نشكر الدكتورة جنيفر Emtage لقراءة نقدية للمخطوطة، ريان جيل للحصول على المساعدة الفنية والمساعدة في رعاية الزرد والدكتور ستيفن C. Ekker (مايو كلينيك، Rochster، مينيسوتا) للمواد. وقد تم دعم عملنا معبد كلية جامعة العلوم والتكنولوجيا والمعاهد الوطنية للصحة (R01-HD061749).

1. إنتاج الجيل F0 من قبل Microinjection من فخ الجينات. لقد وجدنا أن الأجنة من خلفيات وراثية مختلفة التحمل عرض مختلفة لهذا الإجراء، مع مقرها الحيوانات الأليفة متجر من النوع البري وتوبنجن - طويل القوائم المالية (TLF) كونها الأكثر تسامحا في حين AB وتوبنغن سلالات لها البقاء على قيد الحياة أكثر فقرا. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد الحمض النووي ينقول. إعداد GBT-B1 (pDB783، Balciuniene آخرون قيد الإعداد) DNA البلازميد باستخدام معيار عدة QIAprep miniprep (في Qiagen 27106). فمن الضروري أن تشمل الخطوة غسل PB (وهو اختياري في الإجراء QIAprep)، وإلا سوف تكون ملوثة عن طريق الحمض النووي miniprep ريبونوكلياز A، مما أدى إلى تدهور مرنا transposase. قبل الحقن، ويخفف من الحمض النووي في ريبونوكلياز خالية من المياه (AMBION AM9937) إلى 10 نانوغرام / ميكرولتر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد transposase مرنا. خطي pT3TS/Tol2 (pDB600) 13 باستخدام XbaI وتدوين الحمض النووي خطي باستخدام آلة mMessage T3(AMBION AM1348) في المختبر عدة النسخ. قمنا بتعديل رد فعل النسخ في المختبر عن طريق إضافة 0.5 ميكرولتر من RiboLock ريبونوكلياز المانع (ThermoFisher Fermentas EO0381). بعد خطوة الدناز العلاج، وتنقية مرنا باستخدام عدة RNeasy MinElute (في Qiagen 74204). تقييم نوعية في المختبر مرنا كتب بواسطة الاغاروز الكهربائي للهلام. تمييع مرنا في ريبونوكلياز خالية من المياه إلى 40 نانوغرام / ميكرولتر، والمخزن كما مأخوذة 2 ميكرولتر في -80 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد مزيج حقن مكروي. قبل الحقن، إضافة 8 ميكرولتر من الحمض النووي ينقول المخفف للقسامة 2 ميكرولتر من transposase مرنا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حقن مكروي. ضخ 3 NL من خليط الحمض النووي / الحمض النووي الريبي في صفار البيض من 1 الأجنة الزرد الخلية باستخدام تقنيات Microinjection القياسية، وتهدف للواجهة صفار / قسيم أرومي. جمع الأجنة كل 20 دقيقة لضمان حقن في 1 مرحلة الخلية. في تجربتنا، يمكن للشخص ماهرا حقن بسهولة 1،000 الأجنة في 1-1.5 ساعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد الحقن، وتشغيل 5 ميكرولتر من اليسارأكثر من حل الحقن على 1٪ هلام الاغاروز لمراقبة الجودة، لضمان أن تكون مرنا transposase لم تتحلل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حقن الرعاية الجنين. في وقت متأخر بعد الظهر، وإزالة الأجنة غير مخصبة وغير طبيعي وتوزيع الأجنة إلى 60-80 لكل 100 ملم طبق بيتري. تتم إزالة الأجنة غير الطبيعية والميتة في 1 يوم آخر الإخصاب (DPF)، 2 و 3 DPF DPF. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الكشف عن GFP التعبير. الأجنة الشاشة من دون عيوب العلني لمضان GFP في 3 DPF (الشكل 3). ويمكن أن يتم الفرز إما على stereomicroscope مجهزة مضان (نستخدم نيكون SMZ1500) أو على مجهر تستقيم (نستخدم زايس AxioImager مع الهدف 5X Fluar). انخفاض التعبير GFP يدل إما حقن فاشلة أو تدهور transposase RNA بسبب التلوث ريبونوكلياز (الشكل 3A). حدد حوالي 30٪ من ألمع الأجنة التي إما GFP التعبير في أنسجة متعددة أو في نسبة عالية من الخلايا من الأنسجة محددة (قارن Figures 3B و 3C). من حقنة من 1،000 الأجنة، لدينا عادة ما يصل الى 100 تنمويا المعتاد،،، معربا عن GFP عالية الأجنة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> رفع الأجنة F0 المحدد باستخدام إجراءات الزرد تربية القياسية. فمن المعقول أن نتوقع أن 20-30٪ من الأجنة حقن المختارة للتربية والبقاء على قيد الحياة إلى سن البلوغ. </li></ol> 2. صيانة UAS: mRFP تستر الخط. ونحن قد ولدت 14xUAS: خط mRFP تميزت γCry عدسة محددة: GFP. منذ UAS يخضع لإسكات من خلال الحامض النووي، فمن المهم لتحديد السمك مع مستويات منخفضة من إسكات لنشر سهم. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد UAS الفردية: أصحاب الزيجوت المتماثلة الألائل mRFP عن التزاوج مع واحدة من الأكثر موثوقية GAL4 خطوط فخ الجينات لدينا، tpl6 جبهة الخلاص الوطني (Balciuniene آخرون في إعداد). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في اليوم التالي، ونقل UAS: الأسماك mRFP الذي أعطى الأجنة إلى خزانات ثابتة الفردية، في حين يتم جمع الأجنةوتنظيفها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الأجنة الشاشة لGFP ومضان RFP في 1 و 3 DPF DPF. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الأسماك تزاوج الأقارب الذي أعطى الأجنة مع ارتفاع التعبير mRFP لإنشاء الجيل القادم من UAS: خط mRFP. </li></ol> 3. فحص الأسماك F0. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عبور F0 الفردية مع UAS متماثل: الأسماك mRFP (الشكل 4). نحن عادة حقن GBTs لدينا في خطوط مع البرية من نوع ليوبارد أو تصبغ أنماط، وUAS متماثل لدينا: خط mRFP في الخلفية النحاس. وبالتالي يمكن GBT حقن الأسماك F0 تمييزها بسهولة من UAS: الأسماك mRFP، مما يلغي الحاجة لتسجيل ما إذا كان يجري فحص F0 كان ذكرا أم أنثى، وكذلك الأخطاء المحتملة الناتجة عن أخطاء في تسجيل و / أو تحديد جنس كل الأسماك. لذا أفراد لديهم خبرة محدودة جدا، مثل لنا طلاب المرحلة الجامعية، قادرين على إعداد وكسر التزاوج الأسماك. هذا النهج لديه عيب أن اثنين من خلفيات وراثية مختلفةتستخدم، ويحتمل أن تعقيد تفسير الظواهر فقدان الوظيفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في اليوم التالي، وعودة UAS النحاس: الأسماك mRFP لدبابتهم. وضع الأسماك F0 الذي أعطى الأجنة في خزانات ثابتة الفردية (نستخدم هاغن إكسو تيرا Faunarium الصغيرة، ولكن أي دبابة صغيرة يمكن استخدامها لهذا الغرض)، في حين يتم جمع الأجنة وفرزهم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ونقل الأجنة نظيفة جمعها في أطباق بتري جديدة (&lt;100 في الطبق) في فترة ما بعد الظهر من اليوم 0. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الأجنة الشاشة لGFP ومضان RFP في 1 DPF، 2 و 3 DPF DPF. سحب الأجنة إيجابية لكلا GFP وطلب تقديم العروض بها، فرزها حسب GFP / نمط التعبير طلب تقديم العروض (إذا لوحظ نمط أكثر من واحد في مخلب) ورفعها إلى إنشاء جيل F1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الموت ببطء الأسماك F0 التي أنتجت أجنة السلبية فقط (من أصل العدد الإجمالي للأجنة 50-100). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عبور الأسماك F0 التي أنتجت GFP / RFP-الإيجابية ذرية مرة أخرى للحصول على الدفعة الثانية من ايجابيات. </li></ol> 4.فحص الأسماك F1. يتم فحص الأسماك F1 F2 لإقامة العائلات، لتوثيق نمط التعبير الجيني وفخ تجميد دفعات من الأجنة لتحديد الجينات الجزيئية من فخ مواضع بنسبة 5 &#39;RACE والعكسية PCR. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عبور الأسماك F1 الفردية مع UAS متماثل: الأسماك mRFP (الشكل 4). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اليوم التالي، ضع السمك F1 التي أعطت أجنة في خزانات ثابتة الفردية في حين يتم جمع الأجنة وفرزهم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الأجنة الشاشة لGFP ومضان RFP في 1 DPF، 2 و 3 DPF DPF. الأجنة منفصلة وصورة إيجابية لكلا GFP وطلب تقديم العروض 24. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في 5 DPF، وتجميد دفعات من 20 GFP / RFP-الإيجابية و20 GFP / RFP الأجنة السلبية لتحديد الجينات المتحولة insertionally بواسطة العكسية PCR و 5 &#39;RACE 9،10. رفع المتبقية GFP / الأجنة طلب تقديم العروض الايجابية لتأسيس الجيل F2. </li></ol>

<ol>
	<li>Balciunas, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancer+trapping+in+zebrafish+using+the+Sleeping+Beauty+transposon.">Enhancer trapping in zebrafish using the Sleeping Beauty transposon.</a> BMC Genomics. 5 (1), 62 (2004).</li><li>Trinh le, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+versatile+gene+trap+to+visualize+and+interrogate+the+function+of+the+vertebrate+proteome.">A versatile gene trap to visualize and interrogate the function of the vertebrate proteome.</a> Genes Dev. 25 (21), 2306-2320 (2011).</li><li>Kawakami, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+transposon-mediated+gene+trap+approach+identifies+developmentally+regulated+genes+in+zebrafish.">A transposon-mediated gene trap approach identifies developmentally regulated genes in zebrafish.</a> Dev Cell. 7 (1), 133-144 (2004).</li><li>Emelyanov, A., Parinov, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mifepristone-inducible+LexPR+system+to+drive+and+control+gene+expression+in+transgenic+zebrafish.">Mifepristone-inducible LexPR system to drive and control gene expression in transgenic zebrafish.</a> Dev Biol. 320 (1), 113-121 (2008).</li><li>Ellingsen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+enhancer+detection+in+the+zebrafish+genome.">Large-scale enhancer detection in the zebrafish genome.</a> Development. 132 (17), 3799-3811 (2005).</li><li>Distel, M., Wullimann, M. F., Koster, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+Gal4+genetics+for+permanent+gene+expression+mapping+in+zebrafish.">Optimized Gal4 genetics for permanent gene expression mapping in zebrafish.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (32), 13365-13370 (2009).</li><li>Davison, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transactivation+from+Gal4-VP16+transgenic+insertions+for+tissue-specific+cell+labeling+and+ablation+in+zebrafish.">Transactivation from Gal4-VP16 transgenic insertions for tissue-specific cell labeling and ablation in zebrafish.</a> Dev Biol. 304 (2), 811-824 (2007).</li><li>Sivasubbu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene-breaking+transposon+mutagenesis+reveals+an+essential+role+for+histone+H2afza+in+zebrafish+larval+development.">Gene-breaking transposon mutagenesis reveals an essential role for histone H2afza in zebrafish larval development.</a> Mech Dev. 123 (7), 513-529 (2006).</li><li>Clark, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+protein+trapping+produces+a+functional+expression+codex+of+the+vertebrate+proteome.">In vivo protein trapping produces a functional expression codex of the vertebrate proteome.</a> Nat Methods. 8 (6), 506-512 (2011).</li><li>Petzold, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nicotine+response+genetics+in+the+zebrafish.">Nicotine response genetics in the zebrafish.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (44), 18662-18667 (2009).</li><li>Gaiano, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insertional+mutagenesis+and+rapid+cloning+of+essential+genes+in+zebrafish.">Insertional mutagenesis and rapid cloning of essential genes in zebrafish.</a> Nature. 383 (6603), 829-832 (1996).</li><li>Amsterdam, A., Hopkins, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutagenesis+strategies+in+zebrafish+for+identifying+genes+involved+in+development+and+disease.">Mutagenesis strategies in zebrafish for identifying genes involved in development and disease.</a> Trends Genet. 22 (9), 473-478 (2006).</li><li>Balciunas, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Harnessing+a+high+cargo-capacity+transposon+for+genetic+applications+in+vertebrates.">Harnessing a high cargo-capacity transposon for genetic applications in vertebrates.</a> PLoS Genet. 2 (11), e169 (2006).</li><li>Urasaki, A., Morvan, G., Kawakami, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+dissection+of+the+Tol2+transposable+element+identified+the+minimal+cis-sequence+and+a+highly+repetitive+sequence+in+the+subterminal+region+essential+for+transposition.">Functional dissection of the Tol2 transposable element identified the minimal cis-sequence and a highly repetitive sequence in the subterminal region essential for transposition.</a> Genetics. 174 (2), 639-649 (2006).</li><li>Haffter, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+identification+of+genes+with+unique+and+essential+functions+in+the+development+of+the+zebrafish,+Danio+rerio.">The identification of genes with unique and essential functions in the development of the zebrafish, Danio rerio.</a> Development. 123, 1-36 (1996).</li><li>Amsterdam, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+315+genes+essential+for+early+zebrafish+development.">Identification of 315 genes essential for early zebrafish development.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (35), 12792-12797 (2004).</li><li>Scheer, N., Campos-Ortega, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+the+Gal4-UAS+technique+for+targeted+gene+expression+in+the+zebrafish.">Use of the Gal4-UAS technique for targeted gene expression in the zebrafish.</a> Mech Dev. 80 (2), 153-158 (1999).</li><li>Koster, R. W., Fraser, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracing+transgene+expression+in+living+zebrafish+embryos.">Tracing transgene expression in living zebrafish embryos.</a> Dev Biol. 233 (2), 329-346 (2001).</li><li>Rouet, P., Smih, F., Jasin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Introduction+of+double-strand+breaks+into+the+genome+of+mouse+cells+by+expression+of+a+rare-cutting+endonuclease.">Introduction of double-strand breaks into the genome of mouse cells by expression of a rare-cutting endonuclease.</a> Mol Cell Biol. 14 (12), 8096-8106 (1994).</li><li>Thermes, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=I-SceI+meganuclease+mediates+highly+efficient+transgenesis+in+fish.">I-SceI meganuclease mediates highly efficient transgenesis in fish.</a> Mech Dev. 118 (1-2), 91-98 (2002).</li><li>Lisby, M., Mortensen, U. H., Rothstein, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colocalization+of+multiple+DNA+double-strand+breaks+at+a+single+Rad52+repair+centre.">Colocalization of multiple DNA double-strand breaks at a single Rad52 repair centre.</a> Nat Cell Biol. 5 (6), 572-577 (2003).</li><li>Bennardo, N., Cheng, A., Huang, N., Stark, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative-NHEJ+is+a+mechanistically+distinct+pathway+of+mammalian+chromosome+break+repair.">Alternative-NHEJ is a mechanistically distinct pathway of mammalian chromosome break repair.</a> PLoS Genet. 4 (6), e1000110 (2008).</li><li>Rehn, K., Wong, K. S., Balciunas, D., Sumanas, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+enhancer+trap+line+recapitulates+embryonic+aquaporin+1a+expression+pattern+in+vascular+endothelial+cells.">Zebrafish enhancer trap line recapitulates embryonic aquaporin 1a expression pattern in vascular endothelial cells.</a> Int J Dev Biol. 55 (6), 613-618 (2011).</li><li>Petzold, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SCORE+imaging:+specimen+in+a+corrected+optical+rotational+enclosure.">SCORE imaging: specimen in a corrected optical rotational enclosure.</a> Zebrafish. 7 (2), 149-154 (2010).</li><li>Akitake, C. M., Macurak, M., Halpern, M. E., Goll, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenerational+analysis+of+transcriptional+silencing+in+zebrafish.">Transgenerational analysis of transcriptional silencing in zebrafish.</a> Dev Biol. 352 (2), 191-201 (2011).</li><li>Boniface, E. J., Lu, J., Victoroff, T., Zhu, M., Chen, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FlEx-based+transgenic+reporter+lines+for+visualization+of+Cre+and+Flp+activity+in+live+zebrafish.">FlEx-based transgenic reporter lines for visualization of Cre and Flp activity in live zebrafish.</a> Genesis. 47 (7), 484-491 (2009).</li><li>Skarnes, W. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+public+gene+trap+resource+for+mouse+functional+genomics.">A public gene trap resource for mouse functional genomics.</a> Nat Genet. 36 (6), 543-544 (2004).</li><li>Davidson, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+gene+delivery+and+gene+expression+in+zebrafish+using+the+Sleeping+Beauty+transposon.">Efficient gene delivery and gene expression in zebrafish using the Sleeping Beauty transposon.</a> Dev Biol. 263 (2), 191-202 (2003).</li></ol>

هؤلاء الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

ويجري بالفعل استخدام ناقلات فخ الجينات والمنهجية الموضحة هنا في عدة مختبرات مستقلة. في تجربتنا، وهناك نوعان من الخطوات الحاسمة في هذه العملية. الخطوة الحاسمة الأولى لتحقيق معدلات عالية من فخ الجينات في الأجنة التكامل F0 حقن. يمكن في كثير من الأحيان أن يعزى الفشل في هذه الخطوة إلى تلوث ريبونوكلياز من الكواشف الحقن، وخاصة الحمض النووي miniprep. بل هو أيضا مهم جدا لحقن الأجنة في مرحلة 1 خلية لفخ الجين التجارب. في تجربتنا، ونقل الجينات Tol2 بوساطة فعالة جدا، مما يجعل من الممكن الحصول على خطوط المعدلة وراثيا حتى عندما حقن في وقت لاحق من المرحلة 1 الخلية أو الحمض النووي مع أقل جودة. الحقن هي دون المستوى المطلوب أكثر تعقيدا من ذلك بكثير عند إجراء فخ الجينات الطفرات، لأن سوى جزء صغير من التكامل ناقلات يؤدي إلى الأحداث فعالة فخ الجينات. الخطوة الحاسمة الثانية هي للتأكد من فخ الأحداث الجين عن طريق عبور لدينا UAS: خط mRFP. غياب mRFP التعبيردائما تقريبا مما يشير إلى حدوث الحدث فخ محسن. ومع ذلك، وأحيانا عدم وجود mRFP التعبير قد يشير إلى إسكات UAS 14X. ولذا فمن المهم للحفاظ على UAS: خط mRFP في حالة غير أسكتهما نشر الجيل المقبل باستخدام الأفراد مع طلب تقديم العروض عالية التعبير عندما عبرت لtpl6 جبهة الخلاص الوطني. يمكننا أن نتوقع اتخاذ العديد من التحسينات لدينا فخ الجين ناقلات والبروتوكول. الأول هو استخدام UAS أقل تكرارا في فخ الجينات بناء. فقد تبين أن 5X UAS كافية لتحقيق التفعيل الكامل في تجارب زراعة الخلايا، والتي متواليات UAS أقل تكرارا هي أقل عرضة للمثيلة وإسكات 6،25. قد يكون من الممكن أيضا لتصميم مصيدة الجين ناقلات للالطفرات مشروطة تماما، تشبيها له النواقل المستخدمة من قبل الماوس الدولي فخ الجين كونسورتيوم مؤخرا وتكييفها لالزرد 2،26،27. سوف تحسن آخر يتمثل في استخدام ر مختلفةنظام ransposon، على سبيل المثال الجمال النائم 28، لتوليد UAS: mRFP خط مراسل. وهذا من شأنه تمكين حقن الجينات الفخاخ مقرها Tol2 مباشرة في خط مراسل والفرز من قبل F0s incrossing. وعلاوة على ذلك، فإن هذا القضاء على استخدام اثنين من خلفيات وراثية مختلفة، مما يجعل تفسير الظواهر فقدان وظيفة أكثر وضوحا. حتى مع هذه التحسينات، فإن العام GAL4 فخ الجين بروتوكول المعروضة هنا لا تزال مطبقة تطبيقا كاملا.

وقد ثبت الطفرات إقحامي ليكون نهجا قوية لتشريح وظيفة الجين في نظم نموذج مختلف الكائنات وحيدة الخلية مثل من البكتيريا والخميرة لالكائنات متعددة الخلايا مثل الفئران والنباتات. أي DNA الخارجية (فيروس، أو ينقول البلازميد) قد تكون بمثابة المغير عن طريق قطع عناصر أساسية من الجينات مثل الإكسونات أو المروجين. الهدف الفعال لهذه النهج بسيطة صغيرة جدا في الجينوم مجمع كبير، منذ تشكل الإكسونات 1-3٪ فقط من الفقاريات الجينوم نموذجية. فعالة صغيرة الحجم المستهدف يمكن التغلب عليها بنسب التكامل ناقلات عالية جدا، كما يتضح من النجاح الهائل من الطفرات إقحامي فيروسات في الزرد 11،12. في المقابل، تشكل الإنترونات حوالي 20-30٪ من الجينوم الفقارية. في الزرد، القائم على ناقلات ينقول الطفرات إقحامي الذي يعرض بشكل فعال فارغة أو الطفرات hypomorphic شديدة على الاندماج في الإنترونات وتمت تسمية &quot;الجين كسر transposoنانوثانية &quot;(GBTs) 8-10. للكفاءة التكامل فخ الجين، فإنها تستخدم الحد الأدنى من Tol2 ينقول 13،14. مسبب للطفرات الجينية من GBTs تعتمد على المشتقة من الأسماك لصق متقبل والنسخي تسلسل إنهاء / تذييل بعديد الأدينيلات. ويحيط العناصر المسؤولة عن طفرات GBT من مواقع loxP المباشر لاستئصال من قبل لجنة المساواة العرقية recombinase. وهكذا، حقن مرنا لجنة المساواة العرقية يؤدي إلى الارتداد كفاءة الطفرات المستحثة GBT، على الرغم من بعض متواليات ينقول تبقى في موضع التكامل 9،10. ناقلات GBT نشرت مؤخرا استخدام mRFP كما في فخ الجين مراسل 9،10، مما يؤدي إلى اثنين من أوجه القصور المحتملة. الأولى، فإنه لا يعرف ما جزء من الجينات الزرد يتم التعبير على مستوى عال بما فيه الكفاية ليتم الكشف عن طريق الاتصال المباشر الفلورسنت البروتينات مراسل الانصهار. الثانية، ومن المتوقع أن يكون لها وظائف أساسية فقط مجموعة فرعية صغيرة من الجينات. وتشير التقديرات إلى أن هناك فقط 1،400-2،400 الجينات اللازمة لdevelopme الزردالإقليم الشمالي 15،16. وليس من المتوقع لعرض الظواهر العلني، وبالتالي سيكون لها فائدة محدودة معظم فخ الجين المسوخ. للتغلب على هذه القيود اثنين، ونحن قد عدلت GBT-R15 9،10 للاستخدام مع GAL4-VP16 كما مراسل فخ الجين الأساسي (Balciuniene آخرون قيد الإعداد). كما هو الحال مع AUG-أقل mRFP في GBT-R15، تمت إزالة الموقع بداية الترجمة من GAL4-VP16. للكشف المباشر للأحداث فخ الجينات، ناقلات لدينا تحتوي على مراسل EGFP تحت سيطرة 14X GAL4 UAS 17،18. صممت العديد من الميزات الإضافية لدينا في ثنائية فخ الجين ناقلات. وUAS: ويحيط EGFP الكاسيت من مواقع FRT المباشر (الاقتباس الرمادي في الشكل 1). حقن FLP recombinase مرنا يؤدي إلى استئصال UAS: EGFP الكاسيت، وترك تحور الجين فخ يشبها EGFP مضان. ويمكن عندئذ أن تستخدم في خطوط المعدلة وراثيا والتي بمناسبة أنسجة معينة أو أحداث التنموية التي كتبها GFP مضان. كما هو الحال في غيرهاGBTs، ويحيط كله فخ الجين الكاسيت من مواقع loxP المباشر (خماسي مفتوحة في الشكل 1). وهذا يجعل الأحداث فخ الجين عكسها من خلال التعبير عن لجنة المساواة العرقية recombinase، وإنشاء بسهولة إثبات العلاقة السببية بين فخ الجين التكامل محددة، ولاحظ النمط الظاهري (الشكل 2). أخيرا، ويحيط فخ الجين الكاسيت من مواقع meganuclease I-SCEI مقلوب (مثلثات سوداء في الشكل 1). في ذبابة الفاكهة، وغالبا ما يتم تحويلها إلى التكامل ينقول الحذف (القصور) من خلال الاستئصال غير دقيقة من العنصر P. لا يوجد أي دليل على أن الختان من Tol2 ينقول (أو أي ينقول الأخرى العاملة في الفقاريات مثل الجمال النائم، PiggyBac أو التيار المتردد / التاءات) يمكن أن يؤدي إلى الحذف. لذا أدرجنا مواقع I-SCEI كوسيلة بديلة محتملة للتحريض والحذف، على الرغم من أنه لا يوجد دليل على أن SCEI I-يمكن أن تحدث الحذف في الزرد. تجدر الإشارة إلى أنه في حين أن SCEI I-الضخمةيمكن استخدامها لتسهيل نقل الجينات نوكلياز في الزرد، ويستخدم الانقسام الحمض النووي عن طريق I-SCEI meganuclease لدراسة آليات إصلاح الحمض النووي، بما في ذلك نهاية غير المتجانسة الانضمام عرضة للخطأ، في الخميرة وخلايا الثدييات 19-22. التكامل لدينا فخ الجين ناقلات يمكن أن يؤدي إلى EGFP التعبير من خلال آليتين مختلفتين. الأول هو صحيح فخ الجين الحدث (الشكل 1C): ناقلات يدمج الجين (IMG لتحور الجينات Insertionally)، نسخة الانصهار بين 5 &#39;من محضر IMG الذاتية وGAL4-VP16 يرصد ويترجم إلى انصهار بروتين تحتوي على N-محطة من البروتين المشفرة بواسطة وIMG GAL4-VP16. هذا البروتين الانصهار بربط UAS 14X وينشط النسخ من EGFP. الثانية، الحدث اقل من المرغوب فيه هو فخ محسن (الشكل 1D): المروج الحد الأدنى من أمام EGFP يقع تحت سيطرة محسن بالقرب من موقع التكامل، مما يؤدي إلى إنتاج EGFP في أساسهاالعمالي الإنتاج GAL4-VP16. في تقديرنا، 30-50٪ من الأحداث التعبير EGFP هي نتيجة لاعتراض محسن وترجع إلى فخ الجين 23٪ 50-70 (Balciuniene آخرون قيد الإعداد). للتمييز بين هاتين الفئتين من الأحداث، حققنا 14xUAS: mRFP خط المعدلة وراثيا (الشكل 1B)، للراحة تميزت عدسة محددة γCry: (. Balciuniene آخرون قيد الإعداد) GFP. يتم التحقق من الأحداث فخ الجين عن طريق المشاركة في التعبير عن GFP وطلب تقديم العروض (قارن C و D في الشكل 2). في الشاشة التجريبية لدينا، ونحن تعافى أكثر من 40 فخ الجين الأحداث بعد فحص 270 الأسماك F0 حقن بمزيج من الحمض النووي ينقول وtransposase مرنا. حدثت اثنين من الجينات لدينا فخ التكامل في الجينات مع سبق نشرها المسوخ التي يسببها كيميائيا: جبهة الخلاص الوطني وطنين خط المجال المغنطيسي. الظواهر لدينا المسوخ إقحامي tpl6 جبهة الخلاص الوطني وFLR tpl24 لا يمكن تمييزها بشكل سطحي من النمط الظاهريق من المقابلة المسوخ التي يسببها كيميائيا. لاحظنا أيضا أن أحداث فخ الجينات تظهر منحازة نحو الإنترونات قرب نهاية 5 &#39;من الجينات، وبالتالي زيادة احتمال الأليلات فارغة. نفعل مراقبة درجة معينة من UAS إسكات (تلون) في كل من خطوط فخ الجينات، وبعض مواضع من الواضح أكثر عرضة للتلون من غيرها. نحن لا نعتقد أن UAS إسكات مشكلة كبيرة لانتشار خطوط فخ الجين، كما كنا قادرين على نشر بسهولة كل من خطوط فخ الجينات من خلال خمسة أجيال على الأقل عن طريق اختيار لGFP التعبير وحدها.

<table border="1">
<tbody>
 <tr>
 <td>Name of the Reagent/Material</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalog #</td>
 <td>Comments</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Miniprep Kit</td>
 <td>Qiagen</td>
 <td>27104</td>
 <td>Optional PB wash step is a must</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>XbaI restriction enzyme</td>
 <td>ThermoFisher</td>
 <td>ER0681</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>mMessage Machine T3</td>
 <td>Ambion</td>
 <td>AM1348</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>RiboLock RNase Inhibitor</td>
 <td>ThermoFisher</td>
 <td>EO0381</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>RNeasy MinElute</td>
 <td>Qiagen</td>
 <td>74204</td>
 <td>Can be replaced by phenol extraction 			and precipitation. Do not use LiCl!</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Nuclease-free water</td>
 <td>Ambion</td>
 <td>AM9937</td>
 <td>Has to be non-DEPC treated</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Borosilicate glass capiliaries for 			microinjection needles</td>
 <td>World Precision Instruments</td>
 <td>1B100F-4</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Microcapiliaries for calibration</td>
 <td>Drummond Scientific </td>
 <td>1-000-0010</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Microloader tips</td>
 <td>Eppendorf</td>
 <td>5242 956.003</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Needle puller *</td>
 <td>Sutter Instruments</td>
 <td>P-87</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Stereomicroscope 			for microinjection * </td>
 <td>Nikon </td>
 <td>SMZ1500</td>
 <td>We also use Wild 5M and Olympus SZ61 			with transmitted light stand</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Picoinjector *</td>
 <td>Harvard Instruments</td>
 <td>Pli-90</td>
 <td>We also use Pli-100</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Screening microscope with GFP/RFP 			fluorescence *</td>
 <td>Zeiss</td>
 <td>Zeiss AxioImager</td>
 <td>5X Fluar objective has sufficient 			working distance</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Screening microscope with GFP/RFP 			fluorescence *</td>
 <td>Nikon </td>
 <td>SMZ1500</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>* We suggest this equipment only because we successfully use it in our laboratory. In each category, several comparable options from multiple manufacturers are available.</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

gene trapping using gal4 in zebrafish

كبير حجم مخلب والتنمية الخارجية الأجنة الزرد شفافة بصريا جعل نظام نموذج الفقاريات استثنائية لفي الجسم الحي باستخدام الطفرات إقحامي للصحفيين الفلورسنت لعلامة التعبير عن الجينات المتحولة. وقد شيدت العديد من المختبرات واختبار ناقلات محسن والجينات فخ في الزرد، وذلك باستخدام البروتينات الفلورية، تفعيل النسخي مقرها LEXA-GAL4 وكما صحفيين 1-7. كان لهذه النواقل اثنين من السلبيات المحتملة: التشدد الأمثل (مثل عدم القدرة على التفريق بين الأحداث محسن والجينات فخ) وطفرات منخفضة (مثل التكامل في الجينات نادرا ما تنتج الأليلات فارغة). وقد وضعت الجينات يكسر ينقول (GBTs) لمعالجة هذه العيوب 8-10. قمنا بتعديل واحدة من ناقلات GBT الأولى، GBT-R15، للاستخدام مع GAL4-VP16 كما مراسل الأولية فخ الجينات وUAS وأضاف: كما EGFP مراسل الثانوية للكشف المباشر للأحداث فخ الجينات. Application من GAL4-VP16 كما مراسل فخ الجين الأساسي يوفر ميزتين الرئيسية. أولا، لأنه يزيد الحساسية للجينات التي أعرب عنها في مستويات التعبير المنخفض. الثاني، فإنه تمكن الباحثون لاستخدام خطوط فخ الجين كسائقين GAL4 إلى التعبير المباشر عن الجينات المحورة أخرى في أنسجة محددة للغاية. وهذا هو ذات الصلة وخاصة بالنسبة للجينات مع وظائف غير الضرورية أو الزائدة عن الحاجة، حيث قد لا يؤدي فخ الجين التكامل في الظواهر العلني. وسيئات استخدام GAL4-VP16 كما مراسل فخ الجين الأساسي هو أن الجينات الترميز للبروتينات مع تسلسل إشارة N-محطة ليست قابلة للمحاصرة، وكذلك الناتجة GAL4-VP16 البروتينات الانصهار غير المرجح أن تكون قادرة على الدخول نواة وتفعيل النسخ. الأهم من ذلك، استخدام GAL4-VP16 لا قبل تحديد البروتينات النووية: نحن تعافى الجينات طفرات في الجينات فخ ترميز البروتينات التي تعمل في النواة، السيتوبلازم والغشاء البلازمي.

في حقن ناجحة، لا يقل عن 80٪ من الأجنة حقن فخ الجين DNA / Tol2 transposase المزيج مرنا عرض بعض درجة من GFP مضان (الشكل 3). عندما يتم اختيار ألمع GFP إيجابية الأجنة (الشكل 3C) لإقامة تجمع F0، حوالي واحد في 10 فحص الأسماك F0 سوف تسفر الجين فخ ذرية. بين الأسماك F0 التي يتم استردادها الأحداث فخ الجينات، معظم يحيل فخ الجين حدث واحد، بالإضافة إلى العديد من غير معربا-التكامل ينقول. ومع ذلك، وضعنا ما يصل إلى أربعة خطوط فخ الجينات من فرد واحد F0. GFP / RFP أنماط التعبير في خطوط فخ الجينات تتراوح من غاية محددة الأنسجة (على سبيل المثال في بصيلات الشم) إلى كل مكان إلى حد ما. <img alt="الشكل 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50113/50113fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50113/50113fig1.jpg" /> الشكل 1. Tانه GAL4 التي تحتوي على الجين فخ ثنائية ناقلات GBT B1 وتطبيقاتها. A. مكونات GAL4 التي تحتوي على الجين ناقلات فخ: Tol2 5 &#39;وTol2 3&#39;، والحد الأدنى Tol2 ينقول ينتهي 13؛ كالة الفضاء الكندية، شبوط β-أكتين لصق متقبل 8؛ ^ GAL4-VP16، AUG-أقل GAL4-VP16؛ ZP ( A)، β-أكتين الزرد 3 &#39;UTR وبولي (A) عناصر من GBT-R15 9،10. 14XUAS، EGFP وSV40 ص (A) هي مكونات UAS: EGFP التعبير كاسيت 17،18. السهم يشير تفعيل UAS: EGFP بواسطة GAL4-VP16 التي تنتجها الجينات فخ باء 14XUAS: mRFP التحوير تميزت γCry عدسة محددة: الكاسيت GFP. السهم يشير تفعيل UAS: mRFP بواسطة GAL4-VP16 في فخ الحدث عبر C. الجينات. صناديق الزرقاء هي الإكسونات. يشار إلى الربط عن طريق خط متقطع. فخ الحدث D. محسن. التكامل بين ناقلات قرب محسن (مربع البني) قد وضع الحد الأدنى EGFP المروج تحت سيطرة هذا محسن (السهم البني<html> ). هذا من شأنه أن يؤدي إلى التعبير الأنسجة محددة من EGFP، ولكن لأنه لا يتم GAL4-VP16، لن يتم تفعيلها mRFP التعبير. <img alt="الرقم 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50113/50113fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50113/50113fig2.jpg" /> الشكل 2. الارتداد من الأحداث فخ باستخدام الجينات لجنة المساواة العرقية recombinase. A، B. رسم توضيحي لطفرة الجين فخ (A) وعادت لجنة المساواة العرقية فخ الجين أليل (B). C، D. المشارك التعبير عن GFP (C) وطلب تقديم العروض (D) في الجهاز العصبي من الجين tpl6 جبهة الخلاص الوطني مصيدة الخط. E، F. حقن الحمض النووي الريبي لجنة المساواة العرقية في الأجنة tpl6 جبهة الخلاص الوطني يؤدي إلى فقدان GFP (E) وطلب تقديم العروض (F) التعبير. لاحظ أنه لا يوجد أي تخفيض GFP التعبير في العدسة، كما هو متوقع. r.within صفحة = &quot;دائما&quot;&gt; <img alt="الرقم 3" src="/files/ftp_upload/50113/50113fig3.jpg" /> الرقم 3. حقن الأجنة مع GBT-B1 (pDB783) فخ الجينات. . حقن A. الأجنة مع pGBT-B1 (pDB783) وحدها العرض قليلا مضان GFP في الجسم B، C. حقن الأجنة مع pGBT-B1 وTol2 transposase مرنا: مجموعة عشوائية من الأجنة (B) وexpressors عالية اختيارها لتربية (C). <img alt="الرقم 4" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50113/50113fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50113/50113fig4.jpg" /> الشكل 4. مخطط تجريبي لإنشاء خطوط GAL4 فخ الجينات. هياكل أحمر / أخضر متداخلة جزئيا تشير شارك التعبير عن GFP من وكراسة الشروط، في حين الخضراء وحدها تشير الاصباغ لفخ الجينات أو فخ محسن الأحداث.

Watch this Scientific Journal Video about Gene Trapping Using Gal4 in Zebrafish at JoVE.com

Gene Trapping Using Gal4 in Zebrafish

يصف هذا البروتوكول طريقة فخ الجين إقحامي الطفرات باستخدام GAL4-VP16 كما مراسل الابتدائية وGFP / RFP كما صحفيين الثانوية في الزرد. حوالي واحد من كل عشرة عالية، معربا عن F0 محصول الأسماك الجين فخ ذرية المشترك، معربا عن GFP وطلب تقديم العروض. إجراءات الفحص يمكن زيادتها بسهولة للتكيف مع حجم المختبر أداء الشاشة الطفرات إقحامي.

الجينات الاصطياد عن طريق GAL4 في الزرد

Large clutch size and external development of optically transparent embryos make zebrafish an exceptional vertebrate model system for in vivo insertional ...

Research

JoVE Journal

Biology

18.1K Views.  Temple University.  يصف هذا البروتوكول طريقة فخ الجين إقحامي الطفرات باستخدام GAL4-VP16 كما مراسل الابتدائية وGFP / RFP كما صحفيين الثانوية في الزرد. حوالي واحد من كل عشرة عالية، معربا عن F0 محصول الأسماك الجين فخ ذرية المشترك، معربا عن GFP وطلب تقديم العروض. إجراءات ال?...

Video: Gene Trapping Using Gal4 in Zebrafish

Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function

One of the advantages of studying zebrafish is the ease and speed of manipulating protein levels in the embryo.  Morpholinos, which are synthetic oligonucleotides with antisense complementarity to target RNAs, can be added to the embryo to reduce the expression of a particular gene product.  Conversely, processed mRNA can be added to the embryo to increase levels of a gene product.  The vehicle for adding either mRNA or morpholino to an embryo is microinjection.  Microinjection is efficient and rapid, allowing for the injection of hundreds of embryos per hour.  This video shows all the steps involved in microinjection.  Briefly, eggs are collected immediately after being laid and lined up against a microscope slide in a Petri dish.  Next, a fine-tipped needle loaded with injection material is connected to a microinjector and an air source, and the microinjector controls are adjusted to produce a desirable injection volume.  Finally, the needle is plunged into the embryo's yolk and the morpholino or mRNA is expelled.

This video shows how morpholino or mRNA can be injected into zebrafish embryos at the one-cell stage to decrease or increase the level of specific gene products during subsequent development.

Microinjection الجنين اسماك الزرد إلى تحليل وظائف الجينات

One of the advantages of studying zebrafish is the ease and speed of manipulating protein levels in the embryo.  Morpholinos, which are synthetic ...

Global Gene Expression Analysis Using a Zebrafish Oligonucleotide Microarray Platform

Gene microarray technology permits quantitative measurement and gene expression profiling of transcript levels on a genome-wide basis. Gene microarray technology is used in numerous biological disciplines in a variety of applications including global gene expression analysis in relation to developmental stage, to a disease state, and in toxic responses. Herein, we include a demonstration of global gene expression analysis using a comprehensive zebrafish-specific oligonucleotide microarray platform. The zebrafish expression microarray platform contains 385,000 probes, 60 base pairs in length, interrogating 37,157 targets with up to 12 probes per target. For this platform, all cDNA and genomic information available for the zebrafish was collected from various genomic databases including Ensembl (http://www.ensembl.org), VEGA (http://vega.sanger.ac.uk), UCSC (http://genome.ucsc.edu), and ZFIN (http://www.zfin.org). As a result this expression array provides complete coverage of the current zebrafish transcriptome. The zebrafish expression microarray was printed by Roche NimbleGen (Madison, WI). This technical demonstration includes the fluorescent labeling of a cDNA product, hybridization of the labeled cDNA product to the microarray platform, and array scanning for signal acquisition using the one color analysis strategy.  

Gene microarrays are powerful tools in gene expression profiling at a genome-wide level. This technology has application in a variety of biological disciplines including developmental biology and toxicology. In this video, we detail a protocol for global gene expression analysis using a comprehensive oligonucleotide microarray platform for the zebrafish.

تحليل التعبير الجيني العالمي باستخدام ميكروأري قليل النوكليوتيد منهاج اسماك الزرد

Gene microarray technology permits quantitative measurement and gene expression profiling of transcript levels on a genome-wide basis. Gene microarray ...

Using the Gene Pulser MXcell Electroporation System to Transfect Primary Cells with High Efficiency

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell electroporation system and Gene Pulser electroporation buffer (Bio-Rad) were specifically developed to easily transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells. We will demonstrate how to perform a simple experiment to quickly identify the best electroporation conditions. We will demonstrate how to run several samples through a range of electroporation conditions so that an experiment can be conducted at the same time as optimization is performed. We will also show how optimal conditions identified using 96-well electroporation plates can be used with standard electroporation cuvettes, facilitating the switch from electroporation plates to electroporation cuvettes while maintaining the same electroporation efficiency. In the video, we will also discuss some of the key factors that can lead to the success or failure of electroporation experiments.

This procedure shows how to use the Gene Pulser MXcell electroporation system to rapidly and easily identify the best electroporation conditions for mouse embryonic fibroblasts (MEFs) or other primary cells. Considerations for troubleshooting are also discussed in the associated video.

باستخدام الجينات Electroporation MXcell بولسير النظام لTransfect الخلايا الأولية ذات الكفاءة العالية

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

Using an Automated Cell Counter to Simplify Gene Expression Studies: siRNA Knockdown of IL-4 Dependent Gene Expression in Namalwa Cells

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only to study the effects of downregulating single genes, but also to interrogate signaling pathways and other complex interaction networks.  These pathway analyses require both the use of relevant cellular models and methods that cause less perturbation to the cellular physiology.  Electroporation is increasingly being used as an effective way to introduce siRNA and other nucleic acids into difficult to transfect cell lines and primary cells without altering the signaling pathway under investigation. There are multiple critical steps to a successful siRNA experiment, and there are ways to simplify the work while improving the data quality at several experimental stages.  To help you get started with your siRNA mediated gene knockdown project, we will demonstrate how to perform a pathway study complete from collecting and counting the cells prior to electroporation through post transfection real-time PCR gene expression analysis.  The following study investigates the role of the transcriptional activator STAT6 in IL-4 dependent gene expression of CCL17 in a Burkitt lymphoma cell line (Namalwa).  The techniques demonstrated are useful for a wide range of siRNA-based experiments on both adherent and suspension cells.  We will also show how to streamline cell counting with the TC10 automated cell counter, how to electroporate multiple samples simultaneously using the MXcell electroporation system, and how to simultaneously assess RNA quality and quantity with the Experion automated electrophoresis system.

This procedure describes a quick and easy workflow to introduce siRNA into difficult to transfect cell lines and follow gene expression by real-time PCR. Use of an automated cell counter, multi-well electroporation plate, and automated electrophoresis station provide quick and reliable results without the need for expensive robotic handling.

باستخدام خلية مكافحة الآلي لتبسيط دراسات التعبير الجيني : ضربة قاضية سيرنا من IL - 4 التعبير الجيني في الخلايا التابعة Namalwa

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only ...

Induction and Testing of Hypoxia in Cell Culture

Hypoxia is defined as the reduction or lack of oxygen in organs, tissues, or cells. This decrease of oxygen tension can be due to a reduced supply in oxygen (causes include insufficient blood vessel network, defective blood vessel, and anemia) or to an increased consumption of oxygen relative to the supply (caused by a sudden higher cell proliferation rate). Hypoxia can be physiologic or pathologic such as in solid cancers 1-3, rheumatoid arthritis, atherosclerosis etc&#x2026; Each tissues and cells have a different ability to adapt to this new condition. During hypoxia, hypoxia inducible factor alpha (HIF) is stabilized and regulates various genes such as those involved in angiogenesis or transport of oxygen 4. The stabilization of this protein is a hallmark of hypoxia, therefore detecting HIF is routinely used to screen for hypoxia 5-7. 
In this article, we propose two simple methods to induce hypoxia in mammalian cell cultures and simple tests to evaluate the hypoxic status of these cells.

Here we propose simple methods to induce hypoxia in cell cultures and simple tests to evaluate the hypoxic status of the cultures.

التعريفي واختبار نقص الأكسجة في الثقافة خلية

Hypoxia is defined as the reduction or lack of oxygen in organs, tissues, or cells.  This decrease of oxygen tension can be due to a reduced supply in ...

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina

Many devastating inherited eye diseases result in progressive and irreversible blindness because humans cannot regenerate dying or diseased retinal neurons. In contrast, the adult zebrafish retina possesses the robust ability to spontaneously regenerate any neuronal class that is lost in a variety of different retinal damage models, including retinal puncture, chemical ablation, concentrated high temperature, and intense light treatment 1-8. Our lab extensively characterized regeneration of photoreceptors following constant intense light treatment and inner retinal neurons after intravitreal ouabain injection 2, 5, 9. In all cases, resident M&uuml;ller glia re-enter the cell cycle to produce neuronal progenitors, which continue to proliferate and migrate to the proper retinal layer, where they differentiate into the deficient neurons. 
	We characterized five different stages during regeneration of the light-damaged retina that were highlighted by specific cellular responses. We identified several differentially expressed genes at each stage of retinal regeneration by mRNA microarray analysis 10. Many of these genes are also critical for ocular development. To test the role of each candidate gene/protein during retinal regeneration, we needed to develop a method to conditionally limit the expression of a candidate protein only at times during regeneration of the adult retina. 
	Morpholino oligos are widely used to study loss of function of specific proteins during the development of zebrafish, Xenopus, chick, mouse, and tumors in human xenografts 11-14. These modified oligos basepair with complementary RNA sequence to either block the splicing or translation of the target RNA. Morpholinos are stable in the cell and can eliminate or "knockdown" protein expression for three to five days 12. 
	Here, we describe a method to efficiently knockdown target protein expression in the adult zebrafish retina. This method employs lissamine-tagged antisense morpholinos that are injected into the vitreous of the adult zebrafish eye. Using electrode forceps, the morpholino is then electroporated into all the cell types of the dorsal and central retina. Lissamine provides the charge on the morpholino for electroporation and can be visualized to assess the presence of the morpholino in the retinal cells. 
	Conditional knockdown in the retina can be used to examine the role of specific proteins at different times during regeneration. Additionally, this approach can be used to study the role of specific proteins in the undamaged retina, in such processes as visual transduction and visual processing in second order neurons.

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina

A method to conditionally knockdown a target protein&#x2019;s expression in the adult zebrafish retina is described, which involves intravitreally injecting antisense morpholinos and electroporating them into the retina. The resulting protein is knocked down for several days, which allows testing the protein&#x2019;s role in the regenerating or intact retina.

في الجسم الحي من Electroporation Morpholinos في شبكية العين اسماك الزرد الكبار

Many devastating inherited eye diseases result in progressive and irreversible blindness because humans cannot regenerate dying or diseased retinal ...

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

The rate of translational elongation is non-uniform. mRNA secondary structure, codon usage and mRNA associated proteins may alter ribosome movement on the messagefor review see 1. However, it's now widely accepted that synonymous codon usage is the primary cause of non-uniform translational elongation rates1. Synonymous codons are not used with identical frequency. A bias exists in the use of synonymous codons with some codons used more frequently than others2. Codon bias is organism as well as tissue specific2,3. Moreover, frequency of codon usage is directly proportional to the concentrations of cognate tRNAs4. Thus, a frequently used codon will have higher multitude of corresponding tRNAs, which further implies that a frequent codon will be translated faster than an infrequent one. Thus, regions on mRNA enriched in rare codons (potential pause sites) will as a rule slow down ribosome movement on the message and cause accumulation of nascent peptides of the respective sizes5-8. These pause sites can have functional impact on the protein expression, mRNA stability and protein foldingfor review see 9. Indeed, it was shown that alleviation of such pause sites can alter ribosome movement on mRNA and subsequently may affect the efficiency of co-translational (in vivo) protein folding1,7,10,11. To understand the process of protein folding in vivo, in the cell, that is ultimately coupled to the process of protein synthesis it is essential to gain comprehensive insights into the impact of codon usage/tRNA content on the movement of ribosomes along mRNA during translational elongation.
Here we describe a simple technique that can be used to locate major translation pause sites for a given mRNA translated in various cell-free systems6-8. This procedure is based on isolation of nascent polypeptides accumulating on ribosomes during in vitro translation of a target mRNA. The rationale is that at low-frequency codons, the increase in the residence time of the ribosomes results in increased amounts of nascent peptides of the corresponding sizes. In vitro transcribed mRNA is used for in vitro translational reactions in the presence of radioactively labeled amino acids to allow the detection of the nascent chains. In order to isolate ribosome bound nascent polypeptide complexes the translation reaction is layered on top of 30% glycerol solution followed by centrifugation. Nascent polypeptides in polysomal pellet are further treated with ribonuclease A and resolved by SDS PAGE. This technique can be potentially used for any protein and allows analysis of ribosome movement along mRNA and the detection of the major pause sites. Additionally, this protocol can be adapted to study factors and conditions that can alter ribosome movement and thus potentially can also alter the function/conformation of the protein.

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

A technique to identify translational pause sites on mRNA is described. This procedure is based on isolation of nascent polypeptides accumulating on ribosomes during in vitro translation of a target mRNA, followed by the size analysis of the nascent chains using a denaturing gel electrophoresis.

عزلة البروتينية ريبوسوم الوليدة منضم<em&gt; في المختبر</em&gt; لتحديد المواقع وقفة بالحركة على طول مرنا

The rate of translational elongation is non-uniform. mRNA secondary structure, codon usage and mRNA associated proteins may alter ribosome movement on the ...

Using SecM Arrest Sequence as a Tool to Isolate Ribosome Bound Polypeptides

Extensive research has provided ample evidences suggesting that protein folding in the cell is a co-translational process1-5. However, the exact pathway that polypeptide chain follows during co-translational folding to achieve its functional form is still an enigma. In order to understand this process and to determine the exact conformation of the co-translational folding intermediates, it is essential to develop techniques that allow the isolation of RNCs carrying nascent chains of predetermined sizes to allow their further structural analysis.
SecM (secretion monitor) is a 170 amino acid E. coli protein that regulates expression of the downstream SecA (secretion driving) ATPase in the secM-secA operon6. Nakatogawa and Ito originally found that a 17 amino acid long sequence (150-FSTPVWISQAQGIRAGP-166) in the C-terminal region of the SecM protein is sufficient and necessary to cause stalling of SecM elongation at Gly165, thereby producing peptidyl-glycyl-tRNA stably bound to the ribosomal P-site7-9. More importantly, it was found that this 17 amino acid long sequence can be fused to the C-terminus of virtually any full-length and/or truncated protein thus allowing the production of RNCs carrying nascent chains of predetermined sizes7. Thus, when fused or inserted into the target protein, SecM stalling sequence produces arrest of the polypeptide chain elongation and generates stable RNCs both in vivo in E. coli cells and in vitro in a cell-free system. Sucrose gradient centrifugation is further utilized to isolate RNCs.
The isolated RNCs can be used to analyze structural and functional features of the co-translational folding intermediates. Recently, this technique has been successfully used to gain insights into the structure of several ribosome bound nascent chains10,11. Here we describe the isolation of bovine Gamma-B Crystallin RNCs fused to SecM and generated in an in vitro translation system.

We describe here a technique that is now routinely used to isolate stably bound ribosome nascent chain complexes (RNCs). This technique takes advantage of the discovery that a 17 amino acid long SecM "arrest sequence" can halt translation elongation in a prokaryotic (E. coli) system, when inserted into (or fused to the C-terminus) of virtually any protein.

باستخدام SecM تسلسل توقيف كأداة لعزل البروتينية منضم ريبوسوم

Extensive research has provided ample evidences suggesting that protein folding in the cell is a co-translational process1-5. However, the exact pathway ...

Gavaging Adult Zebrafish

The zebrafish has become an important in vivo model in biomedical research. Effective methods must be developed and utilized to deliver compounds or agents in solutions for scientific research. Current methods for administering compounds orally to adult zebrafish are inaccurate due to variability in voluntary consumption by the fish. A gavage procedure was developed to deliver precise quantities of infectious agents to zebrafish for study in biomedical research. Adult zebrafish over 6 months of age were anesthetized with 150 mg/L of buffered MS-222 and gavaged with 5 &mu;l of solution using flexible catheter implantation tubing attached to a cut 22-G needle tip. The flexible tubing was lowered into the oral cavity of the zebrafish until the tip of the tubing extended past the gills (approximately 1 cm). The solution was then injected slowly into the intestinal tract. This method was effective 88% of the time, with fish recovering uneventfully. This procedure is also efficient as one person can gavage 20-30 fish in one hour. This method can be used to precisely administer agents for infectious diseases studies, or studies of other compounds in adult zebrafish.

The increasing use of zebrafish as an animal model requires the development of effective methods for the delivery of known quantities of compounds and solutions. The gavage procedure described below allows for the oral delivery of precise volumes of solution reliably, safely and efficiently to adult zebrafish.

Gavaging اسماك الزرد الكبار

The zebrafish has become an important in vivo model in biomedical research. Effective methods must be developed and utilized to deliver compounds or ...

Rapid and Efficient Zebrafish Genotyping Using PCR with High-resolution Melt Analysis

Zebrafish is a powerful vertebrate model system for studying development, modeling disease, and performing drug screening. Recently a variety of genetic tools have been introduced, including multiple strategies for inducing mutations and generating transgenic lines. However, large-scale screening is limited by traditional genotyping methods, which are time-consuming and labor-intensive. Here we describe a technique to analyze zebrafish genotypes by PCR combined with high-resolution melting analysis (HRMA).&#160;This approach is rapid, sensitive, and inexpensive, with lower risk of contamination artifacts.&#160;Genotyping by PCR with HRMA can be used for embryos or adult fish, including in high-throughput screening protocols.

PCR combined with high-resolution melt analysis (HRMA) is demonstrated as a rapid and efficient method to genotype zebrafish.

سريعة وفعالة الزرد التنميط الجيني باستخدام PCR عالية الدقة مع تحليل نذوب

Zebrafish is a powerful vertebrate model system for studying development, modeling disease, and performing drug screening. Recently a variety of genetic ...