture of bone. It shows both the mineralised and cellular components of bone, which provides ...

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Research

JoVE Journal

Biology

27.1K Views.  Monash University. Istologia ossea Undecalcified fornisce importanti informazioni per una varietà di applicazioni cliniche e di ricerca. E 'tecnicamente impegnativo, soprattutto con esemplari di grandi dimensioni. Questo video illustra il processo di produzione di sezioni di buona qualità e dimostra le difficoltà tecniche e le modalità con le quali per il loro superamento.

Video: Undecalcified Bone Preparation for Histology, Histomorphometry and Fluorochrome Analysis

The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell  electroporation system and Gene Pulser  electroporation buffer were specifically developed to transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells.This video demonstrates how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow, and then prepare them for electroporation in the MXcell system. We begin by isolating femur and tibia. Bone marrow from both femur and tibia are then harvested and cultures are established. Cultured bone marrow cells are then transfected and analyzed.

This procedure describes how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow and is followed by transfection using the Gene Pulser MXCell electroporation system.

La preparazione di colture primarie di cellule emopoietiche dal midollo osseo murino per elettroporazione

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

Ricerca

Biologia

A Neuronal and Astrocyte Co-Culture Assay for High Content Analysis of Neurotoxicity

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing measurement of multiple cellular phenotypes within a single assay. In this study, we utilized HCA to develop a novel assay for neurotoxicity. Neurotoxicity assessment represents an important part of drug safety evaluation, as well as being a significant focus of environmental protection efforts. Additionally, neurotoxicity is also a well-accepted in vitro marker of the development of neurodegenerative diseases such as Alzheimer's and Parkinson's diseases. Recently, the application of HCA to neuronal screening has been reported. By labeling neuronal cells with &beta;III-tubulin, HCA assays can provide high-throughput, non-subjective, quantitative measurements of parameters such as neuronal number, neurite count and neurite length, all of which can indicate neurotoxic effects. However, the role of astrocytes remains unexplored in these models. Astrocytes have an integral role in the maintenance of central nervous system (CNS) homeostasis, and are associated with both neuroprotection and neurodegradation when they are activated in response to toxic substances or disease states. GFAP is an intermediate filament protein expressed predominantly in the astrocytes of the CNS. Astrocytic activation (gliosis) leads to the upregulation of GFAP, commonly accompanied by astrocyte proliferation and hypertrophy. This process of reactive gliosis has been proposed as an early marker of damage to the nervous system. The traditional method for GFAP quantitation is by immunoassay. This approach is limited by an inability to provide information on cellular localization, morphology and cell number. We determined that HCA could be used to overcome these limitations and to simultaneously measure multiple features associated with gliosis - changes in GFAP expression, astrocyte hypertrophy, and astrocyte proliferation - within a single assay. In co-culture studies, astrocytes have been shown to protect neurons against several types of toxic insult and to critically influence neuronal survival. Recent studies have suggested that the use of astrocytes in an in vitro neurotoxicity test system may prove more relevant to human CNS structure and function than neuronal cells alone. Accordingly, we have developed an HCA assay for co-culture of neurons and astrocytes, comprised of protocols and validated, target-specific detection reagents for profiling &beta;III-tubulin and glial fibrillary acidic protein (GFAP). This assay enables simultaneous analysis of neurotoxicity, neurite outgrowth, gliosis, neuronal and astrocytic morphology and neuronal and astrocytic development in a wide variety of cellular models, representing a novel, non-subjective, high-throughput assay for neurotoxicity assessment. The assay holds great potential for enhanced detection of neurotoxicity and improved productivity in neuroscience research and drug discovery.

This article describes a novel protocol and reagent set designed for sensitive measurement of neurotoxic effects of compounds and treatments on co-cultures of neurons and astrocytes using high content analysis. Results demonstrate that high content analysis represents an exciting novel technology for neurotoxicity assessment.

Un neuronale e astrociti Co-Cultura Assay per l&#39;analisi dei contenuti elevati di neurotossicità

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing ...

RNA In situ Hybridization in Whole Mount Embryos and Cell Histology Adapted for Marine Elasmobranchs

Marine elasmobranchs are valued animal models for biomedical and genomic studies as they are the most primitive vertebrates to have adaptive immunity and have unique mechanisms for osmoregulation 1-3. As the most primitive living jawed-vertebrates with paired appendages, elasmobranchs are an evolutionarily important model, especially for studies in evolution and development. Marine elasmobranchs have also been used to study aquatic toxicology and stress physiology in relationship to climate change 4. Thus, development and adaptation of methodologies is needed to facilitate and expand the use of these primitive vertebrates to multiple biological disciplines. Here I present the successful adaptation of RNA whole mount in situ hybridization and histological techniques to study gene expression and cell histology in elasmobranchs.
Monitoring gene expression is a hallmark tool of developmental biologists, and is widely used to investigate developmental processes 5. RNA whole mount in situ hybridization allows for the visualization and localization of specific gene transcripts in tissues of the developing embryo. The expression pattern of a gene's message can provide insight into what developmental processes and cell fate decisions a gene may control. By comparing the expression pattern of a gene at different developmental stages, insight can be gained into how the role of a gene changes during development.
While whole mount in situ's provides a means to localize gene expression to tissue, histological techniques allow for the identification of differentiated cell types and tissues. Histological stains have varied functions. General stains are used to highlight cell morphology, for example hematoxylin and eosin for general staining of nuclei and cytoplasm, respectively. Other stains can highlight specific cell types. For example, the alcian blue stain reported in this paper is a widely used cationic stain to identify mucosaccharides. Staining of the digestive tract with alcian blue can identify the distribution of goblet cells that produce mucosaccharides. Variations in mucosaccharide constituents on short peptides distinguish goblet cells by function within the digestive tract 6. By using RNA whole mount in situ's and histochemical methods concurrently, cell fate decisions can be linked to gene-specific expression.
Although RNA in situ's and histochemistry are widely used by researchers, their adaptation and use in marine elasmobranchs have met limited and varied success. Here I present protocols developed for elasmobranchs and used on a regular basis in my laboratory. Although further modification of the RNA in situ's hybridization method may be needed to adapt to different species, the protocols described here provide a strong starting point for researchers wanting to adapt the use of marine elasmobranchs to their scientific inquiries.

RNA In situ Hybridization in Whole Mount Embryos and Cell Histology Adapted for Marine Elasmobranchs

By combining methods for RNA whole mount in situ hybridization and histology, gene expression can be linked with cell fate decisions in the developing embryo. These methods have been adapted to marine elasmobranchs and facilitate the use of these animals as model organisms for biomedical, toxicology and comparative studies.

RNA<em&gt; In situ</emIbridazione&gt; in embrioni Mount interi e istologia Adattato per Elasmobranchi Marine

Marine  elasmobranchs are valued animal models for biomedical and genomic studies as  they are the most primitive vertebrates to have adaptive immunity ...

Bone Conditioned Medium: Preparation and Bioassay

Autologous bone grafts are widely used in oral and maxillofacial surgery, orthopedics, and traumatology. Autologous bone grafts not only replace missing bone, they also support the complex process of bone regeneration. This favorable behavior of autografts is attributed to the three characteristics: osteoconductivity, osteogenicity, and osteoinductivity. However, there is another aspect: Bone grafts release a myriad of molecules, including growth factors, which can target mesenchymal cells involved in bone regeneration. The paracrine properties of bone grafts can be studied in vitro by the use of bone-conditioned medium (BCM). Here we present a protocol on how to prepare bone-conditioned medium from native pig cortical bone, and bone that underwent thermal processing or demineralization. Cells can be directly exposed to BCM or seeded onto biomaterials, such as collagen membranes, previously soaked with BCM. We give examples for in vitro bioassays with mesenchymal cells on the expression of TGF-&#946; regulated genes. The presented protocols should encourage to further reveal the paracrine effects of bone grafts during bone regeneration and open a path for translational research in the broad field of reconstructive surgery.

We describe here how to prepare bone-conditioned medium (BCM) and test its activity in vitro.

Bone mezzo condizionato: Preparazione e Bioassay

Autologous bone grafts are widely used in oral and maxillofacial surgery, orthopedics, and traumatology. Autologous bone grafts not only replace missing ...

Sample Preparation for Mass Cytometry Analysis

Mass cytometry utilizes antibodies conjugated with heavy metal labels, an approach that has greatly increased the number of parameters and opportunities for deep analysis well beyond what is possible with conventional fluorescence-based flow cytometry. As with any new technology, there are critical steps that help ensure the reliable generation of high-quality data. Presented here is an optimized protocol that incorporates multiple techniques for the processing of cell samples for mass cytometry analysis. The methods described here will help the user avoid common pitfalls and achieve consistent results by minimizing variability, which can lead to inaccurate data. To inform experimental design, the rationale behind optional or alternative steps in the protocol and their efficacy in uncovering new findings in the biology of the system being investigated is covered. Lastly, representative data is presented to illustrate expected results from the techniques presented here.

This article describes the collection and processing of samples for mass cytometry analysis.

Preparazione del campione per l&#39;analisi di massa Citometria

Mass cytometry utilizes antibodies conjugated with heavy metal labels, an approach that has greatly increased the number of parameters and opportunities ...

An Improved Chemotaxis Assay for the Rapid Identification of Rhizobacterial Chemoattractants in Root Exudates

Chemotaxis identification is very important for the research and application of rhizosphere growth-promoting bacteria. We established a straightforward method to quickly identify the chemoattractants that could induce the chemotactic movement of rhizosphere growth-promoting bacteria on sterile glass slides via simple steps. Bacteria solution (OD600 = 0.5) and sterile chemoattractant aqueous solution were added dropwise on the glass slide at an interval of 1 cm. An inoculating loop was used to connect the chemoattractant aqueous solution to the bacterial solution. The slide was kept at room temperature for 20 min on the clean bench. Finally, the chemoattractant aqueous solution was collected for bacterial counting and microscopic observation. In this study, through multiple comparisons of experimental results, the method overcame multiple shortcomings of traditional bacterial chemotaxis methods. The method reduced the error of plate counting and shortened the experimental cycle. For the identification of chemoattractant substances, this new method can save 2-3 days compared to the traditional method. Additionally, this method allows any researcher to systematically complete a bacterial chemotaxis experiment within 1-2 days. The protocol can be considered a valuable resource for understanding plant-microbe interactions.

Here, we present an improved chemotaxis assay protocol. The goal of this protocol is to reduce the steps and costs of traditional bacterial chemotaxis methods and to serve as a valuable resource for understanding plant-microbe interactions.

Un test di chemiotassi migliorato per la rapida identificazione dei chemioattrattivi rizobatterici negli essudati radicali

Chemotaxis identification is very important for the research and application of rhizosphere growth-promoting bacteria. We established a straightforward ...

Impianti di cartilagine artificiale per la rigenerazione ossea tramite ossificazione endocondrale

Integrated Bone Formation Through In Vivo Endochondral Ossification Using Mesenchymal Stem Cells

Conventional bone regeneration therapy using mesenchymal stem cells (MSCs) is difficult to apply to bone defects larger than the critical size because it does not have a mechanism to induce angiogenesis. Implanting artificial cartilage tissue fabricated from MSCs induces angiogenesis and bone formation in vivo via endochondral ossification (ECO). Therefore, this ECO-mediated approach may be a promising bone regeneration therapy in the future. An important aspect of the clinical application of this ECO-mediated approach is establishing a protocol for preparing enough cartilage to be implanted to repair the bone defect. It is especially not practical to design a single mass of grafted cartilage of a size that conforms to the shape of the actual bone defect. Therefore, the cartilage to be transplanted must have the property of forming bone integrally when multiple pieces are implanted. Hydrogels may be an attractive tool for scaling up tissue-engineered grafts for endochondral ossification to meet clinical requirements. Although many naturally derived hydrogels support MSC cartilage formation in vitro and ECO in vivo, the optimal scaffold material to meet the needs of clinical applications has yet to be determined. Hyaluronic acid (HA) is a crucial component of the cartilage extracellular matrix and is a biodegradable and biocompatible polysaccharide. Here, we show that HA hydrogels have excellent properties to support in vitro differentiation of MSC-based cartilage tissue and promote endochondral bone formation in vivo.

Autore in primo piano: Migliorare la rigenerazione ossea con l'integrazione della cartilagine artificiale vascolarizzata 

Bone therapy via endochondral ossification by implanting artificial cartilage tissue produced from mesenchymal stem cells has the potential to circumvent the drawbacks of conventional therapies. Hyaluronic acid hydrogels are effective in scaling up uniformly differentiated cartilage grafts as well as creating integrated bone with vascularization between fused grafts in vivo.

Formazione ossea integrata attraverso l'ossificazione endocondrale in vivo utilizzando cellule staminali mesenchimali

Conventional bone regeneration therapy using mesenchymal stem cells (MSCs) is difficult to apply to bone defects larger than the critical size because it ...

Preparazione del campione di alta qualità per l'analisi genomica Multiome 10X

High-Quality Brain and Bone Marrow Nuclei Preparation for Single Nuclei Multiome Assays

Single-cell analysis has become the approach of choice for unraveling the complexity of biological processes that require assessing the variability of individual cellular responses to treatment or infection with single-cell resolution. 
Many techniques for single-cell molecular profiling have been developed over the past 10 years, and several dedicated technologies have been commercialized. The 10X Genomics droplet-based single-cell profiling is a widespread technology that offers ready-to-use reagents for transcriptomic and multi-omic single-cell profiling. The technology includes workflows for single-cell and single-nuclei RNA sequencing (scRNA-Seq and snRNA-Seq, respectively), scATAC-Seq, single-cell immune profiling (BCR/TCR sequencing), and multiome. The latter combines transcriptional (scRNA-Seq) and epigenetic information (scATAC-Seq) coming from the same cell. 
The quality (viability, integrity, purity) of single-cell or single-nuclei suspensions isolated from tissues and analyzed by any of these approaches is critical for generating high-quality data. Therefore, the sample preparation protocols should be adapted to the particularities of each biological tissue and ensure the generation of high-quality cell and nuclei suspensions.
This article describes two protocols for preparing brain and bone marrow samples for the downstream multiome 10X Genomics pipeline. The protocols are performed stepwise and cover tissue dissociation, cell sorting, nuclei isolation, and quality control of prepared nuclei suspension that is used as starting material for cell partitioning and barcoding, library preparation, and sequencing. These standardized protocols produce high-quality nuclei libraries and robust and reliable data.

Autore in primo piano: Far progredire la ricerca biomedica attraverso l'analisi di singole cellule 

The success of single-cell/single-nuclei transcriptomics and multi-omics largely depends on the quality of cells/nuclei. Therefore, isolating cells/nuclei from tissue and their purification must be highly standardized. This protocol describes the preparation of nuclei from the brain and bone marrow for downstream single-nuclei multiome assay.

Preparazione di nuclei cerebrali e del midollo osseo di alta qualità per saggi multiomi a nucleo singolo

Single-cell analysis has become the approach of choice for unraveling the complexity of biological processes that require assessing the variability of ...